關(guān)鍵詞：Cr（Ⅵ）；寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas sp.）；紅薯淀粉膠囊；包埋菌劑

中圖分類號：X172；X53 文獻標志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）12-2923-12 doi：10.11654/jaes.2023-1105

鉻（Chromium，Cr）及其化合物因具備耐高溫、抗腐蝕、質(zhì)硬和耐磨等特性，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中[1]。我國工業(yè)的快速發(fā)展產(chǎn)生了大量的Cr渣，一些Cr渣露天堆放導(dǎo)致部分堆場大量的Cr遷移進入土壤和地下水。研究表明，土壤中的Cr污染會通過食物鏈或呼吸作用進入人體，導(dǎo)致鼻炎、肺結(jié)核、腹瀉、支氣管炎、皮炎等多種疾病，對人類健康造成嚴重威脅[2-3]。因此，Cr污染土壤的修復(fù)十分迫切。

目前，Cr（Ⅵ）污染土壤的修復(fù)方法分為異位修復(fù)技術(shù)與原位修復(fù)技術(shù)[4]。其中，異位修復(fù)包括客土法、異位填埋、異位固化、異位土壤淋洗等方法。異位修復(fù)成本高，不利于大規(guī)模開展，而且修復(fù)過程中易造成土壤二次污染[5]。原位修復(fù)技術(shù)主要包括生物修復(fù)、化學(xué)修復(fù)及物理修復(fù)等[6]。其中物理修復(fù)和化學(xué)修復(fù)能耗高、價格貴，在修復(fù)過程中常改變土壤的一些物理、化學(xué)及生物特性[7]，且修復(fù)效果隨修復(fù)藥劑的耗損而大幅降低，甚至出現(xiàn)Cr（Ⅵ）返溶現(xiàn)象，治理效果非常不穩(wěn)定。發(fā)展綠色廉價、環(huán)境友好、可持續(xù)的Cr污染治理技術(shù)尤為迫切。

微生物修復(fù)作為一種原位修復(fù)技術(shù)，具有成本低廉、環(huán)境友好等優(yōu)點，目前已經(jīng)成為土壤修復(fù)技術(shù)新的研究熱點[8]。但場地土壤重金屬污染情況復(fù)雜，場地土壤中一方面存在大量土著競爭微生物，另一方面土壤條件惡劣，酸或堿性強、營養(yǎng)缺乏[9]，這些均導(dǎo)致外源微生物難以在場地成功定殖和長期生存。微生物固定化技術(shù)作為一種保護微生物的有效手段，可以大幅提升游離菌的場地適應(yīng)性、修復(fù)效率和修復(fù)長效性。該技術(shù)主要是一種生物可降解的成膜材料包覆固體或液體芯材，使之形成微小粒子的技術(shù)，制得的微膠囊具有改善和提高芯材物質(zhì)外觀及性質(zhì)的能力，能夠保護囊心物質(zhì)不受外界的影響[10]，這種用于固定微生物的微膠囊又稱為生物微膠囊[11]。

制備生物微膠囊的壁材原料種類多樣。壁材的不同將導(dǎo)致微膠囊對外界環(huán)境因素具有不同的抗性，進而影響到內(nèi)部的微生物活性。目前制作包埋微生物材料的壁材主要是碳水化合物如海藻酸鹽、殼聚糖、菊粉、膳食纖維等[12]。該類壁材形成的孔徑較大、對酸性環(huán)境敏感、囊壁穩(wěn)定性差、傳質(zhì)差，容易造成水分的過度丟失，使得干燥后凝膠的硬度變大，對微生物菌群造成擠壓，導(dǎo)致菌群存活率降低，從而限制了其大規(guī)模的應(yīng)用。課題組前期開發(fā)了一種紅薯淀粉膠囊包埋技術(shù)，該技術(shù)是一種基于固定技術(shù)并結(jié)合膠囊特性的層層固定方法，制備的膠囊具有的三層中空結(jié)構(gòu)，可以為Cr還原微生物提供良好的生長繁殖微環(huán)境，同時膠囊壁材為微生物提供了可利用碳源，增強了微生物的生長和代謝能力。此外，紅薯淀粉為主的壁材傳質(zhì)性能優(yōu)越，污染物Cr可自由進出微囊，與囊內(nèi)的微生物反應(yīng)，產(chǎn)物亦可順利排出。但前期僅考察了該包埋菌劑對Cr（Ⅵ）液體培養(yǎng)基中Cr（Ⅵ）的還原效果，缺少對土壤污染介質(zhì)修復(fù)效果及修復(fù)后土壤功能及植物種植安全利用研究。本試驗的目的為：對比游離寡養(yǎng)單胞菌和紅薯淀粉膠囊包埋菌的Cr（Ⅵ）去除效率、修復(fù)后土壤主要營養(yǎng)周轉(zhuǎn)功能酶的酶活性變化及植物的健康生長狀況。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤采自西南科技大學(xué)生命科學(xué)院溫室旁（31°32′N，104°42′E）堆積的砂土。該土壤的基本性質(zhì)為：總Cr含量1.31～1.98 mg·kg^-1，未檢測出Cr（Ⅵ），有機質(zhì)含量1.44%～1.70%，陽離子交換量2.93～3.21cmol·kg^-1，pH 7.03～8.03。

