一、背景

神經(jīng)病理性疼痛是一種因神經(jīng)損傷或疾病導(dǎo)致軀體感覺(jué)傷害環(huán)路病理性興奮過(guò)度引起的慢性疼痛，并對(duì)生活質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響。目前神經(jīng)病理性疼痛的治療方案主要集中在癥狀抑制方面，由于對(duì)癥治療的低療效和不良反應(yīng)在臨床使用中受到限制。因此，目前疼痛研究的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是闡明神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制，并利用這些機(jī)制來(lái)制訂有效的鎮(zhèn)痛策略，以實(shí)現(xiàn)持久的疼痛治療。

盡管有多種病理誘因（如神經(jīng)損傷、糖尿病和化療藥物），但神經(jīng)病理性疼痛一般都是由脊髓背角突觸功能和結(jié)構(gòu)可塑性異常引起的中樞致敏而導(dǎo)致的痛覺(jué)超敏。神經(jīng)病理性疼痛的功能可塑性涉及脊髓背角神經(jīng)元突觸抑制的減弱和突觸興奮的增加。在結(jié)構(gòu)上，樹(shù)突棘（興奮性突觸的主要突觸后部位）大小和密度的增加，已在各種神經(jīng)性病理疼痛模型被報(bào)道，并解釋了神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)。然而，持續(xù)傷害性信號(hào)如何驅(qū)動(dòng)脊髓背角突觸可塑性的機(jī)制，以及在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)展過(guò)程中突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性如何協(xié)調(diào)的機(jī)制尚不清楚。

在神經(jīng)元中，Rho 家族GTP 酶1 (Rho-family small GTPase 1, Rac1) 通常促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合，從而驅(qū)動(dòng)樹(shù)突棘的形成、生長(zhǎng)和穩(wěn)定，而RhoA 誘導(dǎo)放線酶肌球蛋白收縮，導(dǎo)致樹(shù)突棘收縮和丟失。Rho GTP 酶通過(guò)在活性GTP 結(jié)合和非活性GDP 結(jié)合形式之間循環(huán)發(fā)揮作用，其激活狀態(tài)與下游信號(hào)傳導(dǎo)受到鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factors, GEFs，激活劑）和GTP 酶激活蛋白（GTPase activating proteins, GAPs，抑制劑）的嚴(yán)格控制。本文作者之前發(fā)現(xiàn)多功能的Rac1-GEF Tiam1 是海馬神經(jīng)元中Rac1 依賴性樹(shù)突棘和興奮性突觸發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Tiam1 被募集到活化的N-甲基-D-天冬氨酸型谷氨酸受體(N-methyl-D-aspartatetype glutamate receptors, NMDARs)，原肌球蛋白受體激酶B (tropomyosin receptor kinase B, TrkB) 和產(chǎn)生紅細(xì)胞生成素的肝細(xì)胞癌(erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma B, EphB)受體酪氨酸激酶上，在此Tiam1 誘導(dǎo)局部Rac1 激活和肌動(dòng)蛋白聚合，導(dǎo)致樹(shù)突棘重塑。值得注意的是，這三種突觸受體均在脊髓背角表達(dá)并與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生有關(guān)。此外，一項(xiàng)對(duì)1708 對(duì)同卵和異卵高加索雙胞胎的全表觀基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，Tiam1 與廣泛的慢性疼痛顯著相關(guān)。本文證據(jù)表明，Tiam1 通過(guò)重組肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和穩(wěn)定脊髓背角神經(jīng)元突觸NMDAR，從而調(diào)節(jié)持續(xù)傷害性活動(dòng)誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)和功能可塑性，這兩者共同支撐神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制。此外，本文作者開(kāi)發(fā)了一種針對(duì)脊髓Tiam1 的反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)，用于治療神經(jīng)病理性疼痛。

