李 菁，蔡曉鈞，楊仁義，王智檳，朱姝靜，瞿 熒，鐘 崇

（1湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；4廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405）

原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）在我國(guó)尤為高發(fā)，發(fā)病率和死亡率分別位居我國(guó)第四和第二［1-2］。PLC 病理分型75%～85%為肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），其中因大多數(shù)患者確診時(shí)為中晚期，已喪失根治性治療機(jī)會(huì)，故全身治療尤為重要［1，3］。但全身治療常常因發(fā)生耐藥、身體基礎(chǔ)條件差無(wú)法耐受不良反應(yīng)等因素而無(wú)法繼續(xù)使用，導(dǎo)致無(wú)法達(dá)到預(yù)期療效。相比之下，中醫(yī)藥具有多靶點(diǎn)不易耐藥、低毒性副作用小和成本低等特點(diǎn)，是治療PLC 的一種有前景的策略，將有可能對(duì)患者帶來(lái)大獲益。

疏肝祛瘀解毒方（decoction for soothing liver and removing stasis and toxicity，SGQYJDF）由我國(guó)著名中西醫(yī)結(jié)合腫瘤專家、廣東省名中醫(yī)林麗珠教授以四逆散為基礎(chǔ)所創(chuàng)，多年臨床實(shí)踐證明其行之有效，可明顯提高肝癌患者的生存質(zhì)量和生存時(shí)間［4］。前期研究已在細(xì)胞層面證明了疏肝祛瘀解毒方含藥血清能夠抑制人肝細(xì)胞癌MHCC97H細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)腫瘤蛋白53（tumor protein 53，p53）的水平，抑制溶質(zhì)載體家族7 成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11/xCT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的水平，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化物的累積，從而誘導(dǎo)鐵死亡［5］。但尚未在動(dòng)物層面證明該機(jī)制，故本研究通過(guò)建立SKHep-1細(xì)胞異種皮下移植瘤模型，探討疏肝祛瘀解毒方對(duì)裸鼠腫瘤增殖的抑制作用及其作用機(jī)制，為臨床的使用提供科學(xué)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物與細(xì)胞株

SPF 級(jí)BALB/c 雌性裸鼠25 只，4 周齡，體質(zhì)量18～22 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代購(gòu)并飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度22～24 ℃，濕度50%～60%，晝夜12 h/12 h 間斷照明，動(dòng)物可自由飲水?dāng)z食。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批并通過(guò)（編號(hào)：LL2022101909）。人肝癌細(xì)胞株SK-Hep-1購(gòu)自普諾塞，貨號(hào)：CL-0212。

2 主要試劑

疏肝祛瘀解毒方購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，由柴胡（甘肅NG21060101）、白芍（河北TH21051702）、枳殼（湖南HY23041802）、桃仁（河北國(guó)安221201）、半枝蓮（安徽2212020031）、龍葵（安徽2210190051）、山慈菇（貴州2023032402）、腫節(jié)風(fēng)（江西2022091904）組成，其經(jīng)過(guò)張?jiān)Ｃ窠淌阼b定，符合2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》及《湖南省中藥飲片炮制規(guī)范2010 版》標(biāo)準(zhǔn)。甲苯磺酸索拉非尼片（重慶藥友制藥有限公司，貨號(hào)H20203403）。

胎牛血清（Bovogen，貨號(hào)C0230）；青霉素-鏈霉素溶液、DMEM 培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白消化酶和PBS緩沖液（武漢普諾賽，貨號(hào)分別為PB180120、PM150210、PB180226、PB180327）；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（碧云天，貨號(hào)：C0105M）；4%多聚甲醛、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）（上海碧云天，貨號(hào)分別為P0099、A0208、A0216）；Anti-p53抗體、重組Anti-xCT 抗體、重組Anti-Glutathione Peroxidase 4 抗體和Anti-beta Actin 抗體（Abcam，貨號(hào)分別為ab26、ab175186、ab125066、ab8226）；KI67 多 克隆 抗 體、SLC7A11/xCT 多克隆抗體（Proteintech，貨號(hào)27309-1-AP、26864-1-AP）；高效RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Skim Milk 脫脂奶粉、2.5% Gluta 固定液（Solarbio，貨 號(hào) 分 別 為R0010、PC0020、D8340、P1126）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）比色法測(cè)試盒、亞鐵離子比色法測(cè)試盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）比色法測(cè)試盒（Elabscience，貨號(hào)E-BCK025-M、E-BC-K773-M、E-BC-K030-M）。