供試菌劑為課題組前期從青海海北化工廠廢棄的Cr 渣土壤中分離的寡養(yǎng)單胞菌（菌種保藏號：CCTCC AB 2023023）。將保藏在-80 ℃的寡養(yǎng)單胞菌取出，接種于LB 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)36 h，4 ℃、200 r·min-1離心10 min，棄上清，收獲菌體。將菌體和生理鹽水（0.9%）按照1∶5（質(zhì)量比）混合后，置于28 ℃、200 r·min^-1 恒溫搖床培養(yǎng)4h，得到供試菌液（OD0.75）。

紅薯淀粉膠囊及包埋菌劑制備：（1）取0.5 g聚乙烯醇121 ℃高壓滅菌15 min；（2）1.5 g骨膠加15 mL去離子水，完全吸收后，置于70 ℃水浴鍋中，攪拌至完全融化；（3）30 g紅薯淀粉過80目篩，用30 ℃去離子水攪拌成黏糊狀（手捏成型，不松散）；（4）將上述處理過的紅薯淀粉與骨膠混合，快速攪拌，倒入自制模具（圖1）定型，得到半實心球體；（5）將水或制備好的供試菌劑用1 mL針管注入到半實心球體中，得到包封菌劑；（6）將包封菌劑放置于聚乙烯醇中均勻包裹，靜置2～3 h，充分定型，得到紅薯淀粉膠囊或包埋菌劑，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用前，將包埋菌劑放入培養(yǎng)皿中密封，置于28 ℃培養(yǎng)箱中12 h，以活化菌種。

供試植物高羊茅種子購自江西新途園林工程有限公司。具體培養(yǎng)方法如下：（1）用5% 的雙氧水對種子表面消毒1 min 后，用無菌蒸餾水沖洗5～7 次；（2）將消毒后的種子置于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中（加3 mL 無菌水），于植物培養(yǎng)箱（溫度25 ℃，濕度55%，光照/黑暗為16 h/8 h）中萌發(fā)，為了防止種皮長期浸泡后釋放的物質(zhì)影響種子的萌發(fā)，在萌發(fā)期間每天早晚將種子用無菌水清洗1次，并加入新鮮的無菌水；（3）待種子萌發(fā)7 d后，選取長勢一致且健壯的幼苗定植于1/2 霍格蘭營養(yǎng)液中，放置在溫室（溫度25 ℃，濕度50%，光強6 000 lx，光照/黑暗為16 h/8 h）進行幼苗培養(yǎng)，培養(yǎng)期間每3 d更換1次營養(yǎng)液，培養(yǎng)1 周后，根據(jù)幼苗的基徑、高度和幼葉數(shù)量，選擇大小、生長一致的健康幼苗900株，均分后分別移栽到不同處理修復(fù)后的土壤中培養(yǎng)15 d。

1.2 試驗處理

盆栽試驗于西南科技大學(xué)（31°32′N，104°42′E）溫室大棚中進行。將供試土壤的Cr（Ⅵ）含量按照Wu等[13]的方法配制，設(shè)置3個Cr（Ⅵ）含量（0、30、100mg·kg^-1），每個含量設(shè)3個重復(fù)，將配制好的土壤自然狀態(tài)下定期補水，平衡1個月后，檢測土壤中的總Cr和Cr（Ⅵ）的含量，其結(jié)果與設(shè)定值基本一致。