二、結(jié)果

1.神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生需要Tiam1 被激活

為了確定Tiam1 在神經(jīng)病理性疼痛中的作用，該研究首先建立了小鼠坐骨神經(jīng)分支選擇性結(jié)扎(spared nerve injury, SNI)模型，探究小鼠脊髓背角中的Tiam1 是否被激活。給予Rac1G15A 蛋白（一種無(wú)鳥(niǎo)嘌呤的Rac1 形式，可以與活化的GEF 結(jié)合）添加谷胱甘肽S 移換酶標(biāo)簽，隨后通過(guò)親和沉淀分離出與Rac1G15A 結(jié)合的蛋白，并檢測(cè)其中Tiam1 的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，造模3 周后SNI小鼠脊髓背角中，盡管總的Tiam1 表達(dá)量不變，但Rac1G15A 結(jié)合的Tiam1 顯著高于假手術(shù)組，據(jù)此可以證明神經(jīng)病理性疼痛小鼠的脊髓背角中Tiam1被激活。

接下來(lái)，培育了Tiam1 基因全身敲除小鼠以進(jìn)一步探究Tiam1 在神經(jīng)病理性疼痛中的功能。培育的Tiam1 基因敲除小鼠脊髓和背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion, DRG)中均未檢測(cè)到Tiam1 的表達(dá)，且神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育正常，可存活與生育，同時(shí)行為學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其與野生型小鼠在運(yùn)動(dòng)功能和疼痛敏感性（包括機(jī)械痛與熱痛）方面均無(wú)顯著性差異。對(duì)Tiam1 基因敲除小鼠和野生型小鼠進(jìn)行SNI手術(shù)，并進(jìn)行一系列的行為學(xué)測(cè)試發(fā)現(xiàn)，SNI 手術(shù)導(dǎo)致野生型小鼠對(duì)于非傷害性機(jī)械刺激（vonFrey 試驗(yàn)）、傷害性機(jī)械刺激（針刺試驗(yàn)）以及低溫刺激（丙酮蒸發(fā)試驗(yàn)）都變得更為敏感，而Tiam1 基因敲除小鼠在手術(shù)后對(duì)這些刺激的敏感性無(wú)顯著改變。為了避免反射性疼痛行為的干擾，設(shè)計(jì)并實(shí)施了機(jī)械性沖突避免試驗(yàn)(mechanical conflict-avoidance, MCA)來(lái)評(píng)估Tiam1 對(duì)于非反射性疼痛行為的影響。小鼠被安置在一個(gè)明亮的隔間中，并可以自由經(jīng)過(guò)一條設(shè)有傷害性探針的通道進(jìn)入另一個(gè)陰暗的隔間，對(duì)于機(jī)械性疼痛敏感的小鼠則需要更長(zhǎng)的潛伏期才會(huì)由其厭惡的明亮環(huán)境逃避到其喜好的陰暗環(huán)境。在進(jìn)行SNI 手術(shù)前，野生型小鼠和Tiam1 基因敲除小鼠的逃避潛伏期無(wú)顯著差異。但手術(shù)后野生型小鼠從明亮隔間的逃避潛伏期顯著增加，而Tiam1基因敲除小鼠的逃避潛伏期并無(wú)顯著改變，這表明Tiam1 基因的缺失也阻止了非反射性疼痛行為的發(fā)展。此外，在另一種周?chē)窠?jīng)損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛模型—坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷(chronic constriction injury, CCI)模型中也觀察到類(lèi)似的現(xiàn)象，即敲除Tiam1 基因可以阻止機(jī)械痛閾值和熱痛閾值的降低。這些數(shù)據(jù)表明，Tiam1 在周?chē)窠?jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病中起重要作用。

除了周?chē)窠?jīng)損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛外，在化學(xué)治療誘導(dǎo)的周?chē)窠?jīng)病變模型和鏈脲霉素(streptozotocin, STZ)誘導(dǎo)的糖尿病周?chē)窠?jīng)病變模型中再次驗(yàn)證了Tiam1 的作用，以證明Tiam1 的作用在不同類(lèi)型神經(jīng)病理性疼痛中的普適性。經(jīng)過(guò)紫杉醇（每日2 mg/kg 腹腔注射，連續(xù)5 天）或STZ（150 mg/kg 腹腔注射，單次給藥）處理的野生型小鼠對(duì)非傷害性的vonFrey 纖維刺激表現(xiàn)出明顯的超敏反應(yīng)，同時(shí)，增加了丙酮蒸發(fā)引起的抬爪次數(shù)和針刺刺激引起的縮爪持續(xù)時(shí)間。與前面的結(jié)論一致，在敲除Tiam1 后，紫杉醇或STZ 并未引起小鼠這些行為學(xué)指標(biāo)的改變，結(jié)果表明，Tiam1 也是化療或糖尿病引起的神經(jīng)病理性疼痛所必需的因素之一。

