湯騰躍，余柯達，王佳淇，范超洋

(1.金華市婺城區(qū)雅畈鎮(zhèn)人民政府，浙江 金華 321000；2.浙江師范大學(xué)，浙江 金華 321004；3.上海新紀元武義高級中學(xué)，浙江 金華 321017；4.金華先實大農(nóng)業(yè)科技有限公司，浙江 金華 321004)

三葉木通和五葉木通同屬木通科(Lardizabalaceae)木通屬(Akebia)，是營養(yǎng)價值和藥用價值極高的藤本植物[1]。五葉木通屬落葉或半常綠木質(zhì)藤本，俗稱木通，在我國野生資源豐富，是我國的傳統(tǒng)中草藥，具有抗癌、抗炎、抗菌、利尿、止痛、抗風濕等功效。三葉木通俗稱八月炸、金腎果、野香蕉，果實是中藥預(yù)知子。在我國分布廣泛，其果實味香甘甜，風味獨特，營養(yǎng)豐富，富含維生素C(VC)、17種氨基酸、礦物質(zhì)、脂肪酸、蛋白質(zhì)、糖和微量元素等，是名副其實的第3代保健型野生水果[2]。然而野生木通資源匱乏，人工培育顯得尤為重要。

目前的研究[3-5]表明，溫度是影響三葉木通生長的第一要素，光照是次要因素，海拔和坡度是決定三葉木通群落分布的主要因子，土壤性質(zhì)對三葉木通的生長也存在著一定的影響。有關(guān)木通的遺傳多樣性研究相對較少，其中席在星[6]建立了三葉木通隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)最佳反應(yīng)體系；田宗城等[7]用RAPD技術(shù)對木通屬4個種進行研究，發(fā)現(xiàn)七葉木通與三葉木通種的親緣關(guān)系較遠，而白木通與三葉木通的親緣關(guān)系較近；Kitaoka等[8]以三葉木通葉片為材料，建立適合三葉木通種質(zhì)資源遺傳多樣性研究的優(yōu)化AFLP反應(yīng)體系。目前還沒有關(guān)于生態(tài)因子影響木通遺傳多樣性的研究。

nrDNA的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)承受的選擇壓力較小，具有很高的可變性，且在核基因組中高度重復(fù)。ITS區(qū)的可變性為物種鑒定提供了豐富的變異位點和信息位點。Zietkiewicz等[9]發(fā)現(xiàn)，五葉木通ITS序列不具有獨立性。ISSR標記是1994年開始發(fā)展起來的一種分子標記技術(shù)[10]，結(jié)合了SSR和RAPD的優(yōu)點，目前已廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性、進化及分子生態(tài)學(xué)等研究中。本實驗結(jié)合ITS序列分析和ISSR標記2種方法探究生態(tài)因子對三葉木通和五葉木通遺傳多樣性的影響，為保護浙江三葉木通和五葉木通種質(zhì)資源，提供基礎(chǔ)資料和科學(xué)依據(jù)，也為三葉木通和五葉木通的人工培育提供了借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究對浙江省三葉木通和五葉木通主分布區(qū)內(nèi)的天然種群做了采樣分析，包括金華北山(Bs)、開化古田山(Gt)、磐安大盤山(Pa)、泰順烏巖嶺(Wy)、杭州西天目山(Xt)、溫州雁蕩山(Yd)和麗水龍泉市(Zs)7個地區(qū)的三葉木通、五葉木通樣本，共34個樣品，各樣地的三葉木通和五葉木通種群之間呈相對隔離狀態(tài)。采樣時，采摘三葉木通和五葉木通的嫩葉放于保鮮袋中，封口，置于樣品貯藏箱(用冰塊保持冷藏條件)帶回實驗室，-80 ℃低溫冰箱保存。同時采集各種群距地表2～10 cm深的土壤，供土壤分析用。樣品采集地點、樣品編號等具體信息見表1。

表1 樣品采集具體信息Table 1 Sample collection information

表2 五葉木通不同居群ITS序列的遺傳距離Table 2 Genetic distance of ITS sequences in different populations of Akebia quinata

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

參考張錚等[10]改良CTAB法提取基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測提取的樣本基因組DNA質(zhì)量，并置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ITS序列擴增和測序

采用引物ITF1(5′-GCTCCTACCGATTGAATGGT-3′)和ITR1(5′-GTAAGTTTCTTCTCCTCCGC-3′)，擴增木通樣本的ITS序列。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)。擴增反應(yīng)體系為25 μL，含2.5 μL 10×ExTaqPCR Buffer、70 ng模板DNA、0.2 mmol·L-1dNTP、0.4 μmol·L-1ITF1、0.4 μmol·L-1ITR1、0.75 U ExTaqDNA聚合酶(寶生物工程大連有限公司)。PCR產(chǎn)物采用上海生工DNA柱式通用回收試劑盒進行回收，10 μL回收產(chǎn)物送至生工生物(上海)公司進行測序，對所有序列均進行雙向測序。

