周宇東，姚艷玲，孫世元*，王文宇，劉駱強(qiáng)，管佳麗，張娜，李慧玲

（1.嘉興市食品藥品與產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院，浙江 嘉興 314050）

0 引言

牛皮纖維是把藍(lán)濕牛皮革通過(guò)溶脹、解纖、清洗分離、烘干、開(kāi)松、梳理等一系列工藝技術(shù)處理得到的天然膠原蛋白纖維，具有獨(dú)特的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，優(yōu)良的拉伸、吸濕和阻燃性能以及突出的抗菌、防霉功能。牛皮纖維作為一種新型的紡織原料，由于其優(yōu)良特性以及紡織可加工性，可開(kāi)發(fā)休閑服用產(chǎn)品如休閑牛仔布、休閑粗紡呢面料、西服時(shí)裝面料、高檔時(shí)裝面料、風(fēng)衣等，貼身服用產(chǎn)品如內(nèi)衣、襪子等，還可開(kāi)發(fā)天然牛皮纖維皮革制品、植絨布（仿真皮）、水刺無(wú)紡布等，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，年產(chǎn)值數(shù)十億元，已經(jīng)初具市場(chǎng)規(guī)模，具有極大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景[1-2]。

紡織行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)FZ/T 01155-2020《紡織品定量化學(xué)分析牛皮纖維與某些其他纖維的混合物》于2021 年12 月25 日發(fā)布[3]。該標(biāo)準(zhǔn)主要規(guī)定了采用常見(jiàn)化學(xué)助劑，對(duì)牛皮纖維與常規(guī)天然纖維、化學(xué)纖維的混合物進(jìn)行鑒別的方法，但是對(duì)于牛皮纖維與其他天然皮纖維，如羊皮纖維、豬皮纖維等的混合物，無(wú)法進(jìn)行鑒別。主要原因在于，牛皮纖維雖然與羊皮纖維、豬皮纖維等其他皮纖維的原始形態(tài)（在皮中形態(tài)）在細(xì)微結(jié)構(gòu)上有所區(qū)別，但是受機(jī)械解纖方法所限，制備得到的皮纖維在外觀形態(tài)上很相似，都是束形纖維并呈現(xiàn)一定劈裂狀，鑒別存在很大困難[4]。并且因動(dòng)物皮纖維主要成分為I 型膠原蛋白[5]，采用常規(guī)化學(xué)方法無(wú)法對(duì)其混合物進(jìn)行定量分析。

目前，市場(chǎng)上主要存在的是牛皮纖維。但紡織品中少量摻雜的其他動(dòng)物皮纖維，不但會(huì)對(duì)牛皮纖維紡織品含量分析帶來(lái)困難，也會(huì)讓監(jiān)管形同虛設(shè)，維權(quán)紙上談兵，企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量得不到保證，影響皮纖維行業(yè)持續(xù)健康發(fā)展，更對(duì)出口貿(mào)易帶來(lái)一定的安全隱患。因此，對(duì)牛皮纖維與其他皮纖維的混合物進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別的研究已經(jīng)迫在眉睫。本研究為實(shí)現(xiàn)皮纖維產(chǎn)品中常見(jiàn)原料黃牛、綿羊源性成分的鑒別與定量分析，采用實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)比較了不同退火溫度下，黃牛、綿羊源性成分的擴(kuò)增效果，利用兩種成分濃度比值的對(duì)數(shù)與兩者對(duì)應(yīng)的閾值循環(huán)數(shù)（Ct）之差存在線性關(guān)系，建立了黃牛、綿羊皮纖維的雙重定量檢測(cè)方法。本研究從紡織產(chǎn)業(yè)、檢驗(yàn)檢測(cè)行業(yè)發(fā)展的實(shí)際需求出發(fā)，結(jié)合現(xiàn)有相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)牛皮纖維與羊皮纖維的生物分子基因特性對(duì)其進(jìn)行鑒別，研制基于DNA 分子技術(shù)的牛皮纖維鑒別方法，為國(guó)家、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供技術(shù)參考，具有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、社會(huì)效益和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及樣本來(lái)源

DNA 提取試劑盒：TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0（寶生物工程（大連）有限公司）。

瓊脂糖（Agarose Regular）、50×TAE 緩沖液：生工生物工程（上海）股份有限公司；DNA Marker（100～500 bp）、PCR 預(yù)混試劑（TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye）、實(shí)時(shí)熒光PCR 試劑：Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）（寶生物工程（大連）有限公司）。