2.脊髓背角神經(jīng)元中表達(dá)的Tiam1 對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生至關(guān)重要，而不是DRG 和興奮性前腦神經(jīng)元

眾所周知，慢性神經(jīng)病理性疼痛是由外周、脊髓和腦傷害性感覺(jué)回路的不良變化介導(dǎo)的。該研究首先通過(guò)將Tiam1 基因敲除小鼠與Advillin-Cre 驅(qū)動(dòng)系小鼠雜交，從而特異性地敲除DRG 神經(jīng)元中的Tiam1 基因，并測(cè)試傷害感受器中Tiam1 的基因缺失是否會(huì)影響神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生。研究結(jié)果顯示，無(wú)論是SNI 手術(shù)，亦或是紫杉醇和STZ 處理的Advillin-Tiam1 條件性敲除小鼠，其機(jī)械性痛敏和溫覺(jué)痛敏反應(yīng)均與對(duì)照組無(wú)差異。這些數(shù)據(jù)表明，Tiam1 在DRG 神經(jīng)元中的表達(dá)對(duì)于慢性神經(jīng)病理性疼痛是非必要的。

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，Tiam1 可以調(diào)節(jié)海馬興奮性突觸發(fā)育和脊柱形態(tài)發(fā)育，接下來(lái)將Tiam1 基因敲除小鼠與CaMKIIa-Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，從而特異性地敲除前腦興奮性神經(jīng)元中的Tiam1 基因。與DRG神經(jīng)元條件性敲除Tiam1 的結(jié)果類(lèi)似，前腦興奮性神經(jīng)元條件性敲除Tiam1 并不會(huì)影響小鼠對(duì)機(jī)械痛與熱痛的敏感性。

最后，為了研究脊髓背角Tiam1 在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)展中的作用，向Tiam1 基因敲除小鼠脊髓背角顯微注射攜帶有Cre-GFP 的重組腺相關(guān)病毒(rAAV8-hSyn-Cre-GFP)，并添加神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子人突觸蛋白(hSyn) 以選擇性地調(diào)控神經(jīng)元中Tiam1 地表達(dá)。注射rAAV8-hSyn-Cre-GFP 導(dǎo)致脊髓背角Tiam1 水平降低約60%，且不影響小鼠基礎(chǔ)痛閾值。然而，在SNI 手術(shù)后，與對(duì)照組小鼠相比，脊髓背角Tiam1 缺失的小鼠在機(jī)械刺激和低溫刺激下出現(xiàn)的疼痛超敏反應(yīng)明顯減少。此外，脊髓背角神經(jīng)元中Tiam1 的缺失阻止了化療和糖尿病誘導(dǎo)的周?chē)窠?jīng)病變的發(fā)展。這些結(jié)果表明，Tiam1 在脊髓背角神經(jīng)元中的表達(dá)是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)展所必需的。

3.在興奮性神經(jīng)元而非抑制性神經(jīng)元中表達(dá)的Tiam1 是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)展所必需的

