劉雪冰 袁雨桐 張然 張基開(kāi)朗 劉春,2 程廷才,2

[1. 資源昆蟲(chóng)高效養(yǎng)殖與利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(西南大學(xué)), 重慶 400716;2. 重慶市蠶絲生物材料與再生醫(yī)學(xué)工程技術(shù)中心, 重慶 400716]

1972年,LINDSLEY等[1]在研究果蠅非整倍體對(duì)果蠅生長(zhǎng)發(fā)育的影響時(shí),發(fā)現(xiàn)位于果蠅基因組3號(hào)染色體上有1個(gè)三倍體致死或單倍體致死位點(diǎn),簡(jiǎn)稱(chēng)為T(mén)pl(Triplo-lethal Locus)。Tpl基因重復(fù)型雜合子和缺失型雜合子與野生型果蠅雜交的后代致死,表現(xiàn)為部分卵無(wú)法孵化或在1齡幼蟲(chóng)期死亡。致死胚胎或幼蟲(chóng)出現(xiàn)氣管破裂,中腸變成黃棕色,內(nèi)部器官退化等表型。直到2003年,科學(xué)家在Tpl位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了由20多個(gè)基因組成的基因簇,并將其命名Osiris基因,認(rèn)為這些表型可能是由Tpl位點(diǎn)的Osiris基因簇所致[2]。

在家蠶基因組中,胡文波等[3-4]研究發(fā)現(xiàn)了22個(gè)Osiris同源基因,其中有21個(gè)位于26號(hào)染色體,另1個(gè)位于4號(hào)染色體。使用SMART網(wǎng)站進(jìn)行在線(xiàn)預(yù)測(cè),家蠶Osiris基因家族蛋白中有20個(gè)含有典型的功能未知的DUF1676結(jié)構(gòu)域。此外,家蠶Osiris蛋白中還存在分泌信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域[5]。在線(xiàn)預(yù)測(cè)家蠶Osiris基因家族編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域,發(fā)現(xiàn)家蠶Osiris基因開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為723～882 bp,對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)分子量在26～31 kDa之間[6]。劉春等[7]對(duì)包括家蠶、黑脈金斑蝶、小菜蛾、紅帶袖蝶、蜜蜂和果蠅等多種昆蟲(chóng)的Osiris基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)Osi9亞家族基因成員之間的相似性約為60%,并且Osi9亞家族的多基因拷貝只存在于鱗翅目昆蟲(chóng)中。家蠶中部絲腺高量表達(dá)Sericin-1(Ser1)基因[8],而Osi9a基因呈現(xiàn)出與Ser1基因相似的表達(dá)譜。Osi9a在家蠶胚胎發(fā)育期4～7 d表達(dá),與家蠶胚胎絲腺的形成時(shí)間相一致。Osi9a蛋白也存在于除絲腺以外的繭殼中,并且在多種鱗翅目泌絲昆蟲(chóng)中都被檢測(cè)到。特別是在家蠶的繭殼中,Osi9a蛋白的豐度僅次于絲素和絲膠蛋白[9]。程廷才等[10]用在家蠶中過(guò)表達(dá)Osi9a蛋白的方式,發(fā)現(xiàn)Osi9a過(guò)表達(dá)使得繭絲的力學(xué)性能發(fā)生改變,繭絲彈性模量增強(qiáng),繭絲強(qiáng)度減弱,繭絲二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-折疊含量減少,結(jié)晶度下降。

已有研究表明Osiris基因可能參與到昆蟲(chóng)的防御系統(tǒng)中,在幾丁質(zhì)和角質(zhì)層的形成中起著重要作用[11-13],但具體的分子機(jī)制并不清楚。因此,本研究為了揭示BmOsi9a基因的生物學(xué)功能,通過(guò)在家蠶胚胎細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)和下調(diào)該基因的表達(dá),對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行初步探索,為進(jìn)一步揭示Osiris基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究使用的BmE細(xì)胞系為家蠶胚胎起源細(xì)胞系,由本實(shí)驗(yàn)室保存使用。大腸埃希菌T1購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BmE細(xì)胞RNA提取及RT-PCR和RT-qPCR

根據(jù)Triozl試劑盒實(shí)驗(yàn)方案提取家蠶胚胎細(xì)胞BmE細(xì)胞系的RNA,根據(jù)Promega公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(A5001)說(shuō)明書(shū)制備家蠶胚胎細(xì)胞BmE cDNA。同時(shí),利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)BmOsi9a基因的引物進(jìn)行擴(kuò)增,RT-PCR和RT-qPCR所使用的引物見(jiàn)表1。

