陳柳，倪征，劉可姝，葉偉成，華炯鋼，云濤，朱寅初，張存

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021)

干擾素(interferon，IFN)是細(xì)胞因子之一，具有免疫調(diào)節(jié)功能和廣譜抗病毒活性，參與機(jī)體天然抗病毒免疫。它是一種誘生蛋白，在正常細(xì)胞中其基因處于抑制狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到病毒、細(xì)菌感染和某些化合物質(zhì)等外界刺激激發(fā)后，干擾素基因會(huì)被激活而表達(dá)。根據(jù)其作用，干擾素分為Ⅰ型和Ⅱ型干擾素。Ⅰ型干擾素是IFN-α和IFN-β，抗病毒作用強(qiáng)。Ⅱ型主要是指IFN-γ，由活化的T細(xì)胞、NK細(xì)胞等產(chǎn)生。IFN-γ廣泛地參與調(diào)控天然和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。具有多種生物功能，包括抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等活性，促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化、促進(jìn)抗原的加工和遞呈，調(diào)控T細(xì)胞等生長(zhǎng)分化。與IFN-I相比，其免疫調(diào)節(jié)活性更為突出[1]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ在免疫調(diào)節(jié)異常導(dǎo)致的自身免疫性疾病中起著非常關(guān)鍵的作用；除了參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)外，還參與調(diào)控自噬的發(fā)生和造血干細(xì)胞的功能[2]。IFN具有較強(qiáng)的種屬特異性。目前，用于人、哺乳動(dòng)物和嚙齒類動(dòng)物的干擾素研究比較深入，且部分產(chǎn)品已在臨床上廣泛應(yīng)用。但由于禽類干擾素與其他種屬的同源性較低，適用于其他種屬，尤其是人類IFN的研究方法不太適合于禽類。因此，其研究相對(duì)滯后。迄今為止，鴨IFN-γ已被嘗試在多種表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)，如畢赤酵母[3]、昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)[4-5]、原核表達(dá)系統(tǒng)和真核系統(tǒng)[6-10]，并被證實(shí)有抗病毒活性。此外，IFN-γ還常常被研發(fā)為疫苗佐劑[10-14]。

雖然已有人開展鴨IFN-γ的研究，但目前對(duì)于鴨IFN-γ功能了解仍甚少，且鴨IFN-γ診斷試劑和鴨(禽)用干擾素產(chǎn)品缺乏。為了開展這方面的研究，本研究利用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建了表達(dá)鴨IFN-γ的慢病毒，將該病毒接種CHO細(xì)胞，通過(guò)加壓篩選獲得了一株穩(wěn)定表達(dá)duIFN-γ的CHO細(xì)胞系。該研究為闡明duIFN-γ的功能、建立duIFN-γ診斷技術(shù)或未來(lái)將其應(yīng)用于禽類養(yǎng)殖業(yè)疾病的治療或預(yù)防奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞

質(zhì)粒plenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro購(gòu)自ABM生物科技有限公司，質(zhì)粒pET30a(+)、慢病毒包裝細(xì)胞系293T細(xì)胞、CHO細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

DNA ladder Marker、Taq聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶、Tranzyme cloning kit、2nd Generation Packaging System Mix、LentifectinTMTransfection Reagent、嘌呤霉素、ExCellenCT Lysis Kit、5×All-In-One RT MasterMix、EvaGreen 2×qPCR MasterMix、慢病毒滴度檢測(cè)試劑盒皆購(gòu)于ABM生物科技有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)于Omega公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS購(gòu)自Gibcol，D-tag抗體購(gòu)于Abcam。Western Blot Chemiluminescence HRP Substrate化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)自于寶生物工程(大連)有限公司；酶標(biāo)二抗(HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG)購(gòu)于Santa Cruz公司。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