1.2.3 ISSR擴增及電泳分析

根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的ISSR引物序列設(shè)計，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。對木通屬ISSR-PCR反應(yīng)體系進行了優(yōu)化，確定了最佳的反應(yīng)條件為：反應(yīng)體系為25 μL，其中2.5 μL 10×PCR Buffer(Mg2+Plus)、70 ng模板DNA、0.15 mmol·L-1dNTP、引物濃度0.4 μmol·L-1、0.5 mmol·L-1Mg2+、0.75 U rTaqDNA聚合酶(寶生物工程大連有限公司)；PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，退火45 s(退火溫度隨引物而定)，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照保存。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 ITS數(shù)據(jù)分析

對測序公司返回的ITS序列，用ClustalW 2軟件進行序列比對。序列使用MEGA 5.0分子進化遺傳分析軟件構(gòu)建發(fā)育樹，發(fā)育樹各分支的置信度用自舉檢驗法檢驗，共進行500次循環(huán)，以評價各分支的系統(tǒng)學(xué)意義與可靠性。

1.3.2 ISSR數(shù)據(jù)分析

在電泳圖譜上的每一個條帶均視為一個分子標記，代表1個引物的結(jié)合位點。按凝膠同一個位置上DNA帶的有無進行統(tǒng)計，有帶的記為1，無帶的記為0，生成0/1 Excel統(tǒng)計表。采用POPGEN 32軟件計算多態(tài)位點百分數(shù)(P)、Shannon′s信息指數(shù)(I)和Nei′s基因多樣性指數(shù)(h)來估算基因多樣性[11]。利用SPSS 16.0軟件導(dǎo)入0/1 Excel統(tǒng)計表計算樣品遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，并按UPGMA法(非加權(quán)配對算術(shù)平均法)對所有樣品進行聚類分析，構(gòu)建親緣關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列分析

2.1.1 ITS聚類分析

用最大似然法(ML法)構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)，用bootstrap自舉法檢驗發(fā)育樹，重復(fù)500次，判斷各分支處的可信度。

圖1 基于ITS序列構(gòu)建的27個樣本ML系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 A phylogenetic tree of 27 samples of ML based on ITS sequences

在聚類圖中，三葉木通和五葉木通大致各自聚為一支，而Pa6w樣本與三葉木通聚為一類，在三葉木通一類中與其他樣本遺傳距離較遠。由葉形觀察知，Pa6w樣本為五小葉復(fù)葉，而葉片大小、葉緣和長寬比與三葉木通相近，因此推斷，Pa6w樣本可能是三葉木通和五葉木通的過渡類型。從ML聚類圖看出，三葉木通樣本間的聚類結(jié)果支持率十分低，其聚類結(jié)果可信度不高，說明不同地區(qū)三葉木通的ITS序列間變異不大，遺傳距離過小，不適合采用ITS序列來分析它們之間的親緣關(guān)系。相反，五葉木通的聚類結(jié)果支持率較高，可以采用ITS序列來分析樣品之間的親緣關(guān)系。

2.1.2 海拔與五葉木通遺傳多樣性具有明顯相關(guān)性

五葉木通某些樣品無法采集土樣，未能測定其pH值和有機質(zhì)含量。利用MEGA 5.0軟件計算遺傳距離(表2)可知，五葉木通不同居群間ITS堿基序列的遺傳距離在0～0.007 8，與其他物種相比，種內(nèi)ITS序列的變異范圍較小。在ML系統(tǒng)發(fā)育樹中，Xt6w和Xt9w的海拔高度差距最小，兩者之間的遺傳距離也最短，而Xt5-2w雖然也采自西天目山地區(qū)，但并沒有與Xt6w和Xt9w聚為一支，可能是由于其海拔較高。計算海拔與樣本遺傳距離間的相關(guān)系數(shù)，得出r海拔=0.96，遠大于0.8，相關(guān)性顯著。總體而言，隨著居群之間海拔高度差距的增加，其遺傳距離也相應(yīng)增大，說明海拔對五葉木通的遺傳多樣性產(chǎn)生一定的影響。

2.2 ISSR分析

2.2.1 ISSR引物篩選結(jié)果

通過ISSR技術(shù)對三葉木通進行遺傳多樣性分析，從75對引物中篩選出15對擴增條帶多、清晰且重復(fù)性好的引物用于ISSR-PCR反應(yīng)(表3)。經(jīng)統(tǒng)計，這15對引物擴增共得到265條帶，其中多態(tài)性條帶為261條，占比98.49%。擴增的DNA片段長度介于200～2 000 bp。