3 主要方法

3.1 疏肝祛瘀解毒方及索拉非尼藥液的制備（1）疏肝祛瘀解毒方由柴胡10 g、白芍15 g、枳殼15 g、桃仁10 g、半枝蓮30 g、龍葵30 g、山慈菇15 g 和腫節(jié)風(fēng)30 g 組成，按劑量混勻后于10 倍蒸餾水中浸泡30 min，加熱煮沸，微沸60 min 后倒出過(guò)濾藥液，再加8 倍蒸餾水重復(fù)上述操作，將兩次藥液混合，濃縮至含生藥2.5 g/mL，于4 ℃冷藏保存?zhèn)溆?。?）取甲苯磺酸索拉非尼（Sorafenib）研碎后放到離心管中，加入生理鹽水至終濃度為4 g/L，于4 ℃冷藏保存?zhèn)溆茫褂们俺曋?0 min，用生理鹽水稀釋。

3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將SK-Hep-1 肝癌細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM 高糖培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L 的鏈霉素），放置于37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

3.3 SK-Hep-1 細(xì)胞異種皮下移植瘤裸鼠模型的建立及分組給藥 取3.2 項(xiàng)下細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化、離心后，去上清液，用無(wú)血清的DMEM 培養(yǎng)基洗滌兩遍，再加入DMEM 培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×1010/L。在無(wú)菌條件下用注射器抽取0.2 mL細(xì)胞懸液注射到裸鼠右腋下方皮下，等待14 d左右，待皮下腫瘤最大直徑大于5 mm 且體積大于50 mm3即造模成功。將造模成功的裸鼠隨機(jī)5 組，即模型對(duì)照（control）組、SGQYJDF 低劑量（SGQYJDF-low）組、SGQYJDF 中劑量（SGQYJDF-medium）、SGQYJDF高劑量（SGQYJDF-high）和SGQYJDF 中劑量聯(lián)合Sorafenib（SGQYJDF+Sorafenib）組，根據(jù)《人與動(dòng)物體表面積換算表》計(jì)算，SGQYJDF低、中、高劑量組每日給予相同體積、成人等效量的0.5、1、2 倍疏肝祛瘀解毒方中藥液灌胃（10.075 g·kg-1·d-1、20.15 g·kg-1·d-1、40.3 g·kg-1·d-1），SGQYJDF 聯(lián)合Sorafenib 組每日給與相同體積、成人等效量的1 倍等效量的中藥液和甲苯磺酸索拉非尼藥液灌胃（20.15 g·kg-1·d-1、52 mg·kg-1·d-1），模型對(duì)照組給予相同體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃14 d［6］。

3.4 腫瘤體積和質(zhì)量的測(cè)量以及生長(zhǎng)抑制率的測(cè)定 灌胃期間，每2 d 測(cè)量1 次裸鼠異種移植瘤長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算腫瘤體積，末次給藥后1 h 脫頸處死動(dòng)物，取出瘤體稱重并計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。剪切部分腫瘤組織放于4%多聚甲醛溶液中固定，剩余腫瘤組織用于檢測(cè)鐵死亡生化指標(biāo)水平，以及Western blot 檢測(cè)p53、GPX4和xCT蛋白的表達(dá)情況。

腫瘤體積=長(zhǎng)徑×短徑2/2；腫瘤生長(zhǎng)抑制率（%）=（模型對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重）/模型對(duì)照組瘤重×100%。

3.5 蘇木精伊紅染色（Hematoxylin and Eosin staining，HE）法觀察腫瘤組織病理學(xué)形態(tài) 將固定于4%多聚甲醛溶液中的腫瘤組織樣本，通過(guò)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后，用組織切片機(jī)將其切為厚度4 μm 的石蠟切片。石蠟切片烘烤、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫苯、PBS 緩沖液沖洗后，按照HE 染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，再通過(guò)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片后顯微鏡下觀察腫瘤組織病理學(xué)形態(tài)并拍照。