表1 BmOsi9a的RT-PCR和RT-qPCR引物序列

RT-PCR反應(yīng)體系的總體積為10 μL,包括:2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL,10×PCR Buffer 1 μL,2 μmol/L正向引物/反向引物各1 μL,250 U r-Taq酶0.1 μL,Milli-Q水5.1 μL。反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性10 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸50 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min后16 ℃保存。

RT-qPCR實(shí)驗(yàn)采用Promega的熒光定量試劑盒進(jìn)行,以BmRpl3基因?yàn)閮?nèi)參(表1),20 μL的反應(yīng)體系中含SYBR染料10 μL、2 μmol/L正向引物/反向引物各2 μL、cDNA模板2 μL,Milli-Q水4 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 30 s; 95 ℃ 3 s,60 ℃ 30 s,95 ℃ 15 s,共40個(gè)循環(huán);60 ℃ 1 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s。利用2-△Ct法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 免疫熒光檢測(cè)

在可傳代的細(xì)胞上進(jìn)行目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。首先,將細(xì)胞均勻鋪于帶有爬片的24孔板中,培養(yǎng)48 h后,將培養(yǎng)基去除,用PBS進(jìn)行洗滌,棄PBS后加入4%多聚甲醛室溫固定15 min。隨后,在搖床上用1×PBS洗滌3次(每次5 min),洗滌完畢后加入1% Triton X-100室溫靜置打孔15 min,再次用1×PBS洗滌。配制封閉液,1 mL配制體系:羊血清100 μL,1×PBS 900 μL,并將其加入每個(gè)孔中(每個(gè)孔300 μL),在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中封閉1 h。按1∶200的比例配制一抗,標(biāo)記好屬源性之后直接加入孔中,在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1～1.5 h。隨后,回收一抗,進(jìn)行1～2次PBS清洗。接下來(lái)避光按1∶800的比例配制二抗,并在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h,隨后進(jìn)行1～2次PBS清洗,DAPI染色并進(jìn)行封片處理。如果共轉(zhuǎn)染2種質(zhì)粒,則先孵育1個(gè)抗體,然后再孵育另1個(gè)抗體,確保2個(gè)抗體具有不同的屬性,并且二抗的熒光顏色錯(cuò)開(kāi)。最后,使用共聚焦顯微鏡觀察[Olympus corporation(FV1000)]并拍攝圖像。

1.2.3BmOsi9a過(guò)表達(dá)載體及干涉載體構(gòu)建

(1)BmOsi9a過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建。根據(jù)家蠶BmOsi9a基因的ORF序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(表2),其中,正向引物5′端包含有BamHⅠ酶切位點(diǎn),反向引物包含有NotⅠ酶切位點(diǎn),并且在上游和下游引物中均添加入Myc標(biāo)簽。從5齡第3天幼蟲(chóng)的絲腺cDNA中擴(kuò)增回收目的片段并克隆至psL1180載體中。

表2 BmOsi9a細(xì)胞過(guò)表達(dá)檢測(cè)引物序列

(2)BmshOsi9a干擾載體構(gòu)建。設(shè)計(jì)的干擾載體序列(表3)由深圳華大基因股份有限公司合成。引物退火用超純水溶解使其總濃度為20 μmol/L。將20 μmol/L正向引物/反向引物各5 μL、10×Buffer M 5 μL、Milli-Q水 35 μL,按照上述反應(yīng)體系配制于1.5 mL離心管中,置于100 ℃水浴鍋中,關(guān)閉電源,自然降至室溫,隨后在4 ℃條件下保存。使用AgeⅠ、EcoRⅠ酶切pLKO.1載體,并將上述雙酶切產(chǎn)物與退火產(chǎn)物進(jìn)行連接,隨后轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌T1,挑選菌落,測(cè)序并保存陽(yáng)性質(zhì)粒。