既往的研究表明，所有脊髓背角神經(jīng)元均表達(dá)囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(vesicular glutamate transporter,vGluT2)或囊泡γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體 (vesicular γ-aminobutyric acid transporter, vGat)，分別是谷氨酸能興奮性中間神經(jīng)元或GABA 能抑制性中間神經(jīng)元的標(biāo)記物。為了研究Tiam1 在哪些細(xì)胞類(lèi)型中起調(diào)節(jié)神經(jīng)病理性疼痛的作用，該研究分別通過(guò)將Tiam1 敲除小鼠與vGluT2-Cre 系小鼠或vGat-Cre 系小鼠雜交，從而選擇性地在興奮性或抑制性神經(jīng)元中刪除Tiam1。在反射性疼痛實(shí)驗(yàn)和非反射性疼痛實(shí)驗(yàn)中，SNI 均未引起vGluT2-Tiam1 條件性敲除小鼠的疼痛超敏反應(yīng)，但vGat-Tiam1 條件性敲除小鼠表現(xiàn)出了神經(jīng)病理性疼痛超敏反應(yīng)。這些數(shù)據(jù)表明，興奮性神經(jīng)元中的Tiam1 表達(dá)決定了神經(jīng)性疼痛的發(fā)展。

4.Tiam1 介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛的突觸結(jié)構(gòu)可塑性

該研究前面的研究結(jié)果表明，脊髓背角興奮性神經(jīng)元中的Tiam1 信號(hào)是發(fā)生神經(jīng)病理性疼痛所必需的，因此進(jìn)一步研究了Tiam1 促進(jìn)神經(jīng)病理性疼痛的潛在機(jī)制。Tiam1 通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)功能從而調(diào)節(jié)大腦發(fā)育過(guò)程中的樹(shù)突棘重塑。樹(shù)突棘通常存在于脊髓中間神經(jīng)元上，用來(lái)接收信號(hào)輸入，占興奮性突觸連接的90%以上。新的證據(jù)表明，脊髓損傷、周?chē)窠?jīng)損傷、糖尿病周?chē)窠?jīng)病變以及創(chuàng)傷性燒傷等因素引起的神經(jīng)病理性疼痛中的傷害性信號(hào)異常興奮都與脊髓背角神經(jīng)元樹(shù)突棘發(fā)育不良有關(guān)，于是接下來(lái)研究了Tiam1 是否在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展過(guò)程中調(diào)節(jié)樹(shù)突棘重塑。

為了可視化神經(jīng)元形態(tài)，在野生型和Tiam1敲除小鼠脊髓背角內(nèi)注射了表達(dá)GFP 的腺相關(guān)病毒(rAAV8-hSyn-GFP)以標(biāo)記神經(jīng)元。注射病毒2周后，對(duì)小鼠進(jìn)行假手術(shù)或SNI 手術(shù)，并在術(shù)后3周，對(duì)小鼠進(jìn)行灌注和切片。采用高分辨率共聚焦成像技術(shù)分析脊髓背角表達(dá)GFP 的廣動(dòng)力閾(wide dynamic range, WDR)神經(jīng)元上的樹(shù)突棘。與先前的研究結(jié)果一致，神經(jīng)損傷增加了野生型小鼠WDR神經(jīng)元上樹(shù)突棘的密度。肌動(dòng)蛋白聚合反應(yīng)是樹(shù)突棘重塑的驅(qū)動(dòng)力。肌動(dòng)蛋白以兩種形式存在：一種是單體球狀肌動(dòng)蛋白(G-actin)，另一種是聚合絲狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)。F-actin 與G-actin 的比值反映了肌動(dòng)蛋白聚合與解聚之間的平衡。在野生型小鼠中，SNI 手術(shù)增加了脊髓背角中F-actin 與G-actin 的比值，說(shuō)明其聚合能力增加，與神經(jīng)損傷誘導(dǎo)樹(shù)突狀脊棘的結(jié)論一致。

