陳詩(shī)琪,黃恬,蒲泠伶,王雪穎,葉峻
(成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,四川 成都 611130)
趕黃草為虎耳草科扯根菜屬多年生草本植物,其所含黃酮類(lèi)生物活性成分,可通過(guò)清除自由基,提高體內(nèi)活性酶水平,降低受肝損模型動(dòng)物血清中轉(zhuǎn)氨酶水平等,具有治療黃疸、膽囊炎、肝損傷和傳染性肝炎等藥效作用[1-2],并具有減肥、神經(jīng)保護(hù)、抗癌等生物功能[3-5]。同時(shí),超聲波具有強(qiáng)烈的振動(dòng)、空化效應(yīng)和攪拌作用,有利于提高提取效率,且方法簡(jiǎn)單、提取物純度高,并可避免高溫對(duì)提取成分的影響[6-8]。本研究采用超聲輔助提取法優(yōu)化趕黃草花、葉、桿中黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取工藝,并比較趕黃草的花、葉、桿黃酮類(lèi)物質(zhì)的含量及其對(duì)DPPH·和OH·自由基的清除率,為探究趕黃草的藥效作用及綜合開(kāi)發(fā)提供參考。
紫外分光光度計(jì)(TU-1901,普析通用儀器公司),超聲儀(KQ-250DE,昆山超聲儀器公司)。
趕黃草花、葉、桿樣品(均從淘寶網(wǎng)購(gòu)自四川古藺產(chǎn)。其中:花、葉各3 種,桿2 種),蘆?。?biāo)準(zhǔn)品,成都康邦生物科技有限公司;乙醇、AlNO3·9H2O、KOH、NaNO2(均為AR,成都科龍?jiān)噭┯邢挢?zé)任公司)。
將樣品置于80 ℃干燥箱中,烘4 h 后,粉碎,過(guò)80 目(180μm)篩,裝袋,密封備用。
按NaNO2-Al(NO3)3-KOH 絡(luò)合物法,以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,將樣品提取液于512.3 nm 處測(cè)定吸光值。則:
式中:N—稀釋倍數(shù);
C—總黃酮質(zhì)量濃度,mg·mL-1;
V—樣品液體積,mL;
m—樣品質(zhì)量,g。
1.4.1 DPPH·自由基清除能力測(cè)定
參考田文翰[9]的實(shí)驗(yàn)方法,將樣品總黃酮提取液稀釋至1.00 mg·mL-1,并各取2.0 mL 于20 mL 試管中,分別加入2.0 mL 0.2 mmol·L-1DPPH,混合均勻,置于暗處30 min 后,用95%乙醇做空白實(shí)驗(yàn),于517 nm 處測(cè)吸光度。則DPPH 自由基清除率為:
式中:Ai—樣品吸光度;
Ax—95%乙醇代替DPPH 測(cè)得吸光度;
Ao—空白吸光度。
1.4.2 OH·自由基清除能力測(cè)定
參考高亞妮[10]的實(shí)驗(yàn)方法,將樣品總黃酮提取液稀釋至0.40 mg·mL-1,并各取1.0 mL 于20 mL 試管中,分別依次加入1.0 mL 9 mmol·mL-1FeSO4、1.0 mL 9 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液和1.0 mL 8.8 mmol·L-1H2O2,用蒸餾水稀釋至10.0 mL,搖勻,置于37 ℃水浴鍋中,30 min 后于510 nm 處測(cè)定吸光度(Ai);用蒸餾水代替H2O2,其余步驟不變,測(cè)定吸光度(Ax);用蒸餾水做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn),測(cè)定吸光度(Ao)。OH·清除率SR 計(jì)算同“1.4.1”。
2.1.1 料液比的影響
分別取預(yù)處理后的花、葉、桿樣品1.000 0 g,各4 份。參考孫宗良[1]用65% 乙醇為提取劑,固定:超聲溫度:45 ℃,超聲功率:100 W,超聲時(shí)間:45 min;設(shè)置料液比(g∶mL)1∶15,1∶20,1∶30,1∶40,提取樣品中的總黃酮,結(jié)果見(jiàn)圖1。
圖1 料液比對(duì)總黃酮得率的影響
由圖1 可見(jiàn):以65% 乙醇為提取劑,花、葉、桿樣品分別在料液比為1∶20、1∶30、1∶30 時(shí),總黃酮得率最大,分別為:9.4%、8.0%、3.2%。因此,花、葉、桿樣品總黃酮提取的最佳料液比(g∶mL)分別為:1∶20、1∶30、1∶30。
2.1.2 提取時(shí)間的影響
分別取預(yù)處理后的花、葉、桿樣品1.000 0 g,各4 份。固定超聲提取功率:100 W,超聲溫度:45 ℃,提取劑:65% 乙醇,料液比(g∶mL):1∶30(其中:花樣品設(shè)為1∶20)。設(shè)置提取時(shí)間(min):20、30、45、60,提取樣品中總黃酮,結(jié)果見(jiàn)圖2。
圖2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響
