仲威宇,朱曉斌,夏正俊,李艷華,張麗輝

(1.長春師范大學生命科學學院,吉林 長春 130032;2.東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 中國科學院種子創(chuàng)新研究院,黑龍江 哈爾濱 150081)

我國植物資源豐富,為基因功能研究與品種選育提供了重要的遺傳材料。在植物分子生物學研究中,從分子標記如SSR等篩選、已知基因的基因型鑒定、變異位點檢測、重組體篩選等,都需要提取大量樣品的DNA[1-2]。DNA的制備質量與速度均會對分子實驗的效率和準確性造成影響[3]。然而,目前大多數(shù)分子生物學實驗室主要通過單管取樣,進而利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[4]來提取DNA,但研究樣品數(shù)量大的遺傳群體或育種材料時,需要重復操作,效率低下。

目前,現(xiàn)有的快速提取方法有堿裂解法[5]、TE緩沖液研磨法[6],雖然這兩種方法都可將DNA提取時間縮短到1小時左右,但提取的DNA的質量常滿足不了下游PCR等要求。另一種快速方法是使用一次性聚合物微針貼片刺穿葉片組織,提取細胞內(nèi)DNA。這適用于植物病害的快速分子診斷,尚難以應用于常規(guī)的分子生物學研究中[7]。

雖然已有不少公司可提供商業(yè)化的DNA提取服務,先利用常規(guī)的植物葉片取樣器,將葉片取至96孔深孔板中,再經(jīng)過自動提取DNA儀器[8-9],但現(xiàn)在還只有96孔板模式,且成本極高。在普通的分子生物學實驗室或育種單位,急需開發(fā)一種成本低、效率高的植物葉片取樣方法,及配套的基因組DNA提取技術流程,可適用于種質資源DNA、基因定位與克隆、分子育種等多種技術。本研究利用384微孔深孔板、吸管、牙簽等簡單裝置,設計了一種可以標準化定量提取大批量植物葉片組織的技術,同時適配開發(fā)了改良的CTAB法基因組DNA提取流程,可應用于高通量基因型鑒定等,有利于分子生物學研究人員與分子育種的育種家利用普通的實驗室條件開展高通量基因型鑒定工作。

應用本實驗技術取樣后提取植物基因組DNA, 可提高分子實驗研究效率與基因型鑒定效率,通過對比普通單管CTAB法的提取操作時間、提取質量、保存時間,并通過2% 瓊脂糖凝膠電泳進行PCR擴增產(chǎn)物驗證,發(fā)現(xiàn)通過改良取樣方法及大規(guī)模提取DNA后,可以明顯縮短實驗時間,加快實驗效率,且使用的試劑對操作人員危害相對較低。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用材料為:經(jīng)過60Co γ射線誘變后的合農(nóng)75大豆(GlycinemaxL.)大片段缺失突變體QS350與合豐55雜交F2代遺傳及衍生群體。

1.2 實驗器材

聚丙烯384透明底深孔方型微孔板(每孔容積約為240 μL/孔)(Corning);透明吸管(直徑約3.0 mm);牙簽;PCR儀(GeneAmp PCR System 9700,Applied Biosystems);水浴鍋(HH600,茂祥儀器設備廠);自動聯(lián)排移液器(E4 XLS,RAININ);離心機(DD-5M,湘儀);回旋式振蕩器(HY-5,榮華儀器制造有限公司);超微量分光光度計(Nano Drop 2000c,Thermo Scientific);真空泵(VPA-2,浙航機械有限公司)。

1.3 DNA提取試劑

CTAB(十六烷基三甲基溴化銨,上海生工)溶液;1.5% CTAB;1.4 mol/L NaCl;100 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0);20 mmol/L EDTA(4 mL of 0.5 mol Stock/100 mL);1% PVP-40;CIA溶液(氯仿與異戊醇比例為24∶1)。