將平衡后的土壤經(jīng)10目尼龍網(wǎng)篩篩分后，各取2.5 kg放置在花盆中（花盆底部放置塑料托盤，防止Cr污染物和土壤溶液滲漏損失），設(shè)置4個處理，每個處理設(shè)置10個重復(fù)，分別為：①含0、30、100 mg·kg^-1Cr（Ⅵ）的土壤（分別記為0CK、30CK、100CK）；②裸菌處理（F），寡氧單胞菌，30 mL供試菌劑；③包埋材料處理（MI），紅薯淀粉膠囊，30 g包埋材料；④包埋菌處理（MIF），紅薯淀粉膠囊包埋寡氧單胞菌，30 g包埋材料+供試菌劑。用鋼鏟將各個花盆中處理后的土壤攪拌均勻，并置于溫室中（光強6 000 lx，光照/黑暗為12 h/12 h，日溫28 ℃，夜溫23 ℃，相對濕度45%～50%），各個處理土壤水分維持在50%的田間持水量，土壤處理時間為1 個月。在修復(fù)處理的第10 天（前期）、第20天（中期）、第30天（末期），充分翻拌土壤后，于每個花盆采集10～15 g土壤，采集的土樣置于實驗室自然風(fēng)干，用于土壤pH、總Cr、Cr（Ⅵ）及土壤酶活的測定。處理第31天，在上述溫室中移栽供試植物高羊茅，培養(yǎng)期間每3 d澆水1次，保持土壤田間持水量50%。種植15 d后，選取第4葉位、健康及完整無損的葉片測定其丙二醛、活性氧和抗氧化酶活性。將花盆中土壤用水充分浸泡后，小心移出植物的整個根系，使用蒸餾水輕柔沖洗植物根部，以去除附著的土壤，收集根部。將新鮮的根及地上部分（莖和葉），包裹在錫箔紙中帶回實驗室供后續(xù)總Cr含量測定。

1.3 分析方法

1.3.1 土壤總Cr含量測量

根據(jù)《土壤總鉻的測定火焰原子吸收分光光度法》（HJ 491—2009）標準進行土壤干燥、過篩、消解，土樣過濾后，使用火焰原子吸收光譜儀測量溶液中總Cr含量。

1.3.2 土壤Cr（Ⅵ）含量及去除率測定

根據(jù)《土壤和沉積物六價鉻的測定堿溶液提取-火焰原子吸收分光光度法》（HJ 1082—2019）標準，對土壤樣品進行提取后，抽濾、定容、搖勻、過濾，使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測量待測液中的Cr（Ⅵ）。使用公式（1）計算土壤的Cr（Ⅵ）去除率（R）：

式中：C 為試驗處理前土壤中的Cr（Ⅵ）含量；C₁為試驗后期土壤樣品中的Cr（Ⅵ）含量。

1.3.3 土壤Cr化學(xué)形態(tài)及pH

使用BCR法[14]連續(xù)分級提取土樣中各化學(xué)形態(tài)的Cr，按照相應(yīng)步驟提取土壤中的水溶態(tài)（Fws）、酸可提取態(tài)（Fae）、可還原態(tài)（Fre）、可氧化態(tài)（Fox）和殘渣態(tài)（Frs）Cr，并利用原子吸收光譜儀測定其含量。土壤在蒸餾水中浸提30 min（蒸餾水與土壤的質(zhì)量比為5∶1），在5 000 r·min^-1下離心10 min后用pH 計測定土壤pH[15]。

1.3.4 土壤酶活性

采用關(guān)松蔭[16]的方法測定土壤酶活性。脲酶活性的測定采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法，蔗糖酶活性的測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法，過氧化氫酶（CAT）活性的測定采用紫外分光光度法[17]。

1.3.5 高羊茅植物地上、地下部分總Cr測定

同1.3.1土壤總Cr測定方法。

1.3.6 植物丙二醛和H₂O₂測定

采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法[18]測定高羊茅葉片的丙二醛（MDA）含量；利用分光光度計測定離心上清液的OD值，并根據(jù)Jin等[19]的方法測量高羊茅葉片的H₂O₂含量。

1.3.7 植物酶活性測定

采用Maehly 等[20]的方法測定過氧化物酶（POD）和CAT活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2021 計算數(shù)據(jù)平均值和標準差。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）評價Cr（Ⅵ）、游離菌、包埋材料、包埋菌處理對土壤和植物生長指標的影響。統(tǒng)計分析前，利用SPSS 25.0的Kolmogo?rov-Smirnov檢驗和Levene檢驗分析數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性。如果方差不齊性，對數(shù)據(jù)進行對數(shù)變換，保證方差的正態(tài)和同質(zhì)性。當方差分析顯示處理間差異顯著時（Plt;0.05），采用Duncan法進行多重比較。使用Origin 2021制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅薯淀粉膠囊包埋微生物修復(fù)對土壤總Cr含量與Cr（Ⅵ）去除率的影響

低、高Cr（Ⅵ）含量下土壤總Cr含量情況見圖2a、圖2b。分析可知，與CK相比，F(xiàn)處理土壤的總Cr含量隨時間延長無顯著變化，MI、MIF處理土壤的總Cr隨時間延長而逐漸降低。低、高含量Cr（Ⅵ）脅迫末期，與CK相比，F(xiàn)處理無顯著差異，MI處理土壤總Cr顯著降低了41.27%、23.53%，MIF 處理顯著降低了61.18%、36.31%；與F處理相比，MIF處理土壤總Cr分別顯著下降了59.74%和12.46%（Plt;0.05）。

