趙思卡，許倍滔，馮喆，王力，張建國(guó)，李曉華*

（1 中南民族大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院；b.微生物資源與利用湖北省工程技術(shù)研究中心，武漢 430074；2 江蘇神力生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，江蘇 宜興 214211）

纖維素酶是作用于纖維素中β-1，4-葡萄糖苷鍵的一組酶［1］，能夠使纖維素變?yōu)槠咸烟呛屠w維二糖［2-3］，根據(jù)酶功能不同主要分為3 種：外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶［4］，纖維素酶在各行業(yè)應(yīng)用廣泛，在全球市場(chǎng)占據(jù)了酶產(chǎn)業(yè)份額的15%［5］.目前篩選到具有產(chǎn)纖維素酶能力的真菌主要來(lái)自木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）和脈孢菌屬（Neurospora）等；細(xì)菌主要來(lái)自芽胞桿菌屬（Bacillus）、高溫單胞菌屬（Thermomonospora）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）等；放線菌主要有鏈霉菌屬（Streptomyces）、小單胞菌屬（Micromonospora）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）等［6］.秸稈主要成分為木質(zhì)纖維素［7］，具有致密結(jié)構(gòu)，在自然條件下難以被動(dòng)物體降解和吸收［8］，纖維素酶在秸稈飼料中的應(yīng)用可以起到增加飼料適口性和動(dòng)物體吸收率等作用［9］.

本研究從健康的牛胃秸稈發(fā)酵物中分離內(nèi)切葡聚糖酶產(chǎn)生菌株，并通過(guò)菌落特征、生理生化性質(zhì)、16S rDNA 序列對(duì)比分析對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步對(duì)菌株產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究，為內(nèi)切葡聚糖酶在秸稈飼料中應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)樣品采自于湖南省長(zhǎng)沙縣養(yǎng)殖場(chǎng)健康牛胃中的秸稈發(fā)酵物.

1.2 培養(yǎng)基

（1）基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g·L-1，酵母浸粉10.0 g·L-1，pH值自然.

（2）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：NaCl 5.0 g·L-1，蛋白胨10.0 g·L-1，牛肉膏3.0 g·L-1，瓊脂18.0 g·L-1，pH值7.0.

（3）CMC-Na培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉10.0 g·L-1，酵母浸粉0.5 g·L-1，KH2PO41.5 g·L-1，蛋白胨0.5 g·L-1，MgSO40.3 g·L-1，NaCl 5.0 g·L-1，瓊脂15.0 g·L-1，pH 值自然.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶菌株的篩選

將牛胃秸稈發(fā)酵物在CMC-Na 液體培養(yǎng)基中37 ℃，180 r·min-1，富集培養(yǎng)24 h，取富集培養(yǎng)液1 mL，稀釋涂布于CMC-Na固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，多次分離純化挑取單菌落.用牛津杯法［10-11］測(cè)定降解圈大小，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù).

1.3.2 菌株特征、生理生化特性及16S rDNA 序列的擴(kuò)增分析

將篩選得到的菌株劃線接種后，37 ℃培養(yǎng)12 h，革蘭氏染色［12］，鏡檢觀察.根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株進(jìn)行生理生化鑒定［13］.提取菌株基因組DNA，使用16S rDNA 通用引物［14］擴(kuò)增.PCR 產(chǎn)物由武漢擎科生物公司測(cè)序，利用BLAST 對(duì)16S rDNA序列比對(duì)分析，使用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù).

1.3.3 菌株產(chǎn)酶條件單因素優(yōu)化

以培養(yǎng)時(shí)間、pH值、溫度、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽作為影響因素，依次改變其中一個(gè)因素，研究各因子對(duì)SCUEC7菌株產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的影響.