實(shí)驗(yàn)用的皮纖維樣品由嘉興九沐新材料科技有限公司提供。

1.1.2 引物探針

此研究采用的黃牛、綿羊的引物探針參考SB/T 38164-2019標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)儀器的熒光通道設(shè)計(jì)探針，具體序列見(jiàn)表1，合成公司為生工生物工程（上海）股份有限公司。

表1 目標(biāo)源性成分及其引物序列

1.1.3 儀器設(shè)備

此研究用到儀器設(shè)備包括：Tavanced 96SG Biometra PCR 儀（德國(guó)耶拿分析儀器股份公司）、Compact S 水平電泳儀（德國(guó)耶拿分析儀器股份公司）、Uvsolo 2 touch 凝膠成像儀（德國(guó)耶拿分析儀器股份公司）、Legend Micro 21R 離心機(jī)（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）、MK 10 干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司）、MM400 混合型研磨儀（德國(guó)萊馳Retsch 公司）、Roche LightCycler 480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR（羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 增菌液中DNA 模板提取

分別收集黃牛皮纖維、綿羊皮纖維，把上述樣品剪碎，采用液氮對(duì)其進(jìn)行瞬時(shí)冷凍，用混合型研磨儀研磨成粉末狀；稱取20 mg 樣本于1.5 mL 離心管中，加180 μL 裂解液、20 μL 蛋白酶K 和10 μL 的RNase A，56 ℃溫育過(guò)夜，當(dāng)有材料無(wú)法裂解完全時(shí)，需要經(jīng)12 000 r/min 離心2 min。取上清液于新的1.5 mL離心管中，加200 μL 緩沖液和200 μL 100%乙醇，充分混合均勻。由于皮纖維經(jīng)過(guò)一定的加工，其DNA 含量較低，因此在稱取樣本時(shí)需要增大樣本量，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)稱樣3 次，共60 mg 左右，按上述方法進(jìn)行裂解，搜集全部裂解液。將裂解液分次全部加入吸附小柱內(nèi)，將吸附小柱裝入配套收集管中，12 000 r/min 離心2 min，棄去濾液；加入500 μL 緩沖液A，12 000 r/min 離心1 min，棄去濾液；然后加入700 μL 緩沖液B，12 000 r/min 離心1 min鐘，棄去濾液，重復(fù)一次；將小柱放置于收集管中，12 000 r/min 離心2 min，棄去濾液；將吸附小柱放置于新的1.5 mL 離心管中，在柱膜中央處加入50 μL 溫浴至65 ℃的洗脫液，靜置5 min 后，12 000 r/min 離心2 min，收集的液體即為提取的DNA 溶液。

1.2.2 普通PCR 定性檢測(cè)

分別配制黃牛、綿羊的單反應(yīng)體系：Premix Taq（TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye）25 μL、上游引物（20 μmol/L)1 μL、下游引物（20 μmol/L）1 μL、DNA 模版2 μL，用ddH2O 補(bǔ)齊至50 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃30 s、58 ℃1 min、72 ℃1 min，40 個(gè)循環(huán)。采用電泳及凝膠成像分析檢測(cè)結(jié)果，電泳電壓設(shè)置為90 V，電流500 mA，電泳時(shí)間約為40 min。

1.2.3 雙重?zé)晒舛縋CR 檢測(cè)

（1）雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法

把黃牛、綿羊的上游引物（10 μM）、下游引物（10 μM）分別進(jìn)行等體積混合，制成上游混合引物和下游混合引物，同時(shí)把黃牛、綿羊的探針（10 μM）也按等體積進(jìn)行混合，制成混合探針。反應(yīng)體系配制：Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2×）10μL，上游混合引物0.4 μL，下游混合引物0.4 μL，混合探針0.8 μL，樣本DNA 為2 μL，無(wú)菌去離子水6.4 μL，反應(yīng)體系共20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，退火溫度58 ℃，延伸1 min，共40 個(gè)循環(huán)。

（2）靈敏度實(shí)驗(yàn)

取黃牛、綿羊的DNA 溶液，分別用無(wú)菌去離子水稀釋至10 ng/μL，然后采用10 倍稀釋的方法將DNA 溶液進(jìn)行梯度稀釋，分別制成一組1、10-1、10-2、10-3、10-4ng/μL 系列的DNA 溶液，進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)。

（3）特異性實(shí)驗(yàn)