寡氧單胞菌主要通過胞外聚合物的羥基、羧基、硫基和磷酸基團高效吸附Cr[21]，不能分解和轉(zhuǎn)化總Cr為其他物質(zhì)，測定總Cr之前過100目篩并不能把裸菌去除，其依然存在于土壤中，因此土壤的總Cr無明顯變化。但紅薯淀粉包埋菌劑的直徑增大，會被100目篩網(wǎng)篩出，導(dǎo)致其吸附的總Cr被帶離土壤，從而降低了土壤的總Cr含量，這是本研究中MIF處理總Cr含量下降的原因。

低、高Cr（Ⅵ）含量下（圖2c和圖2d），F(xiàn)處理Cr（Ⅵ）去除率隨著時間的延長而逐漸降低，與處理初期相比，處理末期分別顯著下降了37.12%、40.12%；MI處理下Cr（Ⅵ）去除率隨時間的延長未發(fā)生顯著變化；MIF處理下Cr（Ⅵ）去除率隨時間的延長而上升，與處理初期相比，處理末期分別顯著提高了23.38%、11.38%。處理末期，低含量Cr（Ⅵ）時，與CK相比，F(xiàn)、MI、MIF 處理下Cr（Ⅵ）去除率分別顯著提升了40.4%、58.78%、85.97%；與F處理相比，MIF處理下Cr（Ⅵ）去除率顯著提高了43.80%。高含量Cr（Ⅵ）時，與CK 相比，F(xiàn)、MI、MIF 處理下Cr（Ⅵ）去除率分別顯著提高了19.4%、62.78%、78.65%；與F處理相比，MIF處理下Cr（Ⅵ）去除率顯著提高了58.80%（Plt;0.05）。

Cr 污染場地的微生物修復(fù)方面的研究極為有限，且大多僅限于實驗室中。研究發(fā)現(xiàn)，寡養(yǎng)單胞菌對Cr（Ⅵ）的還原作用主要表現(xiàn)在兩方面：一方面是寡氧單胞菌細胞表面的官能團吸附作用，吸附后的Cr（Ⅵ）在還原酶催化下自發(fā)還原為Cr（Ⅲ），或通過硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白進入細胞后在胞內(nèi)被還原[22]。另一方面則是寡養(yǎng)單胞菌在土壤中受到Cr（Ⅵ）脅迫后，為建立Cr（Ⅵ）耐受性，產(chǎn)生了Cr（Ⅵ）還原酶并發(fā)生電子轉(zhuǎn)移從而還原土壤中的Cr（Ⅵ）[23]。然而，針對實際Cr污染場地，添加外源微生物，其自身種群的存活或消亡以及是否保留對重金屬的耐受性，取決于非生物因素以及生物因素[24]。因非生物因素難以控制，外源微生物進入土壤后的群落豐度及其功能也隨之具有不確定性。低、高含量的Cr（Ⅵ）污染土壤中，游離菌（F處理）的Cr（Ⅵ）去除能力呈現(xiàn)出初期增加、中后期降低的趨勢，表明游離的寡養(yǎng)單胞菌對土壤Cr（Ⅵ）的去除能力隨著時間的延長逐漸減弱，而包埋菌（MIF處理）對Cr（Ⅵ）的去除率隨時間延長而逐漸增加，這可能是因為菌劑外圍包埋的紅薯淀粉具有多孔結(jié)構(gòu)、較大的比表面積及碳源供給能力，可為內(nèi)部微生物的生長和繁殖提供生長吸附位點和營養(yǎng)供應(yīng)等有利條件，增加了其生長和代謝活性，進而增強了對Cr（Ⅵ）的修復(fù)效率。此外，紅薯淀粉（MI處理）本身也具有Cr（Ⅵ）吸附和還原能力（圖2），這與張麗等[25]的研究一致。

2.2 紅薯淀粉膠囊包埋微生物修復(fù)對Cr（Ⅵ）污染土壤酶活性的影響

土壤酶在土壤污染物的解毒與代謝方面起著重要作用，是評價土壤健康的重要指標[26]。Cr（Ⅵ）污染會抑制土壤中的酶活性，因此土壤酶活性可以作為衡量Cr（Ⅵ）修復(fù)效果的指標之一[23]。

2.2.1 脲酶

分析可知，低、高含量Cr（Ⅵ）污染土壤（圖3）中，F(xiàn)處理下的脲酶活性隨時間的延長呈下降趨勢，與該處理的初期相比，末期分別顯著下降了0.05、0.04 mg·g^-1·d^-1；MI處理下的脲酶活性隨時間的延長無顯著變化；MIF處理脲酶活性隨時間延長呈上升趨勢，與該處理的初期相比，末期分別上升了0.04、0.09 mg·g^-1·d^-1。在處理末期，與CK相比，低含量Cr（Ⅵ）污染土壤中F、MI、MIF處理的脲酶活性分別顯著提高了0.04、0.08、0.13 mg·g-1·d^-1，與F處理相比，MIF處理脲酶活性顯著增加了0.09 mg·g^-1·d^-1；高含量Cr（Ⅵ）污染土壤中F、MI、MIF 處理下的脲酶活性分別顯著上升了0.02、0.03、0.17 mg·g^-1·d^-1，與F處理相比，MIF處理下的脲酶活性顯著增加了0.15 mg·g^-1·d^-1（Plt;0.05）。