與野生型小鼠相比，Tiam1 敲除小鼠的神經(jīng)損傷沒(méi)有改變表達(dá)GFP 的WDR 神經(jīng)元上樹(shù)突棘的密度，也沒(méi)有改變脊髓背角中F-actin與G-actin的比值。同樣，Tiam1 缺失也減弱了紫杉醇和STZ 誘導(dǎo)的脊髓背角肌動(dòng)蛋白聚合現(xiàn)象。此外，與野生型的假手術(shù)小鼠相比，敲除Tiam1 的假手術(shù)小鼠脊髓背角神經(jīng)元的樹(shù)突棘密度略有降低。有文獻(xiàn)報(bào)道稱Tiam1是通過(guò)影響海馬樹(shù)突棘或突觸的發(fā)育從而發(fā)揮作用的，那是否有可能在脊髓中也是通過(guò)類(lèi)似的方式而非通過(guò)調(diào)控樹(shù)突棘重塑發(fā)揮作用的呢？為了解答這個(gè)問(wèn)題，該研究在成年小鼠中敲除或抑制Tiam1 表達(dá)觀察到的行為學(xué)數(shù)據(jù)與繁育的Tiam1 基因敲除小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)高度一致，因此可以排除Tiam1 對(duì)發(fā)育的影響涉及其在神經(jīng)病理性疼痛中的作用。這些結(jié)果表明，Tiam1 調(diào)節(jié)神經(jīng)病理性疼痛脊髓背角神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)的可塑性從而影響痛行為。

5.Tiam1 調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛中突觸功能的可塑性

突觸離子型谷氨酸受體NMDAR 介導(dǎo)的脊髓背角中樞致敏在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。由于Tiam1 的缺失減弱了神經(jīng)損傷引起的肌動(dòng)蛋白聚合，而肌動(dòng)蛋白聚合促進(jìn)了突觸NMDAR的活性，接下來(lái)研究了這些NMDAR 的變化是否與Tiam1 相關(guān)。與先前的報(bào)道一致，發(fā)現(xiàn)在野生型小鼠中，SNI 手術(shù)顯著增加了突觸中NMDAR 亞基GluN1 和GluN2B 的表達(dá)水平，而對(duì)其他離子型谷氨酸受體表達(dá)沒(méi)有影響。相比之下，神經(jīng)損傷并未改變Tiam1 敲除小鼠突觸中NMDAR 亞基的表達(dá)水平。電生理記錄顯示，SNI 顯著提高了野生型小鼠脊髓背角神經(jīng)元中NMDA 電流的振幅，而該現(xiàn)象在Tiam1 敲除小鼠中被消除。這些發(fā)現(xiàn)表明，Tiam1 對(duì)神經(jīng)病理性疼痛模型脊髓背角神經(jīng)元突觸中NMDAR 的活性增加至關(guān)重要。

6.Tiam1 介導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛依賴于Rac1

Tiam1 作為GEF 可以激活參與疼痛的小GTP酶 Rac1。為了確定Tiam1 介導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛是否依賴于Rac1 信號(hào)，在Tiam1 敲除小鼠脊髓背角內(nèi)注射腺病毒以表達(dá)一個(gè)可持續(xù)激活的Rac1 突變體。在接受SNI 手術(shù)的Tiam1 敲除小鼠的脊髓背角中，表達(dá)Rac1 突變體可以使小鼠重新表現(xiàn)出反射性與非反射性的超敏反應(yīng)。電生理記錄還顯示，在造模的Tiam1 敲除小鼠中，脊髓背角的Rac 突變體的表達(dá)恢復(fù)了被破壞的突觸NMDAR 活性。這些數(shù)據(jù)表明，Tiam1 介導(dǎo)的脊髓背角神經(jīng)病理性疼痛表型依賴于Rac1 的信號(hào)傳導(dǎo)。

7.Tiam1-Rac1 信號(hào)對(duì)于神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生、轉(zhuǎn)變和維持至關(guān)重要

盡管該研究已經(jīng)證實(shí)了Tiam1 介導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛依賴于Tiam1-Rac1 信號(hào)傳導(dǎo)，但Tiam1-Rac1 信號(hào)傳導(dǎo)在慢性神經(jīng)病理性疼痛不同階段的確切作用尚不清楚。為了直接評(píng)估Tiam1-Rac1 信號(hào)在神經(jīng)病理性疼痛起始階段中的作用，注射了可以防止Rac1 被Tiam1 激活的小分子抑制劑NSC23766（5 mg/kg 腹腔注射，連續(xù)4 天），并測(cè)試痛行為。結(jié)果表明，NSC23766 完全消除了SNI 引起的持續(xù)性機(jī)械性異常疼痛，表明Tiam1-Rac1 信號(hào)是神經(jīng)病理性疼痛起始階段所必需的。

