于亞鑫,劉志剛,2,3,王春梅,2,3,楊立榮,2,3

(1. 華北理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,河北 唐山 063210;2. 河北省無機(jī)非金屬材料重點實驗室,河北 唐山 063210;3. 河北省工業(yè)固廢綜合利用技術(shù)創(chuàng)新中心, 河北唐山 063210)

沸石是通過[SiO4]和[AlO4]連接形成的多孔框架結(jié)構(gòu)材料,具有豐富的孔道結(jié)構(gòu)及高比表面積。此外,沸石良好的生物相容性和低毒性,使其作為藥物載體具有獨有的優(yōu)勢[1-4]。與大分子藥物載體相比,納米沸石更易被細(xì)胞吸收,比表面積比普通沸石更大,載藥量更多,因此更適合做藥物載體。方鈉石是微孔沸石的一種,是由β籠之間共用四元環(huán)或六元環(huán)的方式排列的體心立方結(jié)構(gòu),孔道為六元環(huán),孔徑為0.28[5-7],方鈉石骨架中Si/Al為1.00左右,與高硅沸石相比具有更強(qiáng)的離子交換能力,但因其孔徑小、孔道長,導(dǎo)致其傳質(zhì)速率低,無法充分發(fā)揮其較強(qiáng)的離子交換性和吸附性能力,因而應(yīng)用受到限制。目前多通過方鈉石納米化提高其傳質(zhì)速率。Gilani等人[8]采用一步水熱法制備了粒徑在40～90 nm的納米方鈉石,可用于吸附去除污染廢水中的陽離子染料(CV),具有低成本、去除CV效率高的特點。Kazemimoghadam等人[9]采用水熱原位結(jié)晶法制備了羥基納米方鈉石膜,在乙醇/水混合物的分離中表現(xiàn)出很好的膜性能。Teow[10]成功合成了平均粒徑為40～80 nm的納米方鈉石晶體,該材料具有良好的催化活性,對苯甲醛轉(zhuǎn)化率為92%。

姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種天然多酚化合物,有抗炎、抗氧化、抗惡性細(xì)胞增殖等作用。但是,姜黃素是疏水的多酚類物質(zhì),水溶性極差,因此其口服吸收率低、在體內(nèi)的生物利用率低且代謝快。針對這些問題,目前大多選擇具有較高孔隙率、良好熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性、較高生物相容性和低毒性的沸石材料作為姜黃素載體。Zheng[11]合成納米ZIF-8負(fù)載姜黃素用于抗炎、抗惡性細(xì)胞增殖;Karimi[12]用Y型沸石和ZSM-5負(fù)載姜黃素用于提高抗氧化性;Ahali[13]用A型沸石負(fù)載姜黃素以實現(xiàn)靶向治療。

現(xiàn)有研究結(jié)果均顯示,采用納米沸石負(fù)載姜黃素后可以延長藥物在人體內(nèi)的停留時間、增強(qiáng)生物利用率,使得姜黃素活性最大化。但少有將納米方鈉石作為生物醫(yī)藥應(yīng)用的相關(guān)報道。為此,在低溫冰浴環(huán)境下制備方鈉石凝膠前驅(qū)體,再經(jīng)溶劑熱法合成納米方鈉石,分析其結(jié)構(gòu)和形貌,探討載藥溫度、載藥pH值和載藥濃度等條件對其載藥性能的影響,以確定其適宜的載藥條件,并分析其抗菌性能,為其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 實驗

1.1 樣品制備

1.1.1納米方鈉石的制備

將一定量的NaOH與Al(OH)3溶液混合制備偏鋁酸鈉溶液,在冰水浴條件下加入正硅酸乙酯(TEOS)制備方鈉石凝膠前驅(qū)體(NaOH、Al(OH)3和TEOS的摩爾比為4:1:1.2)。將前驅(qū)體加入正丁醇與乙醇的混合溶液中,定容為50 mL,將50 mL混合溶液置于100 mL聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼反應(yīng)釜中,90 ℃保溫12 h,反應(yīng)結(jié)束后,去離子水、無水乙醇超聲清洗3次,最后,將樣品置于50 ℃真空干燥箱干燥至恒重,得到納米方鈉石,標(biāo)記為“SOD”。