選取黃牛、綿羊和豬的混合DNA 溶液，按照（1）配制反應(yīng)體系、設(shè)置PCR 反應(yīng)條件，對(duì)黃牛、綿羊的雙重引物和探針進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 雙重?zé)晒舛繕?biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)熒光定量PCR 的數(shù)學(xué)原理，當(dāng)兩個(gè)混合物反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行、擴(kuò)增效率非常接近時(shí)，可以近似地認(rèn)為兩者的混合DNA 溶液中，兩種成分濃度比值的對(duì)數(shù)與兩者對(duì)應(yīng)的Ct 值之差存在線性關(guān)系[6]。通過(guò)該方法，可以利用Ct 值之差檢測(cè)兩者成分的比例，進(jìn)而檢測(cè)皮纖維的聲稱含量與實(shí)際是否一致。鑒于在日常生活中黃牛皮和綿羊皮使用較為廣泛，因此本文選取黃牛、綿羊皮纖維為研究對(duì)象，采用（1）建立的雙重檢測(cè)方法，以黃牛檢測(cè)Ct 值和綿羊檢測(cè)Ct 值之差的平均值為橫坐標(biāo)，黃牛和綿羊的DNA含量比值的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通PCR 定性檢測(cè)

將黃牛皮纖維和綿羊皮纖維按1.2.1 方法提取DNA，然后根據(jù)1.2.2 條件進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。由圖可知，黃牛皮纖維和綿羊皮纖維DNA 能有效擴(kuò)增，且擴(kuò)增片段大小為92 bp 和137 bp，符合目標(biāo)物片段大小。

圖1 黃牛皮纖維擴(kuò)增產(chǎn)物（注：1 通道為Marker(500 bp)，2、3通道為黃牛皮纖維擴(kuò)增產(chǎn)物）。

圖2 綿羊皮纖維擴(kuò)增產(chǎn)物（注：1 通道為Marker(500 bp)，2、3通道為綿羊皮纖維擴(kuò)增產(chǎn)物）。

在黃牛、綿羊單體系中，加入黃牛、綿羊和豬的混合DNA 溶液，并把混合溶液稀釋10 倍，同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠成像結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。由圖可知，黃牛和綿羊的引物特異性較好，反應(yīng)體系中黃牛的擴(kuò)增片段大小為92 bp，綿羊的擴(kuò)增片段大小為137 bp，大小都符合目標(biāo)物片段大小，且在不同的DNA 濃度下沒(méi)有出現(xiàn)交叉反應(yīng)的現(xiàn)象。綜上所述，方法采用的黃牛、綿羊的引物特異性較好，能對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定性分析。

圖3 混合DNA溶液中黃牛源性成分?jǐn)U增結(jié)果（注：1 通道為Marker(500 bp)，2、3 通道DNA濃度為0.1 ng/μL，4、5 通道DNA濃度為1 ng/μL）。

圖4 混合DNA溶液中綿羊源性成分的擴(kuò)增結(jié)果（注：1 通道為Marker(500 bp)，2、3 通道DNA濃度為0.1 ng/μL，4、5 通道DNA濃度為1 ng/μL）。

2.2 雙重?zé)晒舛縋CR 檢測(cè)

2.2.1 雙重?zé)晒舛縋CR 方法建立

在實(shí)際樣品中可能同時(shí)混有黃牛和綿羊皮纖維，此時(shí)在有效定性的前提下需要能進(jìn)行定量檢測(cè)，以期對(duì)產(chǎn)品成分進(jìn)行有效鑒定。為了能進(jìn)行混合樣本的雙重檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)在設(shè)計(jì)探針時(shí)選取FAM 和CY5 兩個(gè)通道，并進(jìn)行了方法優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)比較了58、60 ℃兩種退火溫度下的擴(kuò)增效果，退火溫度在58、60 ℃時(shí)，黃牛源性成分都能有效擴(kuò)增，但是在退火溫度60 ℃時(shí)，綿羊源性成分不能有效擴(kuò)增，而退火溫度為58 ℃時(shí)綿羊能有效擴(kuò)增，綿羊的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6。

圖5 60 ℃時(shí)綿羊源性成分的擴(kuò)增圖譜

圖6 58 ℃時(shí)綿羊源性成分的擴(kuò)增圖譜

2.2.2 靈敏度實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)將黃牛和綿羊的DNA 溶液均稀釋到10 ng/μL，并稀釋2 種DNA 溶液至1 ng/μL，然后按照10 倍稀釋梯度進(jìn)行稀釋，制成1、10-1、10-2、10-3、10-4ng/μL 的DNA 稀釋液，在雙重檢測(cè)體系中進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度擴(kuò)增時(shí)做平行實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖7、圖8。