2.2.2蔗糖酶

蔗糖酶是影響糖類生理代謝的一種重要酶，能夠促進土壤中的蔗糖水解成單糖，給土壤中的微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)，也是檢測重金屬污染程度的一種間接生物指示劑[27]。土壤中蔗糖酶活性變化規(guī)律與脲酶變化規(guī)律基本一致。分析可知，低、高含量Cr（Ⅵ）污染土壤中（圖4），F(xiàn)處理下的蔗糖酶活性隨時間的延長呈下降趨勢，與該處理的初期相比，末期分別下降了16.93、15.42 mg·g^-1·d^-1；MI處理下的蔗糖酶活性隨時間的延長無顯著變化；MIF處理蔗糖酶活性隨時間延長呈上升趨勢，與該處理的初期相比，末期分別上升了12.18、9.32 mg·g^-1·d^-1。在處理末期，與CK 相比，低含量Cr（Ⅵ）污染土壤中F、MI、MIF處理的蔗糖酶活性分別顯著提高了11.33、23.68、32.20 mg·g^-1·d^-1，與F 處理相比，MIF 處理蔗糖酶活性顯著增加了20.87 mg·g^-1·d^-1；高含量Cr（Ⅵ）污染土壤中F、MI、MIF 處理下的蔗糖酶活性分別顯著上升了9.91、18.31、34.43 mg·g^-1·d^-1，與F處理相比，MIF處理下的蔗糖酶活性顯著增加了24.52 mg·g-1·d^-1（Plt;0.05）。

2.2.3 過氧化氫酶

土壤中CAT活性變化與上述兩種土壤酶的變化情況基本一致。分析可知，低、高含量Cr（Ⅵ）污染土壤中（圖5），F(xiàn)處理下的CAT活性隨時間的延長呈下降趨勢，與該處理的初期相比，末期分別下降了0.31、0.29 mg·g^-1·h^-1；MI處理下的CAT活性隨時間的延長無變化趨勢；MIF處理CAT活性隨時間延長呈上升趨勢，與該處理的初期相比，末期分別上升了0.60、0.65mg·g-1·h^-1。在處理末期，與CK相比，低含量Cr（Ⅵ）污染土壤中F、MI、MIF 處理的CAT 活性分別顯著提高了0.70、0.57和1.83 mg·g^-1·h^-1，與F處理相比，MIF處理CAT活性顯著增加了1.13 mg·h-1·g^-1；高含量Cr（Ⅵ）污染土壤中F、MI、MIF 處理下的CAT 活性分別顯著上升了0.64、0.63、1.74 mg·h^-1·g^-1，與F 處理相比，MIF 處理下的CAT 活性顯著增加了1.11 mg·g-1·h^-1（Plt;0.05）。

土壤酶是微生物、植物根系、土壤動物分泌或釋放的具有催化活性的蛋白質(zhì)，其參與有機質(zhì)分解、土壤微生物能量和營養(yǎng)獲取、污染物降解等重要的生態(tài)過程[28]，因此，土壤酶活性是土壤質(zhì)量的一個重要評價指標，通常用來表征土壤重金屬修復(fù)效果。本研究結(jié)果表明，土壤添加30 mg·kg^-1和100 mg·kg^-1 Cr（Ⅵ）后，其脲酶、蔗糖酶、CAT活性都大幅度下降，這是由于重金屬對土壤酶活性存在著抑制作用[29]。以往許多的研究表明，使用微生物菌劑都會影響土壤酶的活性。土壤微生物數(shù)量與土壤酶具有顯著的相關(guān)性，微生物數(shù)量的增多能夠改善土壤酶活性，從而提高土壤養(yǎng)分循環(huán)速率，土壤也隨之朝著良好健康的狀態(tài)發(fā)展[30]。與低、高含量Cr（Ⅵ）脅迫的對照土壤相比，F(xiàn)處理土壤的脲酶、蔗糖酶、CAT的活性在試驗初期上升，中后期下降。這可能與寡養(yǎng)單胞菌直接暴露在Cr（Ⅵ）中，隨時間延長細胞內(nèi)外受到Cr（Ⅵ）脅迫，致使寡養(yǎng)單胞菌生長代謝變慢并導(dǎo)致其對Cr（Ⅵ）的強還原力[31]減弱有關(guān)。而與F處理相比，MIF處理下的脲酶、蔗糖酶、CAT活性顯著增加，且隨處理時間的延長而持續(xù)上升。這可能是由于紅薯淀粉可以供給多糖[32]，給包埋在體內(nèi)的寡養(yǎng)單胞菌在一定時間內(nèi)提供一定的營養(yǎng)物質(zhì)及生存空間，從而保護和支持寡養(yǎng)單胞菌的活性，使其發(fā)揮出最大程度的修復(fù)能力。除此之外，包埋材料紅薯淀粉基本組成單位是脫水葡萄糖殘基[33]，因糖苷鍵和共價鍵水解斷裂產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)移會有效地還原Cr（Ⅵ），這也是目前被證實的有機物的還原方式[34]。Cr（Ⅵ）先與小分子淀粉發(fā)生雙電子轉(zhuǎn)移，生成Cr（Ⅳ），C—C 鍵斷裂，發(fā)生單電子轉(zhuǎn)移，生成Cr（Ⅲ），Cr（Ⅲ）又與土壤中一部分OH^-作用產(chǎn)生Cr（OH）₃[18，35]，降低Cr（Ⅵ）的生物有效性，從而提高土壤酶的活性。這與下文中MI與MIF處理下，Cr的水溶態(tài)和酸可提取態(tài)占比減少的結(jié)果一致。綜上所述，MIF處理可以增強包埋菌的活性與修復(fù)能力，其包埋材料也有還原Cr（Ⅵ）的能力，以此提高Cr污染土壤酶活性，改善土壤環(huán)境。