2 取樣方法及提取流程

2.1 取樣技術流程

所需取樣提取器材如圖1所示。高通量基因型鑒定的植物組織取樣法大豆葉片取樣流程如圖2所示。高通量基因型鑒定的植物組織取樣法大豆葉片轉移及磨樣流程如圖3所示。

A-磨樣用96孔針;B-384深孔微孔板;C-取樣吸管;D-取樣牙簽。圖1 所需取樣提取器材

圖2 大豆葉片取樣流程

A-覆蓋錫紙的384微孔板;B-將樣品送入384板底部;C-將每排取樣孔封上;D-研磨樣品。圖3 大豆葉片轉移及磨樣流程

根據(jù)384深孔微孔板的孔徑與高度,選擇合適直徑的吸管。因本實驗中選擇的384微孔板的孔直徑大小為3.0 mm,所以本實驗采用內(nèi)直徑為2.5 mm,外直徑為3.0 mm的塑料管(吸管),并統(tǒng)一裁切成長度約為20～30 mm左右,可根據(jù)實際情況自行增減長度。

將待取樣葉片對折2～3次。左手持葉片樣品,右手使用吸管抵住葉片與左手手指,用力擠壓將葉片壓入吸管內(nèi)(圖2A～F),取樣后不影響葉片的后續(xù)生長發(fā)育;為防止取樣時樣品被帶入其他孔內(nèi),取樣前先使用鋁/錫箔紙覆蓋384深孔微孔板,同時壓緊以便凸顯微孔位置(圖3A);使用金屬棒或牙簽將吸管內(nèi)葉片推入384深孔內(nèi)(圖3B);每取完一個樣品使用酒精棉擦拭手指,清除可能殘留的樣品;在取完一列樣品后,使用膠帶將孔貼上,以防取樣時對上一列樣品出現(xiàn)交叉污染(圖3C)。

重復上述操作,直至完成所有葉片的取樣。一個 384 樣品板完成后,低速離心,使植物樣品沉降于植物底部。取完樣品后使用真空泵進行干燥并使用自制96孔針進行充分破碎研磨(圖3D)。

2.2 DNA提取方法

改良CTAB法,參考武林琳的方法[10]并進行改良。

步驟1(破碎樣本):使用上述大豆葉片取樣方法取樣后,將裝有植物葉片的384微孔板放入真空泵中進行抽氣干燥,干燥后使用96孔針充分搗碎,破碎細胞壁。

步驟2(裂解細胞及滅酶):向干燥搗碎后的384微孔板每孔中加入75 μL 含有1%β巰基乙醇的2% CTAB溶液,在65 °C的恒溫水浴鍋中水浴60 min,期間間隔5～10 min緩慢搖晃均勻。

步驟3(提取核酸):冷卻至室溫后加入75 μL的CIA溶液, 輕輕混勻,4 000 r/min離心30 min。取20～30 μL左右上清液至新的384微孔板內(nèi),加入等體積預冷的異丙醇,-20 ℃保存30～60 min后4 000 r/min離心30 min,揭開蓋板,鋪上吸水紙,反置384微孔板,50 r/min瞬離心上清液。

步驟4(洗滌核酸):向瞬離心后的384微孔板中加入20 μL的70%無水乙醇,室溫放置 10 min,4 000 r/min離心10 min,50 r/min倒置瞬離去上清,風干管內(nèi)溶液。

步驟5(保存核酸):加入10 μL去離子水,完全溶解DNA,即可進行PCR反應。

2.3 PCR擴增反應及電泳

DNA模板準備:利用自動聯(lián)排移液器取2 μL基因組 DNA轉移至384孔PCR板中,每孔的PCR反應液體系包括:2×SanTaq PCR Mix預混酶(Sangon Biotech,上海)5 μL, 第1對PCR引物(含10 μmol·L-1Del-11正向引物與10 μmol·L-1Del-11反向引物)各0.5 μL, 第2對PCR引物(含10 μmol·L-1Del-1021正向引物與10 μmol·L-1Del-1021反向引物)各0.5 μL, 加入滅菌超純水(ddH2O)至10 μL。

提取的大豆葉片DNA用設計的缺失區(qū)間內(nèi)的與突變表型緊密連鎖的引物del-11和del-1021進行PCR擴增。del-11上游引物:CCCATTCGTGTCACTGTCAC;del-11下游引物:AGGTGCACATAGGGGAAGTG;del-1021上游引物:TCCTAAGCAGCTTCCACGAT;del-1021下游引物:CTACGACGAGTTCCTCCGAG。