1.1.2納米方鈉石負(fù)載姜黃素樣品的制備

將0.02 g姜黃素加入10 mL無水乙醇,磁力攪拌10 min,記為A液。0.2g SOD加入90 mL配置好的pH為8.7的磷酸鹽緩沖溶液中,磁力攪拌10 min,記為B液。將A液加入B液中攪拌10 min后,分別在20 ℃、35 ℃、50 ℃水浴攪拌6 h,得到不同溫度負(fù)載姜黃素的納米方鈉石樣品,分別標(biāo)記為SOD-20、SOD-35、SOD-50。

將B液中磷酸鹽緩沖溶液的pH分別設(shè)定為4.2、6.8和8.7,按照上述實驗確定的最優(yōu)載藥溫度,采用相同的制備過程合成不同載藥pH負(fù)載姜黃素的納米方鈉石,分別標(biāo)記為SOD-4、SOD-6和SOD-8。

1.2 樣品載藥性能測試

采用上海精密儀器儀表有限公司生產(chǎn)的752G紫外可見分光光度計,測量入射光λ為419 nm處每間隔1 h的上清液中的姜黃素吸光度,采用公式(1)和公式(2)計算各樣品的藥物包封量Q和包封率L。具體方法如下:

將0.02 g姜黃素藥物溶于10 mL乙醇中,再放入90 mL配置好的磷酸鹽緩沖溶液中,用紫外分光光度計,在入射光λ為419 nm時測量姜黃素的吸光度a。再將實驗中每間隔1 h取到的上清液,用紫外分光光度計,在入射光λ為419 nm時測量納米方鈉石對姜黃素的吸光度b(每克載體中所含藥物質(zhì)量C為1 000 mg/g)。

Q=C×L

(1)

(2)

1.3 樣品抗菌性能測試

3 g牛肉浸膏、5 g蛋白胨溶于100 mL去離子水中,用磷酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH至7.4,制得液體培養(yǎng)基。15 g瓊脂粉、3 g牛肉浸膏、5 g蛋白胨溶于100 mL去離子水中,用磷酸緩沖溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值至7.4,加熱至全部溶解制得固體培養(yǎng)基。在無菌操作臺上取4 μL大腸桿菌菌落分別加入到4份100 mL液體培養(yǎng)基中,在37 ℃、120 rpm的搖床內(nèi)培養(yǎng)48 h,制得細(xì)菌培養(yǎng)液。

稱取0.2 g載藥樣品加入20 mL液體培養(yǎng)基中分散均勻,用移液槍取一定量分散均勻的溶液,滴入細(xì)菌培養(yǎng)液中制備載藥菌液。將滅菌后的固體培養(yǎng)基在凝固前取出置于平板上,在紫外燈下滅菌,待固體培養(yǎng)基冷卻凝固后,在每個平板上接種20 μL載藥菌液,用涂布棒涂布均勻,測試樣品的抗菌性能,采用紫外分光光度計,在入射光λ為419 nm時測定不同載體載藥菌液的吸光度,采用公式(3)計算抑菌率:

(3)

式中:

U——樣品的抑菌率,%;

a——無樣品滴入細(xì)菌培養(yǎng)液后12 h的吸光度,nm;

c——載藥樣品滴入細(xì)菌培養(yǎng)液后12 h的吸光度,nm。

1.4 樣品結(jié)構(gòu)表征

采用日本Hitachi公司生產(chǎn)的SU8020型掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察納米方鈉石顆粒的微觀形貌;利用美國康塔公司生產(chǎn)的NOVA2000e氮吸附儀(brunaueremmettteller,BET)對樣品進(jìn)行氮氣吸附-脫附測試,分析其比表面積和孔結(jié)構(gòu)參數(shù);采用日本島津公司生產(chǎn)的XRD-7000型X-射線衍射儀(X-ray diffraction,XRD)分析納米方鈉石的晶體結(jié)構(gòu),輻射源為銅靶(λ=0.154 056 nm),衍射角(2θ)范圍為5～90°,掃描速率和步長分別為10°/min和0.02°。采用Scherrer公式(4)計算晶粒尺寸:

(4)

式中:

D——晶粒尺寸, nm;K——常數(shù),取值0.89;λ——X射線波長,取0.154 056 nm;β——衍射峰半高寬,°;θ——衍射角,°。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 SOD的結(jié)構(gòu)表征

采用掃描電鏡觀察SOD樣品形貌、通過X-射線衍射測試SOD樣品的物相組成、利用多點氮吸附儀分析SOD樣品的比表面積和孔結(jié)構(gòu)特征,結(jié)果如圖1所示。