3.6 比色法檢測(cè)腫瘤組織鐵死亡生化指標(biāo)水平

3.6.1 比色法檢測(cè)腫瘤組織亞鐵離子（ferrous ions，F(xiàn)e2+）水平 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，取各組腫瘤組織0.1 g，加入900 μL 提取劑，12 000 ×g離心10 min，取300 μL 上清液，加入150 μL 檢測(cè)液，37 ℃孵育10 min，再12 000 ×g離心10 min，將上清液加入酶標(biāo)板，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)593 nm 處的吸光度（A）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組腫瘤組織內(nèi)Fe2+的含量，并計(jì)算其相對(duì)含量。

相對(duì)含量=給藥組含量/模型對(duì)照組平均含量；下同。

3.6.2 比色法檢測(cè)腫瘤組織丙二醛水平 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，取各組腫瘤組織0.1 g，加入900 μL 裂解液、12 000 ×g離心10 min，取100 μL 上清液加入200 μL 檢測(cè)液、100 ℃孵育10 min、1 000 ×g離心10 min，取200 μL 上清液加入96 孔板，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)532 nm 的A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組細(xì)胞內(nèi)MDA的A值，并計(jì)算其相對(duì)含量。

3.6.3 比色法檢測(cè)腫瘤組織谷胱甘肽水平 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，取各組腫瘤組織0.1 g，加入900 μL提取劑，8 000 ×g、4 ℃離心10 min，取20 μL 于96 孔板中，并加入180 μL 檢測(cè)液常溫孵育2 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)512 nm 的A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組細(xì)胞內(nèi)GSH的含量，并計(jì)算其相對(duì)含量。

3.7 免疫組化（immunohistochemistry，IHC）法檢測(cè)腫瘤組織Ki67 和GPX4 的表達(dá) 同3.5 制備石蠟切片，將其烘烤、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫苯、PBS 緩沖液沖洗后，分別于 Ki67 （1∶2 000）和 GPX4（1∶200）Ⅰ抗溶液中4 ℃孵育過(guò)夜、Ⅱ抗孵育、DAB 顯色和蘇木精復(fù)染后，再通過(guò)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片后顯微鏡下觀察。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，ImageJ分析計(jì)算平均光密度值。

3.8 免疫熒光（immunofluorescence，IF）法檢測(cè)腫瘤組織p53 和xCT 的表達(dá) 同3.5 制備石蠟切片，將其烘烤、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫苯、PBS 緩沖液沖洗后，分別于p53（1∶1 000）和xCT （1∶250）Ⅰ抗溶液中4 ℃孵育過(guò)夜、熒光Ⅱ抗孵育、DAPI 染色后，熒光顯微鏡下觀察。隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，ImageJ分析計(jì)算平均熒光強(qiáng)度。

3.9 Western blot 法檢測(cè)腫瘤組織p53、GPX4 和xCT的表達(dá) 稱取適量腫瘤組織，研磨后加入裂解液，離心后取上清液，經(jīng)BCA 定量后，每孔蛋白質(zhì)上樣20 μg，在恒壓160 V電泳30 min分離、恒流400 mA轉(zhuǎn)膜30 min、5%脫脂牛奶封閉1 h、TBST洗滌3次，然后將膜分別于p53（1∶4 000）、 GPX4（1∶8 000）、 xCT （1∶5 000）和β-actin（1∶5 000）Ⅰ抗溶液中4 ℃孵育過(guò)夜，再用TBST洗滌3次后將膜與Ⅱ抗（1∶8 000稀釋）在37 ℃孵育2 h，然后用TBST 洗滌膜3 次，最后ECL顯色，以β-actin為內(nèi)參照，應(yīng)用ImageJ軟件計(jì)算相對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)量。相對(duì)蛋白表達(dá)量=目的蛋白表達(dá)量/內(nèi)參蛋白表達(dá)量