2.3 紅薯淀粉膠囊包埋微生物修復(fù)Cr（Ⅵ）污染土壤對土壤pH和Cr形態(tài)變化的影響

土壤pH是土壤理化性質(zhì)的重要指標之一，對土壤所含養(yǎng)分形態(tài)以及有效性具有重要影響。從表1可見，在30、100 mg·kg^-1 Cr（Ⅵ）脅迫下，土壤pH顯著降低，土壤呈弱酸性。在低、高含量Cr（Ⅵ）脅迫的后期，與CK相比，F(xiàn)、MI、MIF處理pH顯著增加了0.91、0.81、1.46和0.97、0.84、1.46；與F處理相比，MIF處理pH顯著增加了0.55和0.49（Plt;0.05）。

環(huán)境中不同賦存形態(tài)Cr的遷移性和生物毒性存在很大差異。水溶態(tài)和酸可提取態(tài)屬于可交換態(tài)，易被生物吸收；可還原態(tài)能與鐵錳等氧化物結(jié)合，生物毒性較低；可氧化態(tài)可與有機物和硫化物結(jié)合，生物毒性很低；殘渣態(tài)穩(wěn)定存在于土壤中，對環(huán)境的威脅最小也不容易被生物利用[36]。在低、高含量Cr（Ⅵ）脅迫下（圖6），F(xiàn) 處理的可交換態(tài)隨時間的延長而升高，分別增加了7.33%、10.17%；MI 處理的可交換態(tài)隨時間的延長而降低，分別減少了9.34%、10.74%；MIF處理的可交換態(tài)含量隨著處理時間的延長而降低，分別減少了14.32%、33.18%。在處理末期，低、高含量Cr（Ⅵ）脅迫下，與CK相比，F(xiàn)、MI、MIF中可交換態(tài)的占比分別減少了19.11%、23.26%、45.54%和16.11%、28.18%、59.42%；與F處理相比，MIF處理下，Cr的可交換態(tài)分別減少了26.43%、43.31%。整個處理過程中，可還原態(tài)Cr在所有處理中的占比均無明顯變化。

F處理的可氧化態(tài)占比隨時間的延長而降低，低、高含量Cr（Ⅵ）脅迫下分別減少了9.18%、2.02%；MI 處理的可氧化態(tài)在低Cr（Ⅵ）脅迫下隨時間的延長沒有明顯變化，在高Cr（Ⅵ）脅迫下隨時間的延長而增加了4.63%；MIF處理的可氧化態(tài)占比隨著處理時間的延長而減小，低、高Cr（Ⅵ）含量下分別減少了13.58%、9.49%。在處理末期，與CK相比，F(xiàn)、MI、MIF中可氧化態(tài)的占比分別減少了8.775%、6.765%、8.69%和7.775%、13.585%、21.68%；與F處理相比，在低Cr（Ⅵ）脅迫下，MIF 處理的Cr可氧化態(tài)沒有顯著差異，而在高Cr（Ⅵ）脅迫下，Cr 可氧化態(tài)增加了13.91%。低Cr（Ⅵ）脅迫下，F(xiàn)處理的殘渣態(tài)占比隨時間的延長無明顯變化，高Cr（Ⅵ）脅迫下，隨時間的延長而減少了8.97%；MI、MIF 處理的殘渣態(tài)占比均隨時間的延長而增加，低、高含量Cr（Ⅵ）脅迫下分別增加了12.23%、26.25% 和6.93%、25.79%。在處理末期，與CK 相比，低、高含量Cr（Ⅵ）脅迫下F、MI、MIF中殘渣態(tài)的占比分別增加了9.07%、17.21%、36.44%和8.08%、15.74%、38.17%；與F 處理相比，MIF 處理下，Cr的殘渣態(tài)占比分別增加了19.26%、30.09%。

