葉楠，王翹楚，徐世豪，于建興，洪基光，李加友*

(1.嘉興學院 生物與化學工程學院，浙江 嘉興 314001；2.象山華宇食品有限公司，浙江 寧波 315700)

我國是世界上最大的柑橘罐頭生產國和出口國，罐頭加工有利于解決柑橘集中上市銷售困難的問題，是柑橘深加工的主要途徑。柑橘罐頭加工過程中產生的廢水中含有大量果膠，影響廢水的好氧生化處理，因此，生產企業(yè)通常采用混凝吸附法或復合絮凝劑處理法將廢水中的果膠絮凝沉降，然后分離出果膠污泥[1-3]。但是，果膠和復合絮凝劑形成的高分子網絡結構，吸水能力強，果膠污泥含水量可達到80%～90%[4-5]，厭氧消化、填埋和焚燒的成本都很高，給生產企業(yè)和行業(yè)發(fā)展都帶來重大影響[6-8]；如果廢棄或自然放置，果膠污泥對土壤、空氣和水體都會造成二次污染[9]。

本研究中擬將果膠污泥與秸稈、蛭石等輔料混合后，利用高性能的微生物菌株進行好氧發(fā)酵，將混合基料快速轉化成一種新型栽培基質，實現(xiàn)果膠污泥的資源化利用，具有良好的經濟可行性。基質化開發(fā)為柑橘罐頭加工企業(yè)的果膠污泥開辟了一條新的利用途徑，為產業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供了新的解決方案。

1 材料與方法

1.1 試劑、材料和儀器

果膠污泥：象山華宇食品有限公司提供；水稻秸稈：嘉興市歸源農業(yè)技術開發(fā)有限公司提供；蛭石：新疆尉犁新隆蛭石有限責任公司提供。

基礎培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：土豆200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL，pH值自然(固體培養(yǎng)基另加瓊脂15 g)。

篩選培養(yǎng)基[10]：果膠5.0 g、七水硫酸鎂2.0 g、硫酸鐵0.01 g、磷酸二氫鉀0.5 g、氯化銨0.4 g、氯化 1 g、硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、溴酚藍0.1 g、瓊脂15 g、水1 000 mL。

HWS-450智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱：常州杰博森儀器有限公司；LDZX-50KBS型50立升(手輪型)立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；TD4臺式低速離心機：鹽城市凱特實驗儀器有限公司；756 s紫外可見分光光度計：上海棱光技術有限公司；YJ-840/YJ-1340潔凈工作臺YJ型：蘇州蘇信環(huán)境科技有限公司。

1.2 果膠降解菌的篩選

1.2.1 果膠污泥的自然發(fā)酵

將果膠污泥分別與秸稈、蛭石混合，在自然狀態(tài)下進行發(fā)酵，具體操作：分別將果膠污泥與秸稈、蛭石混合，果膠污泥占比分別為90%、85%、80%、75%、70%，每個處理3個重復，在28 ℃條件下自然發(fā)酵5 d；發(fā)酵過程中觀察微生物的生長情況。果膠含量利用咔唑比色法測定[11]。

1.2.2 果膠降解菌的分離篩選

將發(fā)酵料上長勢良好的菌株，在超凈臺內，用平板劃線法分別接種在PDA培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)觀察，進一步分離純化，獲得單菌落后保藏。

將PDA培養(yǎng)基中純化得到的菌種分別接種到篩選培養(yǎng)基上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后根據(jù)培養(yǎng)基中溴酚藍的顏色變化和菌落形態(tài)，對所純化菌株的果膠降解性能進行定性比較。果膠酶活力以DNS法測定[12-13]。

1.3 栽培基質的混合發(fā)酵制備方法

基于秸稈和蛭石的吸水能力不同，分別按照果膠與秸稈4∶1、果膠與蛭石3∶1配制發(fā)酵原料，然后每個處理加入5 mL菌液，放置在溫度為28 ℃的通風環(huán)境中進行發(fā)酵。發(fā)酵過程中定期檢測體系的果膠含量，當果膠含量不再下降時發(fā)酵結束，烘干后制得成品的栽培基質。

1.4 育苗試驗

櫻桃紅蘿卜品種為上海小紅蘿卜，菠菜品種為華波1號，四季小香蔥品種為魯蔥1號。稱取栽培基質2 g，將約3/4的栽培基質加入育苗盤的穴中，然后每一穴中播入1粒種子。播種完成后將剩余栽培基質覆蓋種子之上，澆水浸透。

在20 ℃下培養(yǎng)發(fā)芽，覆上保鮮膜保溫，待發(fā)芽后去掉保鮮膜。在每天9：00-11：00和15：00-17：00補充自然光照；每2 d澆一次水，并統(tǒng)計發(fā)芽率和觀察幼苗長勢。苗齡10 d起，每隔3 d從每組處理中隨機抽取幼苗15株，測定株高、鮮重、干重等指標，平行測定3次。其中，株高為根莖部到生長頂部間的長度，用直尺測量；60 ℃烘干至恒重測定其干重[14-18]。

2 結果與分析

2.1 果膠降解菌的篩選

測定混合物發(fā)酵前的果膠濃度，每隔10 d為一批次，分批次再次測定樣品中的果膠濃度以確定發(fā)酵是否結束。當果膠濃度不再降低時即為發(fā)酵結束。結果(圖1)表明，經過30 d的發(fā)酵，果膠發(fā)酵完全結束。

