于進 沈瑤 劉楚玲 何正力 張袁松

(1. 西南大學醫(yī)院, 重慶 400716;2. 西南大學蠶桑紡織與生物質(zhì)科學學院, 重慶 400716)

從植物中提取的天然葉綠素在醫(yī)藥、食品、化妝品、著色劑等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用,但天然葉綠素不溶于水,穩(wěn)定性差,其應(yīng)用受到極大限制。天然葉綠素經(jīng)過置銅反應(yīng),將卟啉環(huán)中心的配位金屬離子置換為銅原子,葉綠素銅酸再經(jīng)過成鹽反應(yīng),生成的葉綠素銅鈉鹽則是一種高穩(wěn)定性的金屬卟啉,具有較高的生物活性,無毒副作用,對腫瘤具有直接或間接的抑制作用[1]。葉綠素銅鈉鹽是聯(lián)合國糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)和我國食品添加劑標準委員會批準使用的天然綠色素[2-4]。在養(yǎng)蠶業(yè)的大宗副產(chǎn)物蠶沙中,葉綠素的含量約為0.50%～1.79%,是提取葉綠素的重要原料之一[5]。早在20世紀80年代,華南農(nóng)業(yè)大學黃自然教授研究團隊就建立了利用蠶沙提取葉綠素銅鈉鹽的技術(shù)體系,并實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),產(chǎn)品已經(jīng)在醫(yī)藥、食品、保健品及化妝品中被廣泛地應(yīng)用[6]。

松針中的葉綠素含量較一般綠色植物高,是潛在的葉綠素產(chǎn)品原料來源。我國松樹資源分布廣泛,僅松針葉的蘊藏量就在1億t以上,而且松針是一種可再生的天然資源,因此,利用松針為原料制備葉綠素,開發(fā)前景看好[7-8]。我們用馬尾松的松針為原料提取葉綠素并制備成葉綠素銅鈉鹽,采用紫外吸收光譜法測試松針葉綠素銅鈉鹽的穩(wěn)定性,為其應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 原料及主要試劑和儀器

采集冬季馬尾松松針,攤開室內(nèi)自然晾干,60 ℃以下熱風風干至含水率在12%以下,切成3～5 cm的長段,粉碎后過篩(30目),放冰箱內(nèi)4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑:丙酮、乙醇、石油醚、NaOH、CuSO4、鹽酸,均為分析純。

主要儀器:HH-4恒溫水浴鍋(國華實驗儀器有限公司),JA2003A電子天平(Acculab),78-1磁力加熱攪拌器,Y802N型八籃恒溫烘箱(南通宏大實驗儀器有限公司),TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析),data color 110TM 分光測色儀(美國德塔)。

1.2 提取工藝基本流程

松針粉→加水潤濕軟化→浸提→過濾→皂化→石油醚萃取→酸化→銅代→過濾→析出葉綠素銅酸→成鹽→干燥。

1.3 葉綠素銅鈉鹽樣品的穩(wěn)定性測試方法

1.3.1 紫外光譜吸收曲線的測定

將按上述方法提取制得的葉綠素銅鈉鹽粗品加蒸餾水配成質(zhì)量分數(shù)為0.1%的溶液,以蒸餾水作參比,用雙光束紫外可見分光光度計在350～700 nm 波段掃描,測定其吸光度獲取吸收曲線[4]。

1.3.2 不同光照條件下的穩(wěn)定性測試

將質(zhì)量分數(shù)為0.1%的葉綠素銅鈉鹽溶液分3份(每份50 mL),分別置于直射光下、室內(nèi)自然光下及黑暗條件下處理,每天用雙光束紫外可見分光光度計測定403 nm處的吸光度,連續(xù)測試25 d。計算各處理樣品的葉綠素銅鈉鹽保存率:保存率= 末吸光值/ 初吸光值×100%。

1.3.3 不同pH條件下的穩(wěn)定性測試

取配好的質(zhì)量分數(shù)為0.1%的葉綠素銅鈉鹽溶液,分成7份(每份30 mL),用NaOH、HCl調(diào)節(jié)葉綠素銅鈉鹽溶液的pH值分別為2、4、6、7、8、10、12,在室溫下放置60 min,用紫外可見分光光度計測定不同pH的樣品溶液在403 nm處的吸光度。

1.3.4 不同溫度條件下的穩(wěn)定性測試

將提取的葉綠素銅鈉鹽樣品配制成質(zhì)量分數(shù)為0.1%、pH 值為7 的溶液,分成6份(每份30 mL),然后放在恒溫水浴鍋中分別經(jīng)20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃處理60 min,再冷卻至室溫,用雙光束紫外可見分光光度計測定其在403 nm處的吸光度(以蒸餾水作參比),并與加熱前進行比較,計算其保存率。

1.3.5 耐氧化性及耐還原性測試

分別配置質(zhì)量分數(shù)為5%的Na2SO3、H2O2溶液,各取2 mL分別加入已配好的30 mL 質(zhì)量分數(shù)為0.1%的葉綠素銅鈉鹽溶液中,在60 min內(nèi)觀察溶液顏色的變化,并以蒸餾水作比較,用雙光束紫外可見分光光度計測量2份處理樣品溶液在403 nm 處隨時間變化的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素銅鈉鹽的紫外吸收光譜