表3 BmshOsi9a干擾載體鑒定引物序列

1.2.4 細(xì)胞復(fù)蘇及轉(zhuǎn)染

(1)細(xì)胞復(fù)蘇。從液氮中取出BmE細(xì)胞并迅速解凍于27 ℃,然后在超凈工作臺(tái)將其轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶并置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(27 ℃)中進(jìn)行培養(yǎng)。(2)細(xì)胞培養(yǎng)。BmE細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中以配制好的培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)基一般換3次左右細(xì)胞就能長(zhǎng)滿(mǎn),此時(shí)需要傳代,傳代步驟同細(xì)胞復(fù)蘇。(3)細(xì)胞轉(zhuǎn)染。首先,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)即準(zhǔn)備進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn):準(zhǔn)備2個(gè)10 mL的離心管,并向每個(gè)離心管中加入1.5 mL的無(wú)抗無(wú)血清的Grace培養(yǎng)基;接下來(lái),在一個(gè)離心管中添加轉(zhuǎn)染試劑(轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的比例為2∶1),在另一個(gè)離心管中分別加入質(zhì)粒,并靜置5 min;然后將2個(gè)離心管中的液體混合到一個(gè)離心管中,靜置20 min;接著,取出待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,棄掉舊的培養(yǎng)基,并將之前混合好的轉(zhuǎn)染試劑加入細(xì)胞中,輕輕混勻后將細(xì)胞置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(27 ℃)中培養(yǎng);經(jīng)過(guò)6～10 h培養(yǎng)便棄掉舊的培養(yǎng)基,加入有抗血清的Grace培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,使用熒光顯微鏡[ZEISS(3527001973)]觀察細(xì)胞并進(jìn)行拍照,對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 BrdU染色

將待處理的細(xì)胞收集并進(jìn)行血球板計(jì)數(shù)。將細(xì)胞用培養(yǎng)基稀釋至2 000個(gè)/mL,取500 μL細(xì)胞懸液加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,然后置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(27 ℃)中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,向每個(gè)孔中加入BrdU(終濃度為250 μmol/L),輕輕搖晃混勻,然后繼續(xù)在恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(27 ℃)中孵育4 h。棄掉培養(yǎng)基,使用1×PBS進(jìn)行1～3次洗滌。向每個(gè)孔中加入1 mL 4 %多聚甲醛,固定15 min,然后使用1×PBS進(jìn)行1～3次洗滌。向每個(gè)孔中加入500 μL 2 mol/L鹽酸,在37 ℃下孵育15 min,然后使用1×PBS洗滌3次。向每個(gè)孔中加入500 μL含有1% Triton X-100的PBS溶液,室溫下孵育15 min,然后使用1×PBS洗滌3次。根據(jù)說(shuō)明書(shū)配制Click反應(yīng)液(碧云天試劑盒C0071L),注意避光操作,并在室溫下避光孵育30 min。吸去孔板中的反應(yīng)液,使用1×PBS進(jìn)行洗滌,每次洗滌5 min。向每個(gè)孔中加入200 μL DAPI,室溫孵育15 min。棄掉DAPI染色液,使用PBS進(jìn)行1～2次洗滌。最后在熒光顯微鏡[ZEISS(3527001973)]下采集并保存數(shù)據(jù)。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

首先,待細(xì)胞密度達(dá)到70 %時(shí)棄掉舊的培養(yǎng)基,加入無(wú)抗無(wú)血清的Grace培養(yǎng)基,并使用巴氏吸管輕柔吹打細(xì)胞,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè)5 mL離心管中。將離心管以750×g的離心力在4 ℃溫度條件下離心5 min,棄掉上清液,然后用PBS洗滌細(xì)胞,并加入1 mL 75%乙醇,在4 ℃下固定至少24 h。再次以750×g的離心力,在4 ℃下離心3 min,棄掉上清液,使用含有RNase的1×PBS洗滌細(xì)胞2次。用檢測(cè)細(xì)胞周期試劑(按照1∶100體積比在含0.005 μg/ μL RNase的PBS中加入1 mg/mL碘化丙啶)重懸細(xì)胞,37 ℃室溫避光30 min。隨后,將上述細(xì)胞懸液放入流式細(xì)胞儀(Sparrow2040)進(jìn)行檢測(cè),最后使用FlowJo軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.7 Western blot檢測(cè)