以1%接種量將SCUEC7 菌株接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，37 °C，180 r·min-1培養(yǎng)48 h，每隔4 h測(cè)定一次菌體量和酶活性；分別將pH值設(shè)置為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，37 °C、180 r·min-1培養(yǎng)12 h 測(cè)定菌體量和酶活性；分別將培養(yǎng)溫度設(shè)置為25、30、37、42、50、55 °C，180 r·min-1培養(yǎng)12 h，每個(gè)處理設(shè)置3 次重復(fù)，測(cè)定菌體量和酶活性.

以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別將唯一碳源設(shè)置為濃度分別為10 g·L-1的蔗糖、麥芽糖、果糖、淀粉、魔芋粉；唯一氮源設(shè)置為濃度分別為10 g·L-1的胰蛋白胨、牛肉膏、酪蛋白、尿素、硫酸銨；分別向培養(yǎng)基中添加濃度為1 g·L-1的K+、Cu2+、Na+、Mn2+、Mg2+，37 °C、180 r·min-1培養(yǎng)12 h，每個(gè)處理設(shè)置3 次重復(fù)，測(cè)定菌體量和酶活性.

按國(guó)際單位規(guī)定：在37 °C、pH 值7.0條件下，每分鐘催化CMC-Na水解產(chǎn)生1 μg葡萄糖所需要的酶量定義為1個(gè)內(nèi)切葡聚糖酶酶活性單位（1 U）.

1.3.4 菌株產(chǎn)酶條件響應(yīng)面法優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)，分析各因素的交互作用，構(gòu)建二次響應(yīng)面回歸模型，計(jì)算方差，得出最佳酶活性條件并驗(yàn)證.響應(yīng)面試驗(yàn)各因素與水平如表1所示.

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Tab.1 Analytical factors and levels for response surface methodology

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶菌株篩選

將牛胃中秸稈發(fā)酵物在CMC-Na 液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)坎加贑MCNa 固體培養(yǎng)基上，利用牛津杯法測(cè)定，結(jié)果如表2所示，11株菌株中纖維素降解圈在11.38～22.83 mm之間，G2 菌株直徑最小，為11.38 mm，G7 菌株直徑最大，為22.83 mm，將G7菌株命名為SCUEC7菌株.

表2 11株菌株降解圈大小Tab.2 Size of CMC-Na degradation circle of 11 strains

2.2 內(nèi)切葡聚糖酶產(chǎn)生菌SCUEC7菌株的鑒定

將SCUEC7菌株接種到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，菌落扁平，呈圓形，邊緣不規(guī)則，無(wú)光澤，呈現(xiàn)不透明黃白色，易挑起，無(wú)色素.SCUEC7 菌株生理生化特性測(cè)定結(jié)果：革蘭氏染色試驗(yàn)、酪素利用試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、伏-普試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、淀粉利用試驗(yàn)、丙酸鹽利用試驗(yàn)和硝酸鹽還原試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性，硫化氫試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)結(jié)果呈陰性.

以SCUEC7 菌株基因組DNA 為模板，PCR 法擴(kuò)增菌株的16S rDNA 序列，利用BLAST 進(jìn)行同源性序列比對(duì)，使用MEGA7.0 軟件N-J 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖1 所示，SCUEC7 菌株與Bacillussubtilisstrain ATCC 6015 相似度達(dá)到99%，結(jié)合SCUEC7 菌株形態(tài)特征、生理生化特性，初步鑒定SCUEC7菌株為枯草芽胞桿菌.

圖1 基于16S rDNA 的SCUEC7菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of SCUEC7 strain based on 16S rDNA

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)酶條件

2.3.1 培養(yǎng)時(shí)間

以1%接種量將SCUEC7 菌株接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，結(jié)果表明（圖2），培養(yǎng)時(shí)間在0～12 h范圍內(nèi)，菌株生長(zhǎng)量和酶活性隨時(shí)間的增加而增加；培養(yǎng)時(shí)間在12～48 h 范圍內(nèi)，菌株生長(zhǎng)量和酶活性隨時(shí)間的增加而下降.