測定用松針制備葉綠素銅鈉鹽樣品的吸光度,得到的吸收曲線如圖1所示,其最大吸收波長為403 nm。與詹永樂[5]利用蠶沙制得的葉綠素鋅鈉鹽的吸收曲線比較,曲線最大吸收峰位置一致。

圖1 用松針提取葉綠素銅鈉鹽的紫外吸收光譜

2.2 葉綠素銅鈉鹽的穩(wěn)定性

2.2.1 光照對葉綠素銅鈉鹽穩(wěn)定性的影響

測定用松針制備的葉綠素銅鈉鹽在不同光照條件下的穩(wěn)定性,結(jié)果如圖2所示。在黑暗條件下放置的葉綠素銅鈉鹽其吸光度無大的變化,溶液的顏色仍保持透明的亮綠色;在室內(nèi)自然光和直射光照射條件下,葉綠素銅鈉鹽的吸光度明顯下降,溶液的顏色也變淺呈淺黃綠色。計算3組樣品放置25 d后的葉綠素銅鈉鹽保存率,黑暗組樣品為96.5%,室內(nèi)自然光組樣品為91.8%,直射光組樣品為72.9%。由此可見,光照對葉綠素銅鈉的穩(wěn)定性有很大的影響,產(chǎn)品在保存時建議避光存放。

圖2 不同光照條件下葉綠素銅鈉鹽的吸光度變化

2.2.2 pH對葉綠素銅鈉鹽穩(wěn)定性的影響

測定用松針制備的葉綠素銅鈉鹽在不同pH條件下的穩(wěn)定性,結(jié)果如圖3所示。葉綠素銅鈉鹽在pH 7～12 的范圍內(nèi)吸光值變化不大,說明在中性和堿性環(huán)境中葉綠素銅鈉鹽較穩(wěn)定;在pH<6 的酸性條件下,樣品的吸光值明顯較小,而且隨酸性的增強吸光值逐漸減小,當pH=2時,溶液顏色變成淺綠色并出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象。分析可能是由于在強酸性條件下,葉綠素銅鈉鹽變成葉綠素銅酸,由于葉綠素銅酸難溶于水,故使得溶液中出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象,溶液的顏色變淺。該結(jié)果說明強酸性環(huán)境中葉綠素銅鈉鹽不太穩(wěn)定,容易分解。

圖3 不同pH條件下葉綠素銅鈉鹽的吸光度變化

2.2.3 溫度對葉綠素銅鈉鹽穩(wěn)定性的影響

測定用松針制備的葉綠素銅鈉鹽在不同溫度條件下的穩(wěn)定性,結(jié)果如圖4所示。在溫度<80 ℃時,隨著溫度的升高,葉綠素銅鈉鹽溶液的吸光度變化不大,溶液顏色仍為綠色;當溫度上升至80～100 ℃之間,其吸光度明顯減少。據(jù)此建議葉綠素銅鈉鹽的儲存溫度最好控制在80 ℃以下。

圖4 不同溫度條件下葉綠素銅鈉鹽溶液的吸光度變化

2.2.4 葉綠素銅鈉鹽的耐氧化性及耐還原性

測定用松針制備葉綠素銅鈉鹽的耐氧化性和耐還原性,由圖5可知:隨著放置時間的延長,加入5% H2O2的葉綠素銅鈉鹽溶液的吸光度下降,顏色變?yōu)闇\綠色,且放置時間越長其樣品溶液的顏色越來越淺,最終接近無色;而加入5% Na2SO3的葉綠素銅鈉鹽溶液其吸光度基本上沒有變化,溶液顏色始終呈亮綠色。測試結(jié)果說明:氧化劑在短時間內(nèi)對葉綠素銅鈉鹽的影響不大,但長時間會產(chǎn)生很大的影響;而還原劑對葉綠素銅鈉鹽的影響不大。

圖5 加入氧化劑或還原劑后葉綠素銅鈉鹽的吸光度變化

3 小結(jié)

本試驗利用來源豐富的松針制備葉綠素銅鈉鹽,測試樣品的紫外光譜吸收曲線有2個吸收峰值,其最大峰值的吸收波長λ=403 nm。對制備的松針葉綠素銅鈉鹽溶液的穩(wěn)定性進行測試,結(jié)果提示:葉綠素銅鈉鹽對光照敏感,應(yīng)注意避光存放;葉綠素銅鈉在低于80 ℃的條件下穩(wěn)定,但溫度高于80 ℃時穩(wěn)定性明顯下降,其最佳保存溫度應(yīng)控制在80℃以下;氧化劑短時間內(nèi)對葉綠素銅鈉鹽穩(wěn)定性影響不大,但長時間會造成較大影響,而還原劑對松針葉綠素銅鈉鹽穩(wěn)定性影響很小,故在使用時應(yīng)盡量避免接觸氧化劑;葉綠素銅鈉鹽適合于在pH 6～12范圍內(nèi)的微酸、中性或堿性條件下使用。