圖7 梯度稀釋黃牛DNA溶液的熒光PCR 擴(kuò)增圖譜

圖8 梯度稀釋綿羊DNA溶液的熒光PCR 擴(kuò)增圖譜

計(jì)算梯度實(shí)驗(yàn)Ct 值的平均值，結(jié)果見(jiàn)表2。由結(jié)果可知，黃牛和綿羊源性成分在雙重檢測(cè)體系中，均能有效擴(kuò)增，且隨著DNA濃度的降低，Ct值逐漸增大，在10-4ng/μL 時(shí)，兩者的Ct 值均超過(guò)35。因此，黃牛和綿羊在雙重檢測(cè)體系中，最低檢測(cè)濃度可以達(dá)到10-3ng/μL，即方法檢出限均為10-3ng/μL。

表2 黃牛、綿羊靈敏度實(shí)驗(yàn)的Ct 值

2.2.3 特異性實(shí)驗(yàn)

在黃牛綿羊雙重檢測(cè)體系中，采用黃牛、綿羊和豬的DNA 混合溶液進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增條件同（1），結(jié)果見(jiàn)圖9、圖10。

圖9 黃牛源性成分熒光PCR 擴(kuò)增圖譜

圖10 綿羊源性成分熒光PCR 擴(kuò)增圖譜

由上圖可知，在常見(jiàn)的動(dòng)物皮纖維混合DNA溶液中，黃牛和綿羊源性成分能通過(guò)本文建立的雙重檢測(cè)體系被檢出，而豬源性未被檢出，說(shuō)明雙重檢測(cè)體系采用的引物和探針特異性較好，未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，能滿足檢測(cè)要求。

2.2.4 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及含量檢測(cè)

將黃牛皮纖維和綿羊皮纖維按表3 的比例進(jìn)行混合，制成標(biāo)準(zhǔn)混合物各10 g，剪碎后，將它們用液氮瞬時(shí)冷凍，采用混合型研磨儀將其研磨粉碎，制成混合纖維粉，按照1.2.1 方法提取DNA，每個(gè)樣本做6 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

表3 黃牛、綿羊皮纖維混合物制備比例

以黃牛Ct 檢測(cè)值和綿羊Ct 檢測(cè)值6 個(gè)平行樣差值的平均值為橫坐標(biāo)，黃牛和綿羊的比值的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，對(duì)9 個(gè)點(diǎn)進(jìn)行曲線擬合，所得線性回歸方程為y=-0.3037x-0.2996，相關(guān)系數(shù)R2 為0.995 4，見(jiàn)圖11。

圖11 黃牛綿羊皮纖維定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

實(shí)驗(yàn)?zāi)M實(shí)際樣本，制作含黃牛皮纖維50%、綿羊皮纖維50%的樣本（黃牛與綿羊的含量比值為1），按照本文建立的定量檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得的Ct 值差值的平均值為-0.91，通過(guò)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算，所得兩者含量比值的對(duì)數(shù)值為-0.023 23。因此，結(jié)果顯示樣本中黃牛與綿羊的含量比值為0.95，與理論值相差0.05，偏差為5%，基本能反映樣本中兩種皮纖維的含量比。

3 結(jié)語(yǔ)

（1）以市場(chǎng)上常見(jiàn)的黃牛皮纖維、綿羊皮纖維為研究對(duì)象，采用多次稱樣的方法對(duì)DNA 進(jìn)行富集提取，該方法能有效提高皮纖維的DNA 濃度。（2）在雙重檢測(cè)體系下，比較了不同退火溫度的擴(kuò)增效果，當(dāng)退火溫度設(shè)置為58 ℃時(shí)，黃牛和綿羊源性成分均能有效擴(kuò)增，且沒(méi)有非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象，該方法的引物、探針特異性較好，且方法的檢出限為10-3ng/μL。實(shí)驗(yàn)建立的雙重?zé)晒釶CR 檢測(cè)方法能有效地對(duì)混合樣本中的黃牛、綿羊源性成分進(jìn)行檢測(cè)。（3）利用黃牛、綿羊兩種源性成分Ct值的差與兩者含量比值的對(duì)數(shù)值存在線性關(guān)系，建立了黃牛、綿羊皮纖維雙重?zé)晒舛縋CR 的檢測(cè)方法。方法建立的定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)性能達(dá)到0.99 以上。通過(guò)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的研究，建立了混合樣本中黃牛與綿羊成分比例的檢測(cè)方法，為皮纖維樣本中成分的定量分析提供方法參考。