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)SCUEC7菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶活性的影響Fig.2 Effects of culture time on the growth and enzyme production of SCUEC7 strain

2.3.2 pH值

以1%接種量將SCUEC7 菌株接種到不同初始pH 值的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h 后，pH 值在2.0～6.0 范圍內(nèi)，菌株的生長(zhǎng)量和內(nèi)切葡聚糖酶活性隨pH 值的增加而增加（圖3）；pH 值在6.0～11.0范圍內(nèi)，菌株生長(zhǎng)量和酶活性隨pH值的增加而逐漸降低.pH 值為6.0 時(shí)，SCUEC7 菌株產(chǎn)酶活性顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）.結(jié)果表明，pH 值為6.0 時(shí)，枯草芽胞桿菌SCUEC7 菌株生長(zhǎng)量和酶活性較高.

圖3 pH值對(duì)SCUEC7菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶活性的影響Fig.3 Effects of pH value on the growth and enzyme production of SCUEC7 strain

2.3.3 溫度

培養(yǎng)溫度在25～37 °C 范圍內(nèi)，菌株生長(zhǎng)量和酶活性隨培養(yǎng)溫度的升高而增加（圖4）；培養(yǎng)溫度在37～55 °C 范圍內(nèi)，菌株生長(zhǎng)量和酶活性隨溫度的升高而下降.溫度為37 °C 時(shí)，SCUEC7 菌株產(chǎn)酶活性顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）.因此，培養(yǎng)溫度為37 °C 時(shí)，枯草芽胞桿菌SCUEC7菌株生長(zhǎng)量和酶活性較高.

圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)SCUEC7菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶活性的影響Fig.4 Effects of culture temperature on the growth and enzyme production of SCUEC7 strain

2.3.4 碳源

當(dāng)以麥芽糖作為碳源時(shí)（圖5），枯草芽胞桿菌SCUEC7 菌株的內(nèi)切葡聚糖酶活性較高，除與葡萄糖、果糖實(shí)驗(yàn)組差異不顯著外，顯著高于其他三個(gè)實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）.結(jié)果表明，麥芽糖為碳源時(shí)，枯草芽胞桿菌SCUEC7菌株的內(nèi)切葡聚糖酶活性較高.

圖5 不同碳源對(duì)SCUEC7菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶活性的影響Fig.5 Effects of different carbon sources on the growth and enzyme production of SCUEC7 strain

將培養(yǎng)基中的麥芽糖濃度分別設(shè)為5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 g·L-1的梯度，培養(yǎng)12 h 后發(fā)現(xiàn)（圖6），麥芽糖濃度在5.0～20.0 g·L-1范圍內(nèi)，酶活性從203.8 U·mL-1增加到242.4 U·mL-1，麥芽糖濃度在20.0～30.0 g·L-1范圍內(nèi)，酶活性從242.4 U·mL-1下降 到198.0 U·mL-1.麥芽糖濃度為20.0 g·L-1時(shí)，SCUEC7 菌株產(chǎn)酶活性顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）.所以麥芽糖濃度為20.0 g·L-1時(shí)，枯草芽胞桿菌SCUEC7菌株的內(nèi)切葡聚糖酶活性較高.

圖6 不同濃度麥芽糖對(duì)SCUEC7菌株產(chǎn)酶活性的影響Fig.6 Effects of different concentration maltose on enzyme production of SCUEC7 strain

2.3.5 氮源

當(dāng)胰蛋白胨作為唯一氮源時(shí)，SCUEC7 菌株的內(nèi)切葡聚糖酶活性顯著高于其他五個(gè)實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）.結(jié)果表明：胰蛋白胨為氮源時(shí)，枯草芽胞桿菌SCUEC7菌株的內(nèi)切葡聚糖酶活性較高（圖7）.