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用R （4.2.1）版本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布、方差齊用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗(yàn)，滿足正態(tài)分布、方差不齊用Welch one-way ANOVA檢驗(yàn)，不滿足正態(tài)分布用Kruskal-Wallis test 檢驗(yàn)；多重假設(shè)滿足正態(tài)分布、方差齊用Games-Howell 事后檢驗(yàn)和Tukey HSD 事后檢驗(yàn)，不滿足正態(tài)分布、方差不齊用Dunn's test 檢驗(yàn)；以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 疏肝祛瘀解毒方對(duì)皮下移植瘤裸鼠腫瘤及其增殖的影響

通過(guò)觀察腫瘤體積變化，發(fā)現(xiàn)模型對(duì)照組、低劑量復(fù)方組瘤體體積迅速增長(zhǎng)，中、高劑量復(fù)方組及聯(lián)合組體積增長(zhǎng)相對(duì)緩慢，與模型對(duì)照組相比，第4 天聯(lián)合組開(kāi)始具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），第6 天高劑量復(fù)方組開(kāi)始具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），第8 天中劑量復(fù)方組開(kāi)始具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；且由腫瘤質(zhì)量計(jì)算生長(zhǎng)抑制率可知，SGQYJDF 低濃度對(duì)腫瘤質(zhì)量的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而SGQYJDF中、高劑量及聯(lián)合給藥均可抑制腫瘤生長(zhǎng)（P＜0.01）；且與SGQYJDF 高劑量對(duì)比，聯(lián)合給藥效果更勝（P＜0.01）。此外，各組裸鼠解剖時(shí)均未見(jiàn)明顯浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

Figure 1. Effects of SGQYJDF on the general condition of subcutaneously transplanted tumor in nude mice. A： subcutaneously transplanted tumors； B： volume changes of subcutaneously transplanted tumors； C： suppression rate of growth for subcutaneously transplanted tumors. Mean±SD. n=5. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group； △△P＜0.01 vs SGQYJDF-high group.圖1 疏肝祛瘀解毒方對(duì)皮下移植瘤裸鼠腫瘤一般情況的影響

同時(shí)，通過(guò)IHC 觀察腫瘤組織Ki-67 陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算Ki-67 陽(yáng)性細(xì)胞率可知，與模型組對(duì)比，SGQYJDF 低、中、高劑量組及聯(lián)合組均可減低Ki-67的表達(dá)，抑制腫瘤增殖（P＜0.01），而與SGQYJDF 高劑量組對(duì)比，聯(lián)合組效果更勝（P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

Figure 2. Effects of SGQYJDF on the proliferation marker Ki-67 in subcutaneously transplanted tumor tissues of nude mice. A： immunohistochemical detection of Ki-67 expression（scale bar=50 μm）； B： the percentage of Ki-67 positive cells. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs control group； △△P＜0.01 vs SGQYJDF-high group.圖2 疏肝祛瘀解毒方對(duì)皮下移植瘤裸鼠腫瘤組織增殖標(biāo)志物Ki-67的影響

2 疏肝祛瘀解毒方對(duì)皮下移植瘤裸鼠腫瘤組織的病理學(xué)影響

通過(guò)HE 染色觀察各組腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)，各組腫瘤組織細(xì)胞排列不規(guī)則、形態(tài)不一、核質(zhì)比增加，表現(xiàn)出腫瘤細(xì)胞的特征，可見(jiàn)腫瘤壞死區(qū)。其中模型對(duì)照組腫瘤細(xì)胞較為密集、飽滿、核大深染；與模型對(duì)照組相比，各組給藥組均可見(jiàn)不同程度的核固縮、核質(zhì)比減小、壞死區(qū)域變大，呈劑量依賴性變化，聯(lián)合組最為明顯。見(jiàn)圖3。

Figure 3. Effects of SGQYJDF on the pathology of subcutaneously transplanted tumor in nude mice. HE staining of the subcutaneously transplanted tumors （scale bar=100 μm）.圖3 疏肝祛瘀解毒對(duì)皮下移植瘤裸鼠腫瘤組織的病理學(xué)影響