由圖2 可見(jiàn):在超聲功率:100 W,超聲溫度:45 ℃時(shí),花、葉、桿樣品分別在超聲提取30、45、45 min 時(shí),總黃酮得率最大,分別為:10.4%、8.0%、3.2%。因此,花、葉、桿樣品總黃酮提取的最佳時(shí)間依次為:30、45、45 min。
2.1.3 提取溫度的影響
分別取預(yù)處理后的花、葉、桿樣品1.000 0 g,各4 份。固定超聲提取功率:100 W,提取劑:65%乙醇,料液比(g∶mL):1∶30(其中:花樣品設(shè)為1∶20),提取時(shí)間:45 min(其中:花樣品設(shè)為30 min)。設(shè)置提取溫度(℃):20、35、45、55,提取樣品中總黃酮,結(jié)果見(jiàn)圖3。
圖3 超聲溫度對(duì)總黃酮得率的影響
由圖3 可見(jiàn):在超聲功率:100 W,提取時(shí)間:45 min(其中:樣品“花”為30 min)時(shí),花、葉、桿樣品均在35 ℃時(shí)提取,總黃酮得率最大,分別為:11.2%、8.1%、3.4%。因此,花、葉、桿樣品總黃酮提取的最佳溫度均為:35 ℃。
2.1.4 超聲功率的影響
分別取預(yù)處理后的花、葉、桿樣品1.000 0 g,各4 份。提取溫度:35 ℃,提取劑:65% 乙醇,料液比(g∶mL):1∶30(其中:樣品“花”設(shè)為1∶20),提取時(shí)間:45 min(其中:樣品“花”設(shè)為30 min)。設(shè)置超聲提取功率(W):70、80、90、100、110,提取樣品中總黃酮,結(jié)果見(jiàn)圖4。
圖4 超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響
由圖4 可見(jiàn):在超聲功率:100 W,提取溫度:35 ℃,提取時(shí)間:45 min(其中:樣品“花”為30 min)時(shí),花、葉、桿樣品在提取功率依次為100、80、90 W 時(shí),總黃酮得率最大,分別為:11.2%、9.2%、4.0%。因此,花、葉、桿樣品總黃酮提取的最佳功率依次為100、80、90 W。
2.1.5 總黃酮提取工藝條件
綜合2.1.1-2.1.4,用65%乙醇為提取劑,超聲輔助法提取趕黃草花、葉、桿樣品中總黃酮的最佳工藝條件,見(jiàn)表1。
表1 樣品中總黃酮提取工藝條件
按表2 中各樣品超聲輔助提取最佳工藝條件,分別對(duì)趕黃草花、葉、桿中總黃酮進(jìn)行提取,靜置,過(guò)濾,將濾液按“1.3”進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),每個(gè)樣品均取3 份,平行測(cè)定3 次,取平均值。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 樣品測(cè)定與加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果
由表2 可見(jiàn),所測(cè)趕黃草花、葉、桿樣品總黃酮得率依次別為:11.09%、9.27%、4.06%,呈現(xiàn):花>葉>桿。所測(cè)樣品加標(biāo)回收率均在90%~110%,RSD%≤0.91。表明:測(cè)定方法準(zhǔn)確、可靠。
取樣品總黃酮提取液各3 份,分別按“1.4.1”、“1.4.2”進(jìn)行DPPH·、OH·自由基清除率實(shí)驗(yàn),并用VC 做對(duì)照實(shí)驗(yàn),均平行測(cè)定3 次,取平均值。結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 樣品提取液對(duì)DPPH·和OH·自由基清除率
由表3 可見(jiàn),花、葉、桿總黃酮提取液對(duì)DPPH·和OH·自由基均有良好的清除能力。其中:花、葉、桿樣品總黃酮提取液對(duì)DPPH 清除率(%)平均值分別為:80.91、73.28、81.16,對(duì)OH·清除率(%)平均值分別為:74.48、66.41、80.92,二者均呈現(xiàn)出:桿>花>葉。
為探究趕黃草花、葉、桿的藥效作用,運(yùn)用超聲輔助-分光光度法優(yōu)化了趕黃草花、葉、桿中總黃酮提取的料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度及超聲功率等工藝條件及其總黃酮含量測(cè)定、并將樣品總黃酮提取物對(duì)DPPH、羥基自由基進(jìn)行了清除率實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明:
1)趕黃草花、葉、桿樣品中總黃酮平均得率依次別為:11.09%、9.27%、4.06%,呈現(xiàn):花>葉>桿。所測(cè)樣品加標(biāo)回收率均在90%~110%,RSD%≤0.91。表明:測(cè)定方法準(zhǔn)確、可靠。
2)花、葉、桿樣品總黃酮提取液對(duì)DPPH·、OH·自由基具有良好的清除能力,均超過(guò)66%,且均呈現(xiàn)出:桿>花>葉。表明:趕黃草花、葉、桿均有很好的抗氧化性,具有良好的抗病毒、抗衰老等藥效作用。