圖7 不同氮源對(duì)SCUEC7菌株產(chǎn)酶活性的影響Fig.7 Effects of different nitrogen sources on enzyme production of SCUEC7 strain

將胰蛋白胨濃度分別設(shè)置成5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 g·L-1的濃度梯度，培養(yǎng)12 h 后，測(cè)定內(nèi)切葡聚糖酶活性，結(jié)果如圖8所示：胰蛋白胨的濃度在5.0～15.0 g·L-1范圍內(nèi)，酶活性由198.0 U·mL-1增加到222.0 U·mL-1，胰蛋白胨的濃度在15.0～30.0 g·L-1范圍內(nèi)，酶活性由222.0 U·mL-1下降到185.1 U·mL-1.胰蛋白胨濃度為15.0 g·L-1時(shí)，SCUEC7 菌株產(chǎn)酶活性顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）.結(jié)果表明，胰蛋白胨濃度為15.0 g·L-1時(shí)，枯草芽胞桿菌SCUEC7菌株的內(nèi)切葡聚糖酶活性較高.

圖8 不同濃度胰蛋白胨對(duì)SCUEC7菌株產(chǎn)酶活性的影響Fig.8 Effects of different concentration tryptone on enzyme production of SCUEC7 strain

2.3.6 金屬離子

以1%接種量將SCUEC7 菌株分別接種到添加1.0 g·L-1的Na+、K+、Mn2+、Cu2+和Mg2+離子的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12.0 h后（圖9），添加Mn2+的實(shí)驗(yàn)組，SCUEC7 菌株的內(nèi)切葡聚糖酶活性顯著高于其他四個(gè)實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）.因此，添加Mn2+，枯草芽胞桿菌SCUEC7菌株的內(nèi)切葡聚糖酶活性較高.

圖9 不同金屬離子對(duì)SCUEC7菌株產(chǎn)酶活性的影響Fig.9 Effects of different metal ions on the growth of SCUEC7 strain

將Mn2+濃度分別設(shè)置成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g·L-1的梯度，培養(yǎng)12.0 h 后，測(cè)定內(nèi)切葡聚糖酶活性，結(jié)果如圖10所示，Mn2+濃度在0.5～1.5 g·L-1范圍內(nèi)，酶活性由311.6 U·mL-1增長(zhǎng)到354.3 U·mL-1，Mn2+濃度在1.5-3.0 g·L-1范圍內(nèi)，酶活性由354.3 U·mL-1下降到310.6 U·mL-1.Mn2+濃度為1.5 g·L-1時(shí)，SCUEC7菌株產(chǎn)酶活性顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）.

圖10 不同濃度Mn2+對(duì)SCUEC7菌株產(chǎn)酶活性的影響Fig.10 Effects of different concentration Mn2+ on the growth of SCUEC7 strain

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果

選取培養(yǎng)時(shí)間、pH 值、麥芽糖含量3 個(gè)獨(dú)立變量為考察因素，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，測(cè)定每組實(shí)驗(yàn)菌株酶活性，作為響應(yīng)面法分析的依據(jù)，表3為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果.

表3 響應(yīng)面各因素水平與產(chǎn)酶活性Tab.3 Factor level of response surface methodology and enzyme activity

2.4.2 響應(yīng)曲面模型構(gòu)建及回歸方程結(jié)果顯著性分析

使用Design-Expert 10 軟件分析表4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，建立多元回歸模型.擬合培養(yǎng)時(shí)間（A）、pH 值（B）、麥芽糖含量（C）之間的二次多項(xiàng)回歸方程如下：酶活Y=408.78-3.38A-3.22B-1.67C-2.40AB-15.97AC+0.042BC-22.73A2-23.89B2-10.11C2.