3 疏肝祛瘀解毒方對(duì)皮下移植瘤裸鼠腫瘤組織鐵死亡相關(guān)指標(biāo)的影響

根據(jù)對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算腫瘤組織內(nèi)MDA、Fe2+和GSH 的含量，計(jì)算其相對(duì)含量。與模型對(duì)照組比較，SGQYJDF 低、中、高劑量及聯(lián)合給藥均可導(dǎo)致MDA、Fe2+的相對(duì)含量增多（P＜0.01），且與SGQYJDF高劑量組對(duì)比，聯(lián)合組效果更勝（P＜0.01）。同時(shí)，SGQYJDF 低、中、高劑量組及聯(lián)合組均可導(dǎo)致GSH相對(duì)含量降低（P＜0.01），SGQYJDF 高劑量組與聯(lián)合組無(wú)差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖4。

Fiureg 4. Effects of SGQYJDF on ferroptosis-related indicators in the subcutaneously transplanted tumor of nude mice. Mean±SD. n=5. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group； △△P＜0.01 vs SGQYJDF-high group.圖4 疏肝祛瘀解毒對(duì)皮下移植瘤裸鼠腫瘤組織鐵死亡相關(guān)指標(biāo)的影響

4 疏肝祛瘀解毒方對(duì)皮下移植瘤裸鼠腫瘤組織相關(guān)蛋白的影響

通過(guò)ImageJ 分析腫 瘤 組織IF 的p53 和xCT 平均熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組對(duì)比，SGQYJDF低、中劑量可上調(diào)p53 和下調(diào)xCT 表達(dá)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而SGQYJDF 高劑量及聯(lián)合給藥均能夠上調(diào)p53 的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)xCT 的表達(dá)（P＜0.05、0.01）。與SGQYJDF 高劑量對(duì)比，聯(lián)合給藥組雖可見(jiàn)差異，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖5。

Figure 5. Effects of SGQYJDF on the expression of p53 and xCT in the subcutaneously transplanted tumor tissues of nude mice. Scale bar=100 μm. Mean±SD. n=5. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖5 疏肝祛瘀解毒方對(duì)皮下移植瘤裸鼠腫瘤組織p53和xCT的影響

通過(guò)ImageJ 分析腫瘤組織IHC 的GPX4 陽(yáng)性區(qū)域平均吸光度值，結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組對(duì)比，SGQYJDF 低、中、高劑量及聯(lián)合給藥下調(diào)GPX4 表達(dá)（P＜0.01）。與SGQYJDF 高劑量對(duì)比，聯(lián)合給藥效果更勝，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖6。

Figure 6. Effects of SGQYJDF on the expression of GPX4 in the subcutaneously transplanted tumor tissues of nude mice. （Scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs control group； △△P＜0.01 vs SGQYJDF-high group.圖6 疏肝祛瘀解毒方對(duì)皮下移植瘤裸鼠腫瘤組織GPX4的影響

通過(guò)ImageJ 分析Western blot 條帶灰度值，計(jì)算相對(duì)蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組對(duì)比，SGQYJDF 低、中劑量可上調(diào)p53，同時(shí)下調(diào)xCT 和GPX4 的表達(dá)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而SGQYJDF 高劑量及聯(lián)合給藥均能夠上調(diào)p53 的表達(dá)，同 時(shí) 下 調(diào)xCT 和GPX4 的影響（P＜0.05、P＜0.01）。與SGQYJDF 高劑量對(duì)比，聯(lián)合給藥組對(duì)p53、xCT 和GPX4 的影響雖可見(jiàn)差異，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖7。

Figure 7. Effects of SGQYJDF on the expression of p53，xCT，and GPX4 proteins in the subcutaneously transplanted tumor tissues of nude mice. Mean±SD. n=5. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖7 疏肝祛瘀解毒方對(duì)皮下移植瘤裸鼠腫瘤組織p53、xCT和GPX4蛋白的影響