圖1 納米方鈉石的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果

圖1(a)顯示,溶劑熱法制備的SOD樣品為由方鈉石納米晶體自組裝而成的類球形納米顆粒,顆粒粒徑約為100 nm。XRD測試結(jié)果顯示,SOD樣品的衍射峰與方鈉石的特征峰(PDF#76-1639)基本吻合,說明成功合成了納米方鈉石晶體見圖1(b),采用公式(4)計算可知SOD樣品的晶粒尺寸為13.4 nm。圖1(c)為SOD樣品的氮氣吸附-脫附曲線。由圖可知,制備SOD樣品的吸附曲線屬于V型,具有H3型滯后環(huán)。當(dāng)相對壓力P/P0介于0.6～1間時,脫附曲線出現(xiàn)明顯的滯后環(huán),說明樣品中存在二次介孔結(jié)構(gòu);中壓段(0.6

2.2 SOD的載藥性能

2.2.1載藥溫度對SOD載藥性能的影響

以SOD為載體,載藥溫度分別選擇20 ℃、35 ℃和50 ℃,測試不同載藥溫度下SOD對姜黃素的包封量,結(jié)果如圖2所示。由圖可知,樣品的藥物包封量隨載藥時間延長,呈先增加后不變的趨勢;載藥溫度升高,藥物包封量增加。當(dāng)載藥溫度分別為20 ℃和35 ℃時制備的樣品,2 h后藥物包封量均不變,最高藥物包封量分別為64 mg/g和100 mg/g;載藥溫度為50 ℃時,5 h后藥物包封量不變,最高包封量為367 mg/g。由此可知,載藥溫度為50 ℃時,納米方鈉石對姜黃素的包封量明顯高于其他樣品的載藥量,主要是因為溫度升高,分子熱運動加快,利于姜黃素進(jìn)入SOD孔結(jié)構(gòu)孔隙中,增加了藥物的負(fù)載量。

圖2 不同載藥溫度時SOD負(fù)載姜黃素樣品的包封量

為了探究SOD負(fù)載姜黃素藥物的位置及載藥前后樣品孔結(jié)構(gòu)的變化,對不同載藥溫度制備的SOD負(fù)載姜黃素樣品進(jìn)行氮氣吸附-脫附測試,結(jié)果如表1和圖3所示。由表1可以看出,與未載藥的SOD樣品相比,載藥后的SOD-20和SOD-50樣品比表面積和孔容都減小。圖3(a)顯示,SOD-50樣品的氮氣吸附量低于SOD-20和未載藥的SOD樣品,表明SOD-50樣品的藥物吸附量高于SOD-20?？讖椒植硷@示見圖3(b),與未載藥樣品SOD相比,SOD-20和SOD-50樣品在20～45 nm的孔徑曲線基本持平,說明藥物大多吸附于20～45 nm的介孔中。5～15 nm的孔徑曲線明顯升高,說明藥物進(jìn)入20～45 nm的介孔后,并未完全填充孔道,填充后為5～15 nm的介孔。因此,載藥溫度為50 ℃時,SOD負(fù)載姜黃素的吸附量比20 ℃大,且在20～45 nm的介孔中負(fù)載的藥物更多。

表1 不同載藥溫度時SOD負(fù)載姜黃素樣品的BET測試結(jié)果

圖3 不同載藥溫度制備樣品的氮氣吸附-脫附曲線(a)和孔徑分布曲線(b)

2.2.2載藥pH對SOD載藥性能的影響

以SOD為載體,固定載藥溫度為50 ℃,載藥pH分別選擇4.2、6.8和8.7,測試不同載藥pH下SOD對姜黃素的包封量,結(jié)果如圖4所示。由圖可知,載藥時間延長,樣品的藥物包封量呈先增加后不變的變化趨勢,載藥pH對樣品的藥物包封量有較大影響。當(dāng)pH=6.8時,最高包封量為63 mg/g;pH=8.7時,最高包封量為367 mg/g;而pH=4.2時,最高包封量為857 mg/g,包封率高達(dá)86%。這可能是因為納米方鈉石呈電中性,酸性和堿性環(huán)境更利于除去孔徑中雜質(zhì),利于吸附藥物。而酸性環(huán)境下藥物包封量明顯高于堿性環(huán)境,可能因為納米方鈉石合成液相是堿性的,在制備過程中已經(jīng)溶出雜質(zhì),因此,酸性環(huán)境負(fù)載藥物時更利于進(jìn)一步溶出大量雜質(zhì),使載體負(fù)載更多藥物。