表4 回歸模型方差分析Tab.4 Regression model and analysis of variance

如表4 所示，模型的F=11.7，模型P=0.0019＜0.01，表明模型極為顯著.R2=0.9377，表明該方程與對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值吻合程度達(dá)93.77%.由F檢驗(yàn)可知影響菌株SCUEC7 產(chǎn)酶活性的主次因素為培養(yǎng)時(shí)間＞pH 值＞麥芽糖含量.通過(guò)Design-Expert 10軟件計(jì)算得出：當(dāng)預(yù)測(cè)的響應(yīng)值最大時(shí)，3 個(gè)因素所對(duì)應(yīng)的最佳值是11.9 h，初始pH 值5.9，麥芽糖含量19.8 g·L-1.在此條件下所預(yù)測(cè)的最大酶活為 409.0 U·mL-1.

2.4.3 響應(yīng)曲面交互作用及結(jié)果分析

培養(yǎng)時(shí)間、pH、麥芽糖含量3 個(gè)因素對(duì)SCUEC7菌株產(chǎn)酶活性影響的響應(yīng)面圖和等高線圖見(jiàn)圖11.由圖可知，pH 值、培養(yǎng)時(shí)間之間存在較弱的交互作用；pH值、麥芽糖濃度之間和培養(yǎng)時(shí)間、麥芽糖濃度之間存在很強(qiáng)的交互作用.

圖11 3因素對(duì)菌株產(chǎn)酶活性的交互影響Fig.11 The interaction effect of 3 factors on enzyme-producing activity of the strain

2.4.4 模型檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果

將SCUEC7菌株最佳產(chǎn)酶活條件調(diào)整為培養(yǎng)時(shí)間11.9 h，初始pH 值6.0，麥芽糖含量19.8 g·L-1，此條件下進(jìn)行3 組平行實(shí)驗(yàn)，所得平均酶活力為409.2 U·mL-1，與預(yù)測(cè)值409.0 U·mL-1差距不大，表明該結(jié)果符合客觀實(shí)際.所以采用響應(yīng)面法優(yōu)化SCUEC7產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶條件可行.

3 結(jié)語(yǔ)

本研究從湖南省長(zhǎng)沙縣養(yǎng)殖場(chǎng)健康牛胃秸稈發(fā)酵物中分離得到枯草芽胞桿菌（Bacillussubtilis）SCUEC7 菌株，通過(guò)響應(yīng)面分析，預(yù)測(cè)最優(yōu)產(chǎn)酶條件下培養(yǎng)時(shí)間為11.9 h，初始pH 值為5.9，麥芽糖含量為19.8 g·L-1.

在動(dòng)物飼料加工過(guò)程中，內(nèi)切葡聚糖酶可高效降解秸稈飼料中的纖維素［15］，增加動(dòng)物體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率［16-18］.陳龍等研究Bacillusvelezensis157 發(fā)現(xiàn)，以堿處理玉米秸稈和豆粕的質(zhì)量比為1.0∶1.0，底物與水分質(zhì)量比為1.0∶0.5，于37 °C 培養(yǎng)溫度下發(fā)酵24 h后，其內(nèi)切葡聚糖酶活性為56.83 U·mL-1［19］；何楠等從玉米秸稈中分離出一株枯草芽胞桿菌BS-DX4，在最適生長(zhǎng)溫度 40 °C，最適pH 值7.0 條件下，該菌株胞外分泌液內(nèi)切葡聚糖酶最高活性為358.3 U·mL-1［20］，其最高酶活低于SCUEC7 菌株，最適pH 值與最適溫度高于SCUEC7 菌株；馬振剛等從自然界分離出一株蠟樣芽胞桿菌Bacilluscereusstrain CQNUX 3-1，在70 °C、pH 值8.0 條件下該菌株胞外分泌液內(nèi)切葡聚糖酶最高活性為107.7 U·mL-1［21］，最高酶活低于SCUEC7 菌株，最適pH 值與最適溫度高于SCUEC7.雖然研究者已從芽胞桿菌中分離出多株產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶菌株，但遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足工業(yè)生產(chǎn)對(duì)產(chǎn)酶菌株需求和酶性質(zhì)的要求，產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶菌種資源篩選備受關(guān)注.本研究為內(nèi)切葡聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了微生物資源.