討 論

HCC 作為PLC 的主要病理類型，其治療策略在不斷的改進(jìn)，但目前其預(yù)后仍然不盡人意，一線治療策略除了化療、靶向治療和免疫治療外，還包括了傳統(tǒng)中醫(yī)辨證論治以及具有肝癌適應(yīng)癥的現(xiàn)代中藥制劑［3］。中醫(yī)藥在臨床上具有可觀的療效，越來(lái)越多的研究探討了中藥及其有效成分對(duì)HCC的效果及作用機(jī)制，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化提供科學(xué)理論依據(jù)［7］。鐵死亡（Ferroptosis）作為一種程序性死亡方式，指鐵依賴性脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［8］。目前已有多種中藥及其有效成分被證實(shí)能夠通過(guò)誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)揮抗腫瘤的作用，例如雙氫青蒿素能夠通過(guò)促進(jìn)PEBP1/15-LO 的形成誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌中的鐵死亡、蓽茇酰胺（蓽茇的有效成分）能夠通過(guò)誘導(dǎo)鐵死亡快速誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞死亡［9-10］。此外在其他疾病中，也發(fā)現(xiàn)了例如甘草、槲皮素、姜黃素和黃芪苷等能夠調(diào)控鐵死亡［11］。不僅如此，現(xiàn)代藥物例如HCC一線治療藥物中的索拉非尼也被證實(shí)可通過(guò)鐵死亡發(fā)揮作用［12］。由此可見(jiàn)，中藥及其有效成分在通過(guò)鐵死亡抗HCC具有廣闊的前景。

疏肝祛瘀解毒方由柴胡、白芍、枳殼、桃仁、半枝蓮、龍葵、山慈菇和腫節(jié)風(fēng)八味藥組成，方中柴胡辛行苦泄，性善條達(dá)肝氣，疏肝解郁；白芍味酸，主入肝經(jīng)，偏易肝之陰血，長(zhǎng)于養(yǎng)血柔肝，緩急止痛；枳殼行滯消脹；桃仁味苦通泄，入心肝血分，善泄血滯，祛瘀力強(qiáng)；半枝蓮味辛苦寒，功能化瘀消腫，善治黃疸，消鼓脹；龍葵味苦寒，功用為解毒活血消腫；山慈菇味辛能散，有解毒消腫散結(jié)之功；腫節(jié)風(fēng)味苦辛性平，功用為解毒涼血，活血消斑散瘀。方中以四逆散為基礎(chǔ)，緊扣“肝郁、氣滯、血瘀”的關(guān)鍵病機(jī)，共奏疏肝行氣、化瘀解毒之功［4］。在前期研究的體外實(shí)驗(yàn)中，疏肝祛瘀解毒方已被驗(yàn)證其含藥血清可能通過(guò)調(diào)控p53/xCT/GPX4 通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞鐵死亡，本研究通過(guò)建立皮下移植瘤模型在動(dòng)物層面驗(yàn)證體內(nèi)機(jī)制，進(jìn)一步探討疏肝祛瘀解毒方在體內(nèi)的作用機(jī)制［5］。

首先，為驗(yàn)證疏肝祛瘀解毒方對(duì)裸鼠肝癌增殖的影響，一方面，我們通過(guò)觀察各組腫瘤體積變化，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率，發(fā)現(xiàn)疏肝祛瘀解毒方能夠呈劑量相關(guān)性的抑制裸鼠腫瘤體積的增長(zhǎng)；另一方面，通過(guò)HE 染色法觀察病理變化，結(jié)果提示疏肝祛瘀解毒方能夠呈劑量相關(guān)性的導(dǎo)致裸鼠腫瘤組織壞死；最后，Ki-67 是一種細(xì)胞周期相關(guān)的一種核蛋白，其可以反映腫瘤的增殖狀態(tài)，我們通過(guò)IHC 發(fā)現(xiàn)疏肝祛瘀解毒方能夠呈劑量相關(guān)性降低腫瘤組織Ki-67 的陽(yáng)性細(xì)胞率，這些結(jié)果表明疏肝祛瘀解毒方可以抑制裸鼠肝癌皮下移植瘤的生長(zhǎng)，同時(shí)印證了體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