圖4 不同載藥pH時SOD負(fù)載姜黃素樣品的包封量

為了進(jìn)一步探究SOD負(fù)載姜黃素藥物的位置及載藥前后孔結(jié)構(gòu)的變化,對不同載藥pH制備的樣品進(jìn)行氮氣吸附-脫附測試,結(jié)果見表2和圖5。由表2可以看出,載藥pH為4.2時制備SOD-4樣品的比表面積和孔容明顯小于SOD-8和未載藥樣品SOD,平均孔徑明顯大于SOD-8,說明SOD-4的藥物負(fù)載量明顯大于SOD-8,與圖4結(jié)果相符。

表2 不同載藥pH時SOD負(fù)載姜黃素樣品的BET數(shù)據(jù)

圖5 不同載藥pH制備樣品的氮氣吸附-脫附曲線(a)和孔徑分布曲線(b)

圖5(a)為不同載藥pH制備樣品的氮氣吸附-脫附曲線。由圖5(a)可知,pH為4.2時制備SOD-4樣品的氮氣吸附量遠(yuǎn)低于SOD-8和未載藥的SOD樣品,表明SOD-4吸附姜黃素藥量遠(yuǎn)高于SOD-8。圖5(b)顯示,載藥pH為8.7時,與SOD相比,SOD-8樣品中的藥物大多吸附于15～45 nm的介孔中,而該樣品在2～15 nm范圍的孔徑曲線明顯,說明藥物進(jìn)入15～45 nm的介孔但并未完全填充孔道,填充后大多產(chǎn)生2～15 nm的介孔。載藥pH為4.2制備的SOD-4樣品,藥物大多吸附于其2～45 nm的介孔中,吸附藥物后孔徑曲線持平。上述結(jié)果說明,酸性環(huán)境比堿性環(huán)境更利于納米方鈉石孔結(jié)構(gòu)中的雜質(zhì)溶出,增加載藥孔徑范圍,與圖4的結(jié)果一致。

2.2.3載藥濃度對SOD載藥性能的影響

分別制備濃度為100 mg/L、200 mg/L和300 mg/L的姜黃素溶液,選取載藥溫度和載藥pH分別為50 ℃和4.2,制備不同載藥濃度的納米方鈉石負(fù)載姜黃素樣品,分別標(biāo)記為SOD-100、SOD-200和SOD-300,測試其對姜黃素的包封量,結(jié)果如圖6所示。由圖可知,載藥時間延長,藥物包封量呈增加的趨勢。SOD-100、SOD-200和SOD-3003個樣品的最高包封量分別為845 mg/g、857 mg/g和850 mg/g,包封率分別為85%、86%和85%。由此說明,姜黃素藥物濃度對納米方鈉石的載藥性能影響較小。

圖6 不同藥物濃度時SOD負(fù)載姜黃素樣品的包封量

2.3 SOD的抗菌性能

由上述研究結(jié)果可知在載藥溫度為50 ℃、載藥pH為4.2時制備的SOD-4樣品對姜黃素的包封量最高,稱取0.2 gSOD-4載藥樣品按照1.4描述過程測試其抗菌性能,結(jié)果如圖7所示。圖7顯示,SOD-4樣品的培養(yǎng)皿中可以清晰看到樣品稀釋液,僅存極少個大腸桿菌菌落,而無載藥樣品的對照樣中則存在大量的大腸桿菌菌落,說明SOD-4樣品具有較好的抗菌性。按照公式(3)計算得到SOD-4樣品的抑菌率為91.4%,證實該樣品具有較高的抗菌性,與圖7結(jié)果相一致。

圖7 SOD-4(a)和無載藥樣品(b)的對照樣的抗菌性測試結(jié)果

3 結(jié)論

(1)以正硅酸乙酯為硅源,氫氧化鋁為鋁源,通過溶劑熱法制備了納米方鈉石,以其為藥物載體負(fù)載姜黃素,考察了載藥溫度、載藥pH、載藥濃度等因素對其載藥性能的影響,探討了其抗菌性。

(2)溶劑熱法制備納米方鈉石的晶粒粒徑大約13.4 nm。作為姜黃素的藥物載體,其適宜的載藥條件為:載藥溫度為50 ℃、載藥液相pH為4.2,該條件下納米方鈉石顯示出較好的載藥性能和優(yōu)異的抗菌性,藥物大多吸附于其2～45 nm的介孔中,最高藥物包封量可達(dá)857 mg/g,包封率為86%,抑菌率高達(dá)91.4%。