參考鴨IFN-γ序列(GenBank登錄號(hào)：AF087134)，委托金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并合成IFN-γ，羧基端添加1×Flag標(biāo)簽。將合成片段通過(guò)酶切、連接，用Tranzyme cloning kit將IFN-γ片段克隆于pORF質(zhì)粒。PCR篩選及測(cè)序分析獲得陽(yáng)性質(zhì)粒。然后將IFN-γ基因亞克隆至pLenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro 載體。通過(guò)EcoR V酶切鑒定，篩選陽(yáng)性克隆plenti-IFN，測(cè)序驗(yàn)證。委托金斯瑞生物有限公司合成IFN-γ序列，分別在5′和3′端引入BamH Ⅰ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。通過(guò)引入的酶切位點(diǎn)將IFN-γ基因亞克隆至pET30a(+)質(zhì)粒。通過(guò)PCR、測(cè)序篩選獲得陽(yáng)性克隆pET30-IFN。

1.4 慢病毒包裝

轉(zhuǎn)染前2 d將293T細(xì)胞傳代于10 cm細(xì)胞板，板內(nèi)加入10 mL完全培養(yǎng)基(含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基)，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合率為佳。依照LentifectinTMTransfection Reagent試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將10 μg plenti-IFN表達(dá)質(zhì)粒和10 μg的慢病毒轉(zhuǎn)染輔助質(zhì)粒2nd Generation Packaging Mix，混勻，室溫孵育5 min。同時(shí)設(shè)立空載體作為空白對(duì)照組(10 μg pLenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro和10 μg的慢病毒轉(zhuǎn)染輔助質(zhì)粒2nd Generation Packaging Mix)。將80 μL的Lentifectin轉(zhuǎn)染試劑稀釋到1 mL無(wú)血清培養(yǎng)基中，混勻，室溫孵育5 min。將2組Lentifectin混合溶液分別加到質(zhì)?；旌先芤褐?，混勻，室溫孵育20 min后，再加入4.5 mL的無(wú)血清培養(yǎng)基，即得到混勻的DNA/LentiFectin混合物。將混合物分別加入棄掉培養(yǎng)基的293T細(xì)胞中，輕柔渦旋平板使復(fù)合物分散。之后置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。8～14 h之后，更換為維持培養(yǎng)基(含2%～5% FBS的DMEM培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)。48 h之后收集培養(yǎng)基，以0.45 μm的低蛋白結(jié)合PES過(guò)濾膜過(guò)濾該培養(yǎng)基得到純化的病毒液。將收集的病毒液10 000 r·min-1離心4 h，即可獲得濃縮的慢病毒rlenti-IFN和對(duì)照病毒rlenti-CN。

1.5 病毒滴度測(cè)定

根據(jù)Abm慢病毒滴度檢測(cè)試劑盒說(shuō)明用熒光定量法測(cè)定病毒滴度。吸取2 μL稀釋好的病毒樣品，加入18 μL的病毒裂解緩沖液并在室溫下孵育3 min。病毒裂解物的Ct值將用于確定未知病毒樣品的滴度。使用qRT-PCR法測(cè)定，反應(yīng)體系為：2×qPCR MasterMix 12.5 μL，病毒裂解液2.5 μL，Reagent-mix 10 μL。同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)物1(STD1)、標(biāo)準(zhǔn)物2(STD2)、陰性對(duì)照(NTC)。反應(yīng)程序?yàn)? ℃ 20 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。計(jì)算出病毒滴度。

1.6 病毒感染及穩(wěn)定細(xì)胞系篩選

1.6.1 藥篩濃度確定

接種CHO細(xì)胞于24孔板，細(xì)胞密度為20%～35%，設(shè)置5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別加入濃度為0、2、4、6、8 μg mL-1的嘌呤霉素。將細(xì)胞放于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞死亡情況。每2～3 d更換1次同樣濃度的篩選培養(yǎng)基。7 d后觀察細(xì)胞死亡情況，初步確定嘌呤霉素的濃度范圍。之后按照同樣的方法操作，將嘌呤霉素濃度調(diào)整為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 μg·mL-1，確定最終的嘌呤霉素濃度。