趙少婷等[37]的研究表明，在未受Cr 污染和輕度Cr污染的土壤中，Cr主要以殘渣態(tài)存在，而在Cr污染嚴重的土壤中，則主要以水溶態(tài)和酸可提取態(tài)存在，這與本研究結(jié)論一致。土壤pH是影響重金屬吸附-解吸行為和生物有效性的關(guān)鍵因素[38]，F(xiàn)、MI、MIF處理下土壤的pH 值均呈弱堿性（表1），這有效降低了土壤中水溶態(tài)和酸可提取態(tài)的含量（圖6）[39-40]，表明3種處理均會影響土壤的pH 值，進而影響Cr 形態(tài)變化。此外，包埋壁材紅薯淀粉的糖苷鍵和共價鍵被土壤中的微生物水解可斷裂產(chǎn)生電子和OH-，電子加速Cr（Ⅵ）還原為Cr（Ⅲ），產(chǎn)生的OH-與Cr（Ⅲ）作用，形成的Cr（OH）₃ 穩(wěn)定化合物也有助于降低土壤中水溶態(tài)Cr和酸可提取態(tài)Cr的占比[33]。F處理和MIF處理也均可以通過生物還原途徑，增加土壤中生物可利用性強的Cr（Ⅵ）向生物可利用性弱的Cr（Ⅲ）轉(zhuǎn)化，并通過土壤pH的變化沉淀Cr（Ⅲ），從而助力了土壤中可水溶態(tài)Cr和酸可提取態(tài)Cr占比的下降及殘渣態(tài)Cr的上升。

2.4 紅薯淀粉膠囊包埋微生物修復(fù)Cr（Ⅵ）污染土壤后對高羊茅地上、地下部分總Cr含量的影響

在低（圖7a、圖7c）、高（圖7b、圖7d）含量Cr（Ⅵ）脅迫下，與CK相比，F(xiàn)、MI、MIF處理下的高羊茅地上部分總Cr 含量分別顯著降低了2.02、3.60、5.92 mg·kg^-1和7.40、10.60、19.57 mg·kg^-1，地下部分總Cr含量分別顯著降低了16.80、24.10、30.80 mg·kg^-1和44.08、47.98、59.53 mg·kg^-1。低、高含量Cr（Ⅵ）脅迫下，與F處理相比，MIF處理后的高羊茅地上部分、地下部分的總Cr 含量分別顯著減少了3.90、14.00 mg·kg^-1 和12.17、18.45 mg·kg^-1（Plt;0.05）。

高羊茅是一種常見的多年生冷季型草坪草，也是溫帶地區(qū)重要的禾草類牧草。趙樹蘭等[41]研究發(fā)現(xiàn)高羊茅根系和莖葉具有富集重金屬的能力；Zhu等[42]的研究發(fā)現(xiàn)，土壤中生長的高羊茅對重金屬具有耐受能力和吸收能力。本試驗中，利用高羊茅評估不同處理對Cr（Ⅵ）污染土壤修復(fù)效果表明，在低含量與高含量Cr（Ⅵ）脅迫下，與CK相比，F(xiàn)、MI、MIF處理之后的高羊茅地上、地下部總Cr含量均顯著降低，且MIF處理下植物地上和地下部總Cr含量最低，這與上述土壤中Cr形態(tài)差異變化一致。紅薯淀粉膠囊包埋寡養(yǎng)單胞菌有效地降低了土壤中Cr的可交換態(tài)含量，降低了Cr向植物轉(zhuǎn)移的能力。

2.5 紅薯淀粉膠囊包埋微生物修復(fù)Cr（Ⅵ）污染土壤后對高羊茅葉片中丙二醛和活性氧含量（以鮮質(zhì)量計）的影響

在植物的非生物脅迫研究中常用活性氧和MDA含量來反映植物細胞膜脂過氧化損傷程度，且兩者含量常與脅迫強度呈正相關(guān)關(guān)系（圖8）。與CK相比，30、100 mg·kg^-1 Cr（Ⅵ）脅迫下高羊茅H₂O₂含量分別增加18.82、35.52 μmol·mg^-1，MDA 含量分別增加了2.82、7.523 μmol·g^-1。在低、高含量Cr（Ⅵ）脅迫下，與CK相比，F(xiàn)、MI、MIF處理下H₂O₂含量分別顯著降低了10.70、6.37、14.76 μmol· mg^-1 和19.74、16.48、26.14μmol·mg^-1，MDA含量分別顯著降低了1.50、0.97、2.22μmol·g^-1和4.74、3.48、6.14 μmol·g^-1。與F處理相比，MIF處理高羊茅地上部分中H₂O₂含量分別顯著降低了4.06、6.40 μmol·mg^-1，MDA含量分別顯著降低了0.72、1.40 μmol·g^-1（Plt;0.05）。結(jié)果表明，Cr（Ⅵ）含量越高，高羊茅地上部分累積的H₂O₂和MDA越多，與F處理相比，MIF 處理更有效地降低了高羊茅H₂O₂和MDA 的累積。