SNI 模型中神經(jīng)病變引起的痛覺(jué)超敏反應(yīng)在周?chē)窠?jīng)損傷后的前3 天逐漸發(fā)展，3 周后完全建立為慢性疼痛狀態(tài)。接下來(lái)驗(yàn)證了神經(jīng)病理性疼痛的維持是否也需要Tiam1-Rac1 信號(hào)傳導(dǎo)。在神經(jīng)病理性疼痛的過(guò)渡期和維持期，即SNI 手術(shù)后3 天和3 周左右，分別用NSC23766 治療SNI 小鼠，并測(cè)量疼痛行為。結(jié)果表明，從SNI 后第4 天開(kāi)始連續(xù)注射N(xiāo)SC23766 共4 天可以阻止從急性神經(jīng)病理性疼痛向慢性神經(jīng)病理性疼痛的轉(zhuǎn)變，從SNI 后第22天開(kāi)始連續(xù)注射N(xiāo)SC23766 共4 天逆轉(zhuǎn)了已建立的神經(jīng)病理性疼痛。作為對(duì)照，NSC23766 并沒(méi)有影響假手術(shù)小鼠的疼痛行為。有報(bào)道稱NSC23766 介導(dǎo)的Rac1 抑制導(dǎo)致了肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)模型中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡，因此該研究測(cè)量了NSC23766治療小鼠脊髓前角中凋亡標(biāo)志物的活性，但并未發(fā)現(xiàn)其活性差異。同樣，也沒(méi)有在Tiam1 敲除小鼠中檢測(cè)到任何細(xì)胞死亡或運(yùn)動(dòng)缺陷的現(xiàn)象。但發(fā)現(xiàn)NSC23766 減弱了SNI 誘導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白聚合，逆轉(zhuǎn)了突觸中NMDAR 亞基GluN1 和GluN2B 表達(dá)水平的升高，并減小了脊髓背角NMDA電流的幅度。綜上所述，Tiam1-Rac1 信號(hào)通過(guò)調(diào)控突觸可塑性，對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的開(kāi)始、轉(zhuǎn)變和維持起重要作用。

8.靶向脊髓Tiam1 的反義寡核苷酸可以減輕神經(jīng)病理性疼痛

上述研究結(jié)果表明，Tiam1 是一個(gè)治療神經(jīng)病理性疼痛的潛在藥物靶點(diǎn)。反義寡核苷酸ASO 是一類(lèi)短的、合成的單鏈寡核苷酸，可以通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA 的加工或降解來(lái)改變靶蛋白的表達(dá)。為了確定是否可以通過(guò)局部敲低Tiam1 來(lái)治療神經(jīng)病理性疼痛，共設(shè)計(jì)了5 個(gè)針對(duì)大鼠Tiam1 mRNA 不同位點(diǎn)的ASOs，用來(lái)敲低大鼠Tiam1。由于大鼠體型較大，便于鞘內(nèi)注射，并且具有比小鼠更復(fù)雜的認(rèn)知能力和行為能力，因此后續(xù)采用了大鼠模型進(jìn)行Tiam1 ASOs 的功能驗(yàn)證。培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，并通過(guò)轉(zhuǎn)染Tiam1 ASOs 篩選出敲低效果最顯著的藥物—ASO-1，其蛋白水平降低了約75%。由于單次的中樞藥物注射已被證明可以長(zhǎng)時(shí)間影響脊髓的活動(dòng)，因此給予大鼠單次鞘內(nèi)注射ASO-1 或其對(duì)照藥物，以驗(yàn)證ASO-1 在體內(nèi)的抑制效果。在鞘內(nèi)注射100 mg ASO-1 2 周后，發(fā)現(xiàn)ASO-1 導(dǎo)致脊髓背角Tiam1 蛋白水平降低約50%。為了測(cè)試ASO-1治療是否減輕了大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型的超敏反應(yīng)，在SNI 手術(shù)后第3 周鞘內(nèi)注射ASO-1 或?qū)φ誂SO。對(duì)照ASO 不影響SNI 大鼠的機(jī)械痛閾值或熱痛閾值，而ASO-1 可以顯著減輕SNI 誘導(dǎo)的大鼠疼痛超敏反應(yīng)，且這種作用可以持續(xù)2 周。相比之下，ASO-1 和對(duì)照ASO 治療均未影響假手術(shù)大鼠的基礎(chǔ)痛閾值。這些數(shù)據(jù)表明，ASO 可以靶向脊髓Tiam1 從而減輕神經(jīng)病理性疼痛超敏反應(yīng)。