1.6.2 慢病毒感染

將CHO細(xì)胞提前24 h接種于24孔板中，保證感染時(shí)細(xì)胞達(dá)到20%～35%的融合密度。將rlenti-IFN按照MOI=50的病毒量接種細(xì)胞，72 h后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。加入確定濃度的嘌呤霉素進(jìn)行藥篩。每天觀察細(xì)胞死亡情況。每2～3 d更換一次篩選培養(yǎng)基。持續(xù)培養(yǎng)直至篩選出具有嘌呤霉素抗性的細(xì)胞。

1.6.3 細(xì)胞單克隆挑選

待出現(xiàn)一些具有抗性的細(xì)胞克隆后。停藥培養(yǎng)，使其逐漸增大。之后將該細(xì)胞克隆用胰酶消化，然后采用有限稀釋法傳至96孔板，觀察96孔板中的細(xì)胞，將只有單個(gè)細(xì)胞的孔做好標(biāo)記，用含15%的胎牛血清的完全培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。觀察1周后，挑選出生長(zhǎng)較好的單克隆細(xì)胞系，編號(hào)。然后對(duì)其擴(kuò)大培養(yǎng)，用RT-qPCR方法檢測(cè)IFN-γ的表達(dá)情況，挑選出過(guò)表達(dá)效果最好的一孔，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)成穩(wěn)定細(xì)胞系CHO-IFN。

1.7 RT-qPCR檢測(cè)duIFN-γ轉(zhuǎn)錄水平

離心收集CHO-IFN細(xì)胞。根據(jù)ExCellenCT Lysis Kit細(xì)胞裂解試劑盒操作手冊(cè)裂解細(xì)胞，提取RNA。之后參考5×All-In-One RT MasterMix試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用EvaGreen 2×qPCR MasterMix(Cat.No.MasterMix-R)熒光定量試劑盒檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系CHO-IFN中IFN-γ的表達(dá)。所用引物如下：IFN-gammaF(5′-TGTTCGTCCTC TCTGTGATC-3′)，IFN-gammaR(5′-GGTCTTCTTG AGCATTTCG-3′)；內(nèi)參基因引物β-actinF(5′-GATTCCTATGTGGGCGAC-3′)，β-actinR(5′-TTGTAGAAGGTGTGGTGCC-3′)。PCR反應(yīng)體系如下：EvaGreen 2×qPCR MasterMix 10 μL，上游引物(10 μmol·L-1)0.6 μL，下游引物(10 μmol·L-1)0.6 μL，模板DNA 2 μL，加無(wú)核酸酶H2O至終體積20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min；96 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共25個(gè)循環(huán)。

1.8 duIFN-γ多克隆抗體的制備

將重組質(zhì)粒pET-IFN轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株BL21(DE3)/Plys，誘導(dǎo)表達(dá)。按照常規(guī)方法大量誘導(dǎo)表達(dá)及純化蛋白，免疫小鼠制備多克隆抗體。

1.9 Western blot法檢測(cè)duIFN-γ的表達(dá)

收獲CHO-IFN細(xì)胞和空白對(duì)照CHO-Lenti-CN細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，10% SDS-PAG凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉30 min，一抗為D-Tag或IFN-γ多抗，稀釋比例分別為1∶1 000、1∶500，37 ℃孵育1 h，PBST(Tween20，0.5%)洗滌3次，每次5 min，二抗稀釋比例1∶5 000，37 ℃孵育1 h，PBST(Tween20，0.5%)洗滌3次。徹底洗膜后使用ECL發(fā)光試劑顯影，曝光。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組載體的酶切鑒定

抽提陽(yáng)性質(zhì)粒plent-IFN，用EcoR V進(jìn)行酶切、電泳鑒定。結(jié)果如圖1所示，重組質(zhì)粒按照預(yù)期切出了8.8和0.7 kb 2條帶。

圖1 重組plenti-IFN質(zhì)粒的EcoR V酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant plenti-IFN by EcoR V digestion

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及克隆篩選

將plenti-IFN質(zhì)粒和慢病毒轉(zhuǎn)染輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至慢病毒包裝細(xì)胞系293T細(xì)胞，于72 h觀察，拯救出了具有嘌呤霉素抗性的帶有GFP標(biāo)記的重組病毒rlenti-IFN(圖2中a和b)。

a、b-重組病毒rlenti-IFN；c-細(xì)胞克隆。圖2 重組慢病毒rlenti-IFN感染的CHO細(xì)胞Fig.2 CHO cells infected with rlenti-IFN