(1)制膠后上樣:取適量蛋白質(zhì)樣品于1.5 mL離心管中,加入適量5×SDS-PAGE Loading Buffer調(diào)節(jié)終濃度為1×,混勻后經(jīng)95 ℃金屬浴孵育3～5 min使蛋白質(zhì)完全變性,瞬時(shí)離心后即可上樣,也可在-20 ℃條件下存放。(2)電泳:制備好的樣品每孔上樣10 μL,恒壓電泳,初始為80 V,當(dāng)樣品電泳至分離膠時(shí),轉(zhuǎn)至120 V電泳,直至溴酚藍(lán)染液到膠板底部停止電泳。(3)轉(zhuǎn)膜:將PVDF膜浸泡在99.5%甲醇中激活2 min,然后轉(zhuǎn)至純水中,待膜不再旋轉(zhuǎn)為止(轉(zhuǎn)膜條件:25 V,1.2 A,15～20 min)。(4)封閉:將膜轉(zhuǎn)至5%脫脂奶粉中,4 ℃過(guò)夜。(5)孵育一抗:用1%脫脂奶粉配制一抗溶液,一抗Ab-BmOsi9a稀釋比例為1∶10 000,將封閉好的PVDF膜完全浸泡于一抗中,37 ℃搖晃1 h。(6)洗膜后孵育二抗:用1%脫脂奶粉配制山羊抗兔二抗溶液,二抗稀釋比例為1∶20 000,將洗好的膜完全浸泡于二抗溶液中,37 ℃搖床輕搖2 h。(7)洗膜后曝光:將顯影液的A、B液按1∶1比例加入離心管中,顛倒混勻,均勻滴加在膜上,避光放置5 min,按照曝光儀操作說(shuō)明進(jìn)行曝光觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 BmOsi9a基因 mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達(dá)分析

為了確定BmOsi9a在家蠶胚胎細(xì)胞BmE的表達(dá)情況,采用RT-PCR、RT-qPCR和Western blot,從基因mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)水平進(jìn)行分析。結(jié)果表明:BmOsi9a基因在BmE細(xì)胞中有明顯的轉(zhuǎn)錄表達(dá)(圖 1-A、B),證實(shí)了BmOsi9a蛋白在BmE細(xì)胞中的存在(圖 1-C)。以上結(jié)果為進(jìn)一步的功能分析提供了依據(jù)。

(A) RT-PCR (B) RT-qPCR (C) Western blot圖1 BmOsi9a基因在BmE細(xì)胞中的表達(dá)分析

2.2 BmOsi9a蛋白的亞細(xì)胞定位

為了準(zhǔn)確確定BmOsi9a基因在家蠶胚胎細(xì)胞BmE中的表達(dá)定位情況,采用免疫熒光技術(shù),通過(guò)抗體來(lái)檢測(cè)和可視化BmOsi9a蛋白的位置,結(jié)果如圖2所示:BmOsi9a定位于細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)許多重要的生物過(guò)程和活動(dòng)發(fā)生的場(chǎng)所,包括信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)合成、代謝調(diào)控等。BmOsi9a在細(xì)胞質(zhì)中的定位提示其可能在調(diào)節(jié)這些生物過(guò)程中發(fā)揮著功能性的角色。

圖2 免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察BmOsi9a蛋白在BmE中的亞細(xì)胞定位

2.3 過(guò)表達(dá)BmOsi9a對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

為了探索BmOsi9a在BmE細(xì)胞中的功能,通過(guò)構(gòu)建BmOsi9a過(guò)表達(dá)載體(圖 3-A),使BmOsi9a基因成功在BmE細(xì)胞中過(guò)表達(dá)(圖 3-B),該基因的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平都已經(jīng)顯著上調(diào)。BrdU實(shí)驗(yàn)顯示BmE細(xì)胞的BrdU陽(yáng)性率無(wú)明顯變化,表明細(xì)胞的DNA合成能力無(wú)顯著變化,即過(guò)表達(dá)BmOsi9a并未對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生顯著影響(圖3-C)。

(A) 1180-BmOsi9a陽(yáng)性克隆的PCR檢測(cè)(B) 蛋白質(zhì)及mRNA水平檢測(cè)BmOsi9a上調(diào)表達(dá),“****”示P<0.000 1(C) BrdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上調(diào)BmOsi9a后對(duì)BmE細(xì)胞增殖無(wú)影響圖3 上調(diào)BmOsi9a表達(dá)對(duì)BmE細(xì)胞增殖的影響觀察

2.4 下調(diào)BmOsi9a對(duì)BmE細(xì)胞增殖能力的影響

通過(guò)構(gòu)建BmOsi9a細(xì)胞干涉載體,在BmE細(xì)胞中降低了BmOsi9a蛋白的表達(dá)水平(圖4-A)。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯的改變,血球計(jì)數(shù)板顯示的細(xì)胞數(shù)量也明顯減少,推測(cè)下調(diào)BmOsi9a抑制了細(xì)胞增殖。為了驗(yàn)證這一猜想,我們進(jìn)行了BrdU實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)下調(diào)BmOsi9a后,DNA復(fù)制的細(xì)胞數(shù)目顯著減少,細(xì)胞增殖受到抑制(圖4-B)。