2.6 紅薯淀粉膠囊包埋微生物修復(fù)Cr（Ⅵ）污染土壤后對高羊茅葉片中抗氧化酶含量（以鮮質(zhì)量計）的影響

植物生長過程中，細胞產(chǎn)生活性氧作為信號分子調(diào)控植物受到的非生物脅迫反應(yīng)[43]?？寡趸烙到y(tǒng)具有維持植物體內(nèi)活性氧平衡的功能[44]。該系統(tǒng)包括兩大類：一類是非酶促抗氧化物質(zhì)，其中最為重要的是水溶性抗壞血酸（Asc），其次是谷胱甘肽（GSH）；另一類是酶促抗氧化劑，包括超氧化物歧化酶（SOD）、POD和CAT[45]。植物抗氧化調(diào)控系統(tǒng)中提高酶活性和抗氧化物的表達量是作物抵御逆境脅迫的關(guān)鍵（圖9）。與CK相比，30、100 mg·kg^-1 Cr（Ⅵ）脅迫顯著增加了高羊茅POD 和CAT活性，POD 活性分別顯著增加19.02、34.13 μg^-1·min^-1；CAT活性分別顯著增加了9.44、19.45 μg^-1·min^-1。在低、高Cr（Ⅵ）含量脅迫下，與CK處理相比，F(xiàn)、MI、MIF處理下POD活性分別顯著降低了8.69、4.20、13.44 μg^-1 ·min^-1 和9.81、5.55、14.21 μg^-1·min^-1；CAT 活性分別顯著降低了5.39、3.16、7.39 μg^-1·min^-1 和5.77、3.41、9.17 μg^-1·min^-1。與F 處理相比，MIF 處理高羊茅地上部分中POD活性分別顯著降低了4.75、4.40 μg^-1·min^-1，CAT活性分別顯著降低了2.01、3.40 μg^-1·min^-1（Plt;0.05）。

在植物正常的生理代謝過程中，植物細胞通過實時生成和清除活性氧來維持細胞ROS的動態(tài)平衡[46]，而重金屬脅迫會打破植物體內(nèi)的這種平衡，導(dǎo)致MDA 和H₂O₂ 的累積[47]。本研究中，Cr（Ⅵ）含量增高會導(dǎo)致高羊茅地上部分的H₂O₂ 和MDA 含量顯著上升，再通過POD 和CAT等抗氧化系統(tǒng)聯(lián)合抵抗重金屬脅迫[48]。其中，MDA 和H₂O₂ 的累積與抗氧化系統(tǒng)的酶活性從高到低為MIgt;Fgt;MIF，表明游離的寡養(yǎng)單胞菌和紅薯淀粉材料本身不但具有降低土壤毒性的能力，還能緩解高羊茅受到的重金屬脅迫，因此紅薯淀粉膠囊包埋寡養(yǎng)單胞菌修復(fù)的效果更佳。

3 結(jié)論

（1）在30、100 mg·kg^-1 Cr（Ⅵ）脅迫下，與游離菌處理相比，包埋菌在處理后期呈現(xiàn)出顯著高的Cr（Ⅵ）去除率。

（2）在30、100 mg·kg^-1 Cr（Ⅵ）脅迫下，相較于游離菌處理，包埋菌處理顯著提升了土壤脲酶、蔗糖酶及過氧化氫酶的活性，并隨著處理時間的延長而呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，表明包埋型菌劑處理后土壤的功能性酶活性有了明顯的恢復(fù)。

（3）包埋菌處理顯著增加了土壤pH，減少了土壤中水溶態(tài)Cr的比例，增加了土壤中殘渣態(tài)Cr的占比。

（4）Cr（Ⅵ）污染土壤修復(fù)30d后，種植高羊茅15d，與游離菌處理相比，包埋菌處理下，高羊茅植株的地上和地下部分的Cr含量顯著降低。同時，高羊茅葉片中的丙二醛、過氧化氫含量及過氧化物酶、過氧化氫酶活性也顯著減少，表明包埋菌處理顯著降低了Cr（Ⅵ）在高羊茅體內(nèi)的累積及對其的氧化損傷。