表3 篩選出的15條ISSR引物Table 3 Fifteen screened ISSR primers

2.2.2 三葉木通遺傳多樣性

各地區(qū)樣本的多態(tài)位點百分率存在著差異，古田山地區(qū)最高，北山地區(qū)最低，變化范圍在49.26%～70.32%，平均為61.42%。各地區(qū)三葉木通的Shannon′s信息指數(shù)(I)變化范圍在0.212 2～0.605 9之間，平均為0.394 0。Nei′s基因多樣性指數(shù)(h)的大小為0.250 0～0.367 3(表4)。P、h和I都顯示出三葉木通樣本具有較高的遺傳多樣性(圖2)。

圖2 UBC818 ISSR-PCR擴增電泳圖Fig.2 ISSR-PCR amplification electropherogram of UBC818

表4 不同地區(qū)三葉木通的遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of Akebia trifoliata in different regions

2.2.3 ISSR聚類分析

運用SPSS 16.0對6個地區(qū)的23個三葉木通樣本進行UPGMA聚類分析，得到樹狀聚類分析圖(圖3)。從圖3可以得出，當遺傳距離為13時，每個地區(qū)的三葉木通樣本各自聚為一類；當遺傳距離為18時，烏巖嶺、西天目山、雁蕩山的樣品和北山、古田山、大盤山的樣品區(qū)分開來；當遺傳距離為25時，三葉木通和參照樣本(鷹爪楓)區(qū)分開來。這表明同一個地區(qū)三葉木通其遺傳差異小于不同地區(qū)間三葉木通的差異。

圖3 23個三葉木通樣本UPGMA聚類樹狀圖Fig.3 UPGMA cluster dendrogram of 23 Akebia trifoliata samples

2.2.4 海拔、土壤有機質(zhì)含量和pH值與三葉木通遺傳多樣性的相關(guān)性不顯著

從三葉木通的聚類分析結(jié)果可知，三葉木通的聚類與區(qū)域有關(guān)，每個地區(qū)的三葉木通各自聚為一類。三葉木通樣本取自浙江省6個不同的地區(qū)，所生長的生境有著一定的差異，結(jié)合生境中的土壤pH值、有機質(zhì)含量和海拔這3個生態(tài)因子，計算三者與遺傳距離的相關(guān)系數(shù)，得出r海拔=0.03，rpH值=0.22，r有機質(zhì)含量=0.02，相關(guān)系數(shù)r遠小于0.8，這表明海拔、土壤的酸堿度和有機質(zhì)含量對三葉木通的遺傳多樣性影響不大。

3 討論

3.1 海拔與五葉木通遺傳多樣性相關(guān)性分析

研究結(jié)果表明，海拔與五葉木通的遺傳多樣性有一定的相關(guān)性。五葉木通性喜溫暖濕潤氣候，不耐嚴寒，多生長在海拔50～1 200 m的山地灌叢、林緣和溝谷中，其中又以海拔200～900 m分布較為豐富[12]，推測該海拔高度范圍較適宜五葉木通生長，受到的生境選擇壓力較小，從而影響其遺傳多樣性。

海拔因素對五葉木通遺傳多樣性的影響，初步說明了海拔對基因交流存在一定的阻礙作用；而海拔相近的五葉木通居群，如Xt6w和Xt9w遺傳距離較小，可能是小范圍內(nèi)生境類型大致相同造成的。由于海拔差距的存在，導(dǎo)致物種不同居群間親緣關(guān)系發(fā)生變化的現(xiàn)象，在皮樺[13]和水稻[14]中也有報道。海拔的變化常常是決定物種生境差異的主導(dǎo)因子，可能還伴隨著溫度、降水、光照和土壤等生態(tài)因子的改變，進而影響植物的分布和遺傳多樣性[15]。

3.2 地區(qū)差異與三葉木通遺傳多樣性相關(guān)性分析

利用ISSR技術(shù)對浙江省6個不同地域的三葉木通種群遺傳多樣性進行分析，其物種水平的多態(tài)位點百分率(P)高達98.49%，Nei′s基因多樣性指數(shù)(h)為0.503 3，Shannon′s信息指數(shù)(I)為0.689 0，反映出三葉木通的遺傳多樣性較高。影響種群遺傳分化的因素很多，如繁育系統(tǒng)、分布范圍、種子傳播機制和演替階段等[16-19]。在UPGMA方法構(gòu)建的系統(tǒng)樹狀圖中，各三葉木通間是按照浙江省內(nèi)的金華北山、開化古田山、磐安大盤山、泰順烏巖嶺、臨安西天目山和溫州雁蕩山6個地區(qū)進行聚類的，說明三葉木通間的遺傳變異程度與地域分布有一定相關(guān)性，其原因可能是地理阻隔導(dǎo)致遺傳組成發(fā)生了變異，地理環(huán)境是造成該植物遺傳多樣性的重要因素[20]。