圖1 果膠降解菌株康寧木霉LZ51菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of the pectine-degrading strain Trichoderma koningii LZ51

用2倍體積的水浸泡發(fā)酵完成的基質，收集浸泡液得果膠酶液，用DNS法測定不同處理中的果膠酶活性[19-21]。結果表明，從秸稈果膠泥混合基質篩選獲得的菌株LZ51產生果膠酶活性最強，達到684 U·mL-1。經分子生物學鑒定(圖2、表1)，該菌為康寧木霉(Trichodermakoningii)。該菌株保藏備用。

表1 18S rDNA BLAST比對結果Table 1 Results of the 18S rDNA BLAST alignment

圖2 菌株康寧木霉LZ51的18S rDNA電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of 18S rDNA of the strain Trichoderma koningii LZ51

2.2 不同基質對三種菜種發(fā)芽率的影響

利用秸稈果膠基質(M1)、蛭石果膠基質(M2)和蛭石基質(CK)等三種不同基質分別栽培櫻桃紅蘿卜、大葉菠菜和四季香蔥，考查果膠污泥發(fā)酵基質對不同蔬菜發(fā)芽的影響。由圖3～5可知，秸稈果膠基質中幼苗的生長情況穩(wěn)定，3種幼苗的發(fā)芽率較蛭石果膠基質平均高3%，較蛭石基質平均高5%。且蛭石基質在生長過程中出現(xiàn)了幼苗感染病菌出現(xiàn)倒伏的情況，說明秸稈果膠基質和蛭石果膠基質經過發(fā)酵處理，有一定的抗病菌能力，增強了蔬菜幼苗的抵抗力。

圖3 不同基質對櫻桃紅蘿卜發(fā)芽率的影響Fig.3 Effects of different substrates on germination rate of cherry red radish

在櫻桃紅蘿卜的育苗實驗中(圖3)，3種基質的幼苗發(fā)芽率相差在3%左右，櫻桃紅蘿卜與另兩種蔬菜的不同之處在于，大葉菠菜與四季香蔥屬于葉菜類蔬菜，櫻桃紅蘿卜屬于根菜類蔬菜。對于基質的疏松性、保水性、通透性等也有不同的要求；四季香蔥的育苗結果表明(圖4)，蛭石基質的平均發(fā)芽率較秸稈基質高出2%；大葉菠菜的發(fā)芽率中，秸稈果膠基質比蛭石果膠基質、蛭石基質分別高出2%和3%(圖5)。

圖4 不同基質對四季香蔥發(fā)芽率的影響Fig.4 Effects of different substrates on the germination rate of four-season chive

圖5 不同基質對大葉菠菜發(fā)芽率的影響Fig.5 Effects of different substrates on germination rate of large-leaf spinach

綜上所述，秸稈果膠基質和蛭石果膠基質對于3種蔬菜的發(fā)芽率較蛭石基質明顯提升。因此，利用秸稈或者蛭石和果膠污泥混合后進行發(fā)酵處理，所制備的基質有利于蔬菜種子的發(fā)芽。

2.3 不同基質對蔬菜幼苗生長的影響

在幼苗培育10 d之后開始每隔3 d進行一次株高的測量。測量時，從每個穴盤內隨機選取15株，測量其絕對株高。選取測量株高的植株時，不選取邊際植株。

由表2可知，蛭石果膠基質培育的四季香蔥幼苗長勢更好，在13 d時四季香蔥幼苗株高已經達到了6.77 cm，生長速度很快。而秸稈果膠基質對于3種蔬菜的生長都有明顯的促進作用，秸稈基質中的菜苗平均以0.3 cm·d-1的速度生長，且秸稈果膠基質培育的菜苗均未出現(xiàn)幼苗倒伏的情況，而其他兩種基質均有幼苗倒伏。

表2 不同基質對蔬菜幼苗株高的影響Table 2 Effects of different substrates on plant height of vegetable seedlings 單位：cm

由圖6可知，秸稈果膠基質培育的櫻桃紅蘿卜鮮重較其他兩種基質增加30%以上，培育的大葉菠菜鮮重和蛭石果膠基質相近，較蛭石基質有了約50%的提升；但是，秸稈果膠基質和蛭石果膠基質培育的四季香蔥鮮重均不及蛭石基質。

圖6 不同基質對培育蔬菜幼苗鮮重的影響Fig.6 Effects of different substrates on fresh weight of vegetable seedlings

3 總結與討論

篩選出的菌株康寧木霉LZ51具有較強的果膠轉化能力，在果膠污泥和秸稈混合發(fā)酵基質中的果膠酶活性為684 U·mL-1，產酶能力較強。

蛭石是最常用的栽培基質之一，果膠污泥分別與秸稈、蛭石混合發(fā)酵制得的育苗基質在櫻桃紅蘿卜、大葉菠菜和四季香蔥的試用中發(fā)現(xiàn)，3種蔬菜的種子發(fā)芽率、幼苗株高、鮮重等生長指標方面均表現(xiàn)出良好效果，性能較蛭石基質優(yōu)良；尤其是秸稈與果膠污泥混合基質中，3種幼苗的發(fā)芽率較蛭石基質平均高5%。

綜上所述，秸稈果膠混合發(fā)酵生產的栽培基質在蔬菜育苗中具有良好的應用前景；基質化利用為解決柑橘罐頭加工企業(yè)的果膠污泥難題開辟了一條新途徑，為果膠污泥的資源化利用奠定了基礎，對行業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要價值。