三、討論

Rac1-GEF Tiam1 是調(diào)節(jié)樹(shù)突棘和突觸發(fā)育的關(guān)鍵因子，其在腦發(fā)育期間將突觸NMDAR、TrkB和EphB 受體與海馬神經(jīng)元中的Rac1 活化和細(xì)胞骨架重構(gòu)相聯(lián)系。該研究發(fā)現(xiàn)Tiam1-Rac1 信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展和維持也是必不可少的，其通過(guò)脊髓背角中的興奮性神經(jīng)元的細(xì)胞骨架重構(gòu)和突觸NMDAR 穩(wěn)定化來(lái)協(xié)調(diào)突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性。此外，還發(fā)現(xiàn)針對(duì)脊髓Tiam1 應(yīng)用特異性的ASO 是一種可以有效緩解神經(jīng)病理性疼痛超敏反應(yīng)的策略。因此，該研究揭示了引發(fā)、傳遞和維持神經(jīng)病理性疼痛的病理生理機(jī)制，并確定了一個(gè)有希望治療神經(jīng)病理性疼痛的藥物靶點(diǎn)。

脊髓背角痛覺(jué)回路中的突觸可塑性異常是慢性疼痛發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制。痛覺(jué)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的功能改變伴隨著骨架重構(gòu)和突觸、細(xì)胞和回路的重組，這種結(jié)構(gòu)可塑性可能解釋了慢性疼痛的長(zhǎng)期性質(zhì)。特別是樹(shù)突棘重塑，提供了一種基于結(jié)構(gòu)的機(jī)制來(lái)解釋了突觸功能的長(zhǎng)期改變和維持。多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)樹(shù)突棘的形成和結(jié)構(gòu)，通常是通過(guò)調(diào)節(jié)潛在的細(xì)胞骨架重構(gòu)。在幾種神經(jīng)病理性疼痛的動(dòng)物模型中，已有研究報(bào)道淺層脊髓中樹(shù)突棘密度的增加是由Rac1 信號(hào)介導(dǎo)的。該研究發(fā)現(xiàn)，為了響應(yīng)各種形式的神經(jīng)損傷，Rac1-GEF Tiam1 信號(hào)誘導(dǎo)脊髓背角的肌動(dòng)蛋白聚合，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白相對(duì)于G-肌動(dòng)蛋白的比例增加，并驅(qū)動(dòng)樹(shù)突棘生長(zhǎng)。出乎意料的是，Tiam1 還控制突觸NMDAR 水平，但不控制TrkB 或EphB 受體，從而調(diào)節(jié)NMDAR 介導(dǎo)的突觸傳遞。鑒于肌動(dòng)蛋白除了調(diào)節(jié)樹(shù)突棘結(jié)構(gòu)之外還充當(dāng)突觸蛋白的支架，因此除了樹(shù)突棘形態(tài)發(fā)育之外，Tiam1 誘導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白聚合還可能促進(jìn)突觸NMDAR 活性和穩(wěn)定性。該研究確定了Tiam1 是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病過(guò)程中的重要參與者，其協(xié)調(diào)細(xì)胞骨架重構(gòu)動(dòng)力學(xué)、樹(shù)突棘形態(tài)發(fā)育和脊髓背角興奮性神經(jīng)元中響應(yīng)神經(jīng)損傷的突觸受體功能。