繼而結(jié)合有限稀釋法，以最適濃度為5 μg·mL-1的嘌呤霉素對(duì)rlenti-IFN感染細(xì)胞進(jìn)行加壓篩選，獲得一系列病毒穩(wěn)定感染的細(xì)胞克隆(圖2中c)。

2.3 RT-qPCR檢測(cè)duIFN-γ基因的表達(dá)

使用RT-qPCR法對(duì)篩選到的30個(gè)單克隆細(xì)胞系中IFN-γ基因的mRNA水平進(jìn)行測(cè)定，最終篩選到了一株IFN-γ過(guò)表達(dá)倍數(shù)高達(dá)84.45的單克隆細(xì)胞株clone19。確定該單克隆細(xì)胞株為目的細(xì)胞株。

2.4 Western blot檢測(cè)duIFN-γ蛋白表達(dá)

收獲過(guò)表達(dá)倍數(shù)最高的CHO-IFN細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞CHO-Lenti-CN，分別以D-tag抗體和鼠抗IFN多抗為一抗，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果表明，CHO-IFN細(xì)胞樣品在約24 ku處顯出特異性條帶(圖3)，且目標(biāo)蛋白能被D-taq抗體和IFN-γ抗體同時(shí)識(shí)別，說(shuō)明蛋白按照預(yù)期進(jìn)行了表達(dá)。

1-對(duì)照，CHO-lenti-CN細(xì)胞；2-CHO-IFN細(xì)胞。圖3 Western blot方法檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞系CHO-IFN中IFN-γ的表達(dá)Fig.3 Detection of IFN-γ expression in stable cell line CHO-IFN by Western blot

3 結(jié)論與討論

哺乳動(dòng)物的IFN-γ研究得比較透徹，然而禽類IFN-γ與哺乳動(dòng)物的同源性較低，只有21%～34%。而雞與鴨的IFN-γ核苷酸序列同源性高達(dá)80%。因此，哺乳動(dòng)物上的研究結(jié)果借鑒度不高，而禽類IFN-γ基因編碼區(qū)保守度高，在干擾素研究過(guò)程中可以相互借鑒。鴨IFN-γ先后在多個(gè)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了表達(dá)，且被證明有抗病毒活性。這為我們構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系提供了理論依據(jù)，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，慢病毒介導(dǎo)外源基因的整合是較為常見的方法之一。該系統(tǒng)可以將攜帶的外源基因?qū)氩⒄现了拗骷?xì)胞基因組，并能長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。慢病毒感染能力強(qiáng)，能有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞。慢病毒載體系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于構(gòu)建過(guò)表達(dá)外源基因細(xì)胞系[15]、基因沉默或敲除細(xì)胞系[16-17]、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[18]，甚至用于將基因靶向組織和器官等進(jìn)行基因治療[19-21]。目前，采用的慢病毒為復(fù)制缺陷型病毒，不存在生物安全性的問(wèn)題。

IFN-γ為糖基化蛋白，有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，通過(guò)形成同源二聚體發(fā)揮生物學(xué)功能。因此，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)的IFN-γ較原核系統(tǒng)、昆蟲-桿狀病毒系統(tǒng)更具有形成天然IFN-γ的可能性。內(nèi)源性IFN-γ表達(dá)水平往往能從側(cè)面反映機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)，因此，檢測(cè)IFN-γ常作為診斷某些病原感染的輔助手段，且在免疫學(xué)基礎(chǔ)研究中得到了廣泛應(yīng)用。本研究利用慢病毒系統(tǒng)將外源基因鴨IFN-γ穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞，通過(guò)抗性篩選獲得了一株穩(wěn)定表達(dá)IFN-γ的CHO-IFN細(xì)胞株，該研究為duIFN-γ的擴(kuò)大培養(yǎng)、功能研究、duIFN-γ診斷方法的研發(fā)和廉價(jià)鴨(禽)用干擾素的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。