其次，鐵死亡作為一種細(xì)胞程序性死亡方式，不同于其他細(xì)胞死亡方式，其相關(guān)的檢測(cè)指標(biāo)主要包括脂質(zhì)過(guò)氧化、鐵含量和谷胱甘肽含量，故為探討疏肝祛瘀解毒方能否誘導(dǎo)裸鼠肝癌鐵死亡，我們選擇通過(guò)比色法檢測(cè)腫瘤組織MDA、Fe2+和GSH 的水平來(lái)反映鐵死亡的程度［8，13］。其中MDA 作為脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量可以反映脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化的程度；Fe2+作為鐵死亡的驅(qū)動(dòng)因子，其含量可以反映脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化的難易程度；GSH 作為抗氧化的主要物質(zhì)，可以反映腫瘤抗過(guò)氧化的能力。本研究比色法檢測(cè)結(jié)果表明疏肝祛瘀解毒方可呈劑量相關(guān)性的提高腫瘤組織內(nèi)MDA和Fe2+水平，同時(shí)減低GSH水平，提示其能夠誘導(dǎo)肝癌裸鼠腫瘤組織鐵死亡，該結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

最后，為進(jìn)一步探討疏肝祛瘀解毒方如何調(diào)控鐵死亡，我們通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)疏肝祛瘀解毒方能夠靶向于p53，其作為腫瘤抑制因子，可通過(guò)多種途徑抑制腫瘤。而針對(duì)鐵死亡，現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，其與System Xc-和GPX4 關(guān)系密切，其中System Xc-是一種跨膜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，由跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白xCT（即SLC7A11）和跨膜調(diào)節(jié)蛋白SLC3A2 組成，能夠?qū)麅?nèi)的谷氨酸和胞外的胱氨酸交換，胱氨酸進(jìn)入細(xì)胞后，轉(zhuǎn)化為半胱氨酸，用于GSH 的合成；而GSH在GPX4 的作用下，可將過(guò)氧化的脂質(zhì)還原，從而抵抗鐵死亡的發(fā)生［8］。同時(shí)，GPX4 的活性也需要GSH的維持［14］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，HCC 一線治療藥物索拉非尼能夠通過(guò)上調(diào)p53 的表達(dá)，下調(diào)xCT 和GPX4通路，誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生［12，15］。故我們推測(cè)疏肝祛瘀解毒方能夠通過(guò)調(diào)控p53/xCT/GPX4 通路誘導(dǎo)肝癌鐵死亡，并在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證明［5］。故本研究通過(guò)IHC、IF 和WB 在動(dòng)物層面驗(yàn)證疏肝祛瘀解毒方對(duì)腫瘤該通路的影響。本研究結(jié)果提示疏肝祛瘀解毒方能夠劑量相關(guān)的上調(diào)p53 的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)xCT 和GPX4 的表達(dá)。但在IF 的圖片中，未發(fā)現(xiàn)p53 與xCT有明顯的共定位，故p53如何調(diào)控xCT的表達(dá)還需我們進(jìn)一步探索。

總的來(lái)說(shuō)，本研究驗(yàn)證了疏肝祛瘀解毒方在裸鼠體內(nèi)可能通過(guò)上調(diào)p53 的水平，抑制xCT 和GPX4的水平，導(dǎo)致鐵含量和脂質(zhì)過(guò)氧化物的累積以及抑制GSH的生成，從而誘導(dǎo)鐵死亡，最終達(dá)到抑制腫瘤增殖的目的，為今后疏肝祛瘀解毒方的作用機(jī)制研究提供了新的思路，為疏肝祛瘀解毒方的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)理論依據(jù)，擴(kuò)充了中草藥調(diào)控鐵死亡的方式。此外結(jié)果也提示疏肝祛瘀解毒方與索拉非尼聯(lián)用效果比兩倍疏肝祛瘀解毒方效果更甚，中西醫(yī)結(jié)合更有利于患者。但本研究仍有不足，疏肝祛瘀解毒方是否通過(guò)其它的作用機(jī)制及表型發(fā)揮更為明顯的效應(yīng)，疏肝祛瘀解毒方與索拉非尼聯(lián)用是否有協(xié)同作用等我們?nèi)晕粗?，這將是我們進(jìn)一步探索的重要方向。