Tiam1 通過(guò)調(diào)節(jié)脊髓背角神經(jīng)元突觸，傳遞傷害性刺激信號(hào)，并引起神經(jīng)病理性疼痛超敏反應(yīng)。Tiam1 作為一種將突觸受體與Rac1 信號(hào)相偶聯(lián)的蛋白，在脊髓、發(fā)育中的腦和成人腦中都有高表達(dá)。在大腦發(fā)育過(guò)程中，Tiam1 被招募并激活突觸的NMDAR、TrkB 和EphB 受體，導(dǎo)致其磷酸化激活，使Tiam1 能夠誘導(dǎo)局部的Rac1 信號(hào)和細(xì)胞骨架重構(gòu)，從而驅(qū)動(dòng)樹(shù)突棘的發(fā)育。在神經(jīng)病理性疼痛的背景下，傷害性活動(dòng)激活突觸NMDAR、TrkB 和EphB 受體。在脊髓背角中，Tiam1 可能作為一個(gè)匯聚點(diǎn)整合多種信號(hào)輸入，通過(guò)激活這些下游的受體發(fā)揮作用，促進(jìn)脊髓背角神經(jīng)元中高Rac1 依賴性的突觸結(jié)構(gòu)和功能的可塑性異常，導(dǎo)致疼痛超敏和神經(jīng)病理性疼痛的長(zhǎng)期維持。這個(gè)過(guò)程中，除了TrkB 和EphB 受體偶聯(lián)的酪氨酸激酶上的酪氨酸被磷酸化之外，Tiam1 的絲氨酸和蘇氨酸也被磷酸化，并在谷氨酸刺激的NMDARs 引起Ca2+內(nèi)流后被激活。值得注意的是，Tiam1 最近被證明與CaMKIIα形成相互激活的信號(hào)復(fù)合體 (reciprocally activating signaling complex, RAKEC)，該復(fù)合體穩(wěn)定地激活CaMKIIα 和Rac1 并維持樹(shù)突棘形態(tài)的擴(kuò)大。Tiam1也可能在突觸可塑性的痛覺(jué)信號(hào)依賴性調(diào)節(jié)中起放大信號(hào)的作用。由于Tiam1 是一種酶，可能只需要少量的Tiam1 分子就可以激活多個(gè)Rac1 分子，這將導(dǎo)致細(xì)胞骨架重構(gòu)增強(qiáng)。由于Tiam1 同時(shí)控制樹(shù)突棘密度和突觸功能，它可能在協(xié)調(diào)依賴痛覺(jué)信號(hào)的突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性中起到關(guān)鍵作用。

該研究結(jié)果表明，Tiam1 介導(dǎo)了脊髓背角突觸的可塑性，這是神經(jīng)病理性疼痛的病理生理基礎(chǔ)，提示靶向Tiam1 可能是治療神經(jīng)病理性疼痛的有效策略。與晚期干預(yù)相比，早期干預(yù)在減少疼痛超敏方面產(chǎn)生了更持久、更有力的效果。這可能是因?yàn)樵谏窠?jīng)病理性疼痛發(fā)展的早期階段，痛覺(jué)信號(hào)激活了脊髓Tiam1，從而誘導(dǎo)下游信號(hào)通路促進(jìn)突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性，導(dǎo)致疼痛超敏。在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)展的后期，Tiam1 介導(dǎo)的突觸結(jié)構(gòu)和功能的可塑性異常已經(jīng)與疼痛超敏和持續(xù)性有關(guān)。因此，在早期治療中，減少疼痛超敏反應(yīng)只需預(yù)防Tiam1 誘導(dǎo)的突觸可塑性異常即可；而在后期治療中，減輕疼痛超敏反應(yīng)不僅需要阻止持續(xù)的痛覺(jué)信號(hào)引起的突觸可塑性異常，還需要逆轉(zhuǎn)已建立的突觸可塑性異常。

綜上所述，該研究的發(fā)現(xiàn)揭示了不同類(lèi)型神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生和維持的病理生理機(jī)制，并確定了一種新的治療靶點(diǎn)Tiam1，可能為臨床治療慢性神經(jīng)病理性疼痛帶來(lái)新的希望。