PCR反應條件為:95 ℃ 預變性 5 min;95 ℃ 變性1 min,59 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸40 s,總計33個循環(huán);72 ℃ 延伸7 min;4 ℃ 保存。

電泳及其顯色:采用 2%瓊脂糖凝膠用SuperRed/GelRed(Biosharp)染色,在Gel Image System Tanon-1600(Tanon)上掃描成像。利用本實驗的取樣方法進行提取植物基因組DNA,與常規(guī)單管CTAB法對比,兩種方法結果對比如圖4所示。

M為2K DNA Marker;1～4:高通量384板CTAB法(黃化突變體植株);5～8:CTAB單管法(黃化突變體植株);9～12:高通量384板CTAB法(野生型植株);13～16:CTAB單管法(野生型植株)。圖4 使用del-11F/R與del-1021F/R兩對引物進行PCR鑒定引物多態(tài)性

結果表明,使用本實驗的取樣方法,利用改良后的CTAB法提取的植物基因組DNA效果較好,條帶亮度與常規(guī)單管CTAB法基本無異,可以鑒別基因型。

3 應用實例及注意事項

本研究建立了一種高通量、高效率提取植物葉片組織DNA的方法,只需利用實驗室內(nèi)常見的工具即可實現(xiàn)同時提取大量DNA的實驗要求。所建立的技術方法,每人每日可提取384深孔板4～6板,相當于1 500～2 300個大豆樣本,與常用的單管提取法相比,效率顯著提高。

在大豆突變體庫中[11]M3代中,篩選出一個苗期黃化致死突變分離株行,正常株與突變株的比例為3∶1,經(jīng)混池測序與BVF-IGV流程分析[12],初步確定候選基因為位于10號染色體的32 338 071 bp～34 915 651 bp區(qū)間內(nèi)約2.6 Mb的大片段缺失。因突變?yōu)槊缙谥滤辣硇?推測分離株行中的正常株中有雜合型突變基因。在分離株行正常株與合豐55進行雜交F2代中,出現(xiàn)了1∶3分離群體,并利用該群體來驗證根據(jù)大片段缺失由來的分子標記與黃化表型的關聯(lián)。

按照本研究設計的方法,采集了3個384孔板,共1 150個樣本,其中正常表型植株共1 011株,突變表型植株共139株,經(jīng)本研究所述方法進行DNA提取,經(jīng)過鑒定,正常表型植株共960株PCR結果為雙條帶,引物與表型匹配率達94.96%。突變表型植株共138株無條帶,1株結果為雙條帶,鑒定結果引物與表型匹配率達99.28%。通過該方法,成功證明表型與所設計的Indel引物關聯(lián),可用于后續(xù)定位目的基因。由圖5可見,使用兩對大片段缺失區(qū)間內(nèi)有200 bp左右差異的Indel引物進行PCR,在高通量鑒定系統(tǒng)中,兩引物間不互相影響。

圖5 大片段缺失多態(tài)性連鎖引物鑒定結果

如圖5所示,在大片段缺失區(qū)間內(nèi)和缺失區(qū)間兩端,每隔2 000 bp設計一對引物,使用該方法,我們成功鑒定出多對可以用于后續(xù)研究的與表型連鎖的多態(tài)性引物,成功將Indel分子標記與表型緊密關聯(lián)起來。

4 結語

如何快速標準取樣及如何高通量提取DNA一直是制約植物、作物分子鑒定的關鍵步驟[13]。本研究提出的高通量葉片標準取樣法及DNA提取鑒定技術,適用多種植物及作物,使用384微孔深孔板及吸管即可完成標準化定量取樣工作,同時應用改良的武林琳的CTAB法[10]進行DNA提取,一至兩小時即可提取數(shù)個384深孔板,且片段完整,PCR擴增效果較好,且結果準確。與傳統(tǒng)單管式CTAB法相比,本方法操作簡單,步驟少,耗時短,使用氯仿等有毒有害有機溶劑量少,所需樣本量低,對植物損傷較小,可大幅度節(jié)約實驗時間和成本,對于植物分子標記及快速DNA檢測研究具有重要應用價值。