(A) 蛋白質(zhì)及mRNA水平檢測(cè)BmOsi9a下調(diào)情況(B) BrdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)BmOsi9a后BmE細(xì)胞增殖受到抑制,“****”示P<0.000 1。圖4 下調(diào)BmOsi9a表達(dá)抑制BmE細(xì)胞增殖的觀察

2.5 下調(diào)BmOsi9a對(duì)BmE細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ),我們推測(cè)BmOsi9a可能誘導(dǎo)了細(xì)胞周期阻滯進(jìn)而影響了細(xì)胞增殖。為此,進(jìn)一步使用流式細(xì)胞技術(shù)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞周期是否發(fā)生改變,結(jié)果顯示:下調(diào)BmOsi9a后BmE細(xì)胞系的細(xì)胞周期發(fā)生了明顯的變化,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組處于G0期/G1期的細(xì)胞顯著增加,而處于S期的細(xì)胞則顯著減少(圖5-A),由此表明細(xì)胞周期被阻滯在G0期/G1期。為了更加明確地闡釋下調(diào)BmOsi9a對(duì)細(xì)胞周期的影響,通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)從分子水平檢測(cè)下調(diào)BmOsi9a對(duì)細(xì)胞周期蛋白的影響,結(jié)果表明:與G0期/G1期相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶CDK4、CDK2以及細(xì)胞周期蛋白CyclinE1的表達(dá)水平隨著B(niǎo)mOsi9a的下調(diào)也明顯降低(圖5-B)。

(A) 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)下調(diào)BmOsi9a后細(xì)胞周期受阻的情況(B) Western blot檢測(cè)下調(diào)BmOsi9a后細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平, “***”示P<0.001,“*”示P<0.05。圖5 下調(diào)BmOsi9a表達(dá)阻滯BmE細(xì)胞周期的檢測(cè)

3 討論

本研究采用多種技術(shù)手段,包括RT-PCR、RT-qPCR、Western blot、RNAi以及細(xì)胞周期分析等,對(duì)BmOsi9a的功能進(jìn)行了初步探索。研究結(jié)果表明,在BmE細(xì)胞中,BmOsi9a蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞質(zhì)中有許多其他細(xì)胞器和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)相互作用,因此BmOsi9a可能參與調(diào)節(jié)這些結(jié)構(gòu)和器官的功能。進(jìn)一步做細(xì)胞干涉實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),下調(diào)BmOsi9a后抑制BmE細(xì)胞增殖,并且將細(xì)胞周期阻滯在G0期/G1期。這些結(jié)果表明BmOsi9a在細(xì)胞分裂過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,并且對(duì)細(xì)胞增殖具有顯著的影響。

然而,在BmE中過(guò)表達(dá)BmOsi9a后,對(duì)細(xì)胞增殖卻無(wú)明顯影響,推測(cè)可能有如下原因:(1)BmE本身已經(jīng)處于高增殖狀態(tài),BmOsi9a表達(dá)量的增加對(duì)細(xì)胞的增殖就顯得微不足道;(2)基因劑量效應(yīng),過(guò)表達(dá)BmOsi9a基因后,可能由于基因的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)某些調(diào)節(jié)機(jī)制的負(fù)向反饋或抑制作用,使得細(xì)胞增殖沒(méi)有被促進(jìn);(3)調(diào)節(jié)基因的時(shí)機(jī)和空間表達(dá),BmOsi9a基因的調(diào)節(jié)可能在細(xì)胞生命周期的不同階段和細(xì)胞不同區(qū)域發(fā)揮作用,過(guò)表達(dá)BmOsi9a基因可能導(dǎo)致其在不適當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)或空間過(guò)量表達(dá),從而未能促進(jìn)細(xì)胞增殖。

未來(lái)可以進(jìn)一步探索BmOsi9a在細(xì)胞分裂調(diào)控中的作用機(jī)制,并且探究其與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的相互作用關(guān)系。此外,可以考慮研究其在其他昆蟲(chóng)中的作用,并且還可以結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)的方法,探究BmOsi9a對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)和分化等生物過(guò)程的調(diào)控機(jī)制,為深入闡釋其生物學(xué)功能提供更多的證據(jù)和基礎(chǔ)理論。