陳凱利，班文卓，杜靈娟，周興華，張雄飛

1. 西南大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，重慶 榮昌 402460；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100； 3. 西南大學(xué) 榮昌校區(qū)黨工委、管委會，重慶 榮昌 402460

睡蓮(Nymphaeaspp.)是睡蓮科(Nymphaeaceae)睡蓮屬(Nymphaea)多年生浮葉水生觀賞草本的統(tǒng)稱,50多個種或變種廣布在從熱帶到寒帶的各個區(qū)域,按其生態(tài)型主要分為熱帶睡蓮和耐寒睡蓮[1-2].睡蓮因其多樣的花香、花色和獨特的花型,廣泛應(yīng)用于園林水景、室內(nèi)外花卉裝飾、鮮切花等.睡蓮生長發(fā)育對氮、磷等需求量大,根系發(fā)達,對水體中的一些重金屬如鉻、鎳有較強的吸附能力,在水體生態(tài)修復(fù)方面具有較突出的優(yōu)勢[3-4].睡蓮根莖可入藥作為麻醉劑、收斂劑、抗炎劑等治療疾病,一些種類的花、嫩葉、葉柄可用于餐飲[5-8].睡蓮屬于基部被子植物,是研究植物進化的重要材料[9-10].睡蓮栽培歷史悠久,尤其是在西方文明中被視為圣潔的象征[11].因此,睡蓮集觀賞、生態(tài)、藥用、食用、科研和文化價值于一身,成為水生觀賞植物研究的重點和熱點．

花色是觀賞植物最重要的性狀之一[12],決定了觀賞植物的價值.睡蓮的花色不但有常見的紅、白、黃、紫色系,還有其他植物稀缺的藍色系,這使其在藍色花育種方面?zhèn)涫荜P(guān)注[2,10-11,13].關(guān)于睡蓮的花色研究,已有報道解析了常見的熱帶和耐寒睡蓮花瓣類黃酮含量、組分與花色的關(guān)系,綜述了睡蓮花色研究進展,為睡蓮花色育種研究提供了有力支撐[2,10-11,13-20].類黃酮是植物花色的主要呈色物質(zhì)之一,主要包括花青苷、黃酮醇苷、黃酮類等.在類黃酮生物合成途徑中,編碼查爾酮合成酶(CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)、黃烷酮3-羥化酶(F3H)、類黃酮3′-羥化酶(F3′H)、類黃酮3′5′-羥化酶(F3′5′H)、黃酮醇合成酶(FLS)、二氫黃酮醇 4-還原酶(DFR)、花青素合成酶(ANS)、糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)等類黃酮生物合成的核心結(jié)構(gòu)基因,同時,調(diào)控這些結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄因子MYB,bHLH和WD40也起到了重要作用[21-22].因此,研究植物花瓣中類黃酮的組分和含量、花色遺傳規(guī)律、生物合成途徑以及花色關(guān)鍵基因及其功能,解析花色形成的物質(zhì)基礎(chǔ)、分子機理和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),可為培育花色新品種提供理論參考[2,23].在花色分子育種方面,對類黃酮合成途徑相關(guān)基因進行遺傳調(diào)控是實現(xiàn)花色改良的主要途徑[22],如利用基因工程技術(shù)進行花色改良培育出了藍色月季(Rosachinensis)和菊花(Chrysanthemum×morifolium)新品種[24-25]．

近年來,隨著對睡蓮花色形成分子機理的深入研究,目前已鑒定了睡蓮類黃酮代謝途徑的一些關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因如F3H[26],GT6[27]和R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子基因MYB6[28],并進行了功能分析.但是關(guān)于藍星睡蓮(N.colorata)的類黃酮成分和含量以及花色發(fā)育關(guān)鍵基因的深入分析與挖掘,還鮮見報道.藍星睡蓮屬于廣熱帶亞屬睡蓮,有本種藍色花和天然突變體白色花兩種花色,基因組小,為2倍體,是研究睡蓮藍色花形成的理想模式材料[10].本研究以藍、白兩種花色的藍星睡蓮為試材,解析不同花發(fā)育時期花瓣類黃酮成分和含量,同時對類黃酮生物合成途徑核心基因進行實時定量PCR(RT-qPCR)分析,鑒定藍星睡蓮藍色花形成和藍白花色差異的關(guān)鍵基因,為進一步闡明藍星睡蓮類黃酮生物合成機制奠定基礎(chǔ),同時也為睡蓮藍色花分子育種提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試藍花和白花藍星睡蓮種球購于南京藝蓮苑,種植于西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院水生植物資源圃.材料采樣時間為7-8月,分別采集5個發(fā)育時期的花瓣.花瓣的5個發(fā)育時期劃分以花瓣著色程度為依據(jù),S1: 未著色的花瓣; S2: 花瓣中部以上著色; S3: 花瓣全部呈紫紅色; S4: 花瓣全部為藍紫色但未開放; S5: 花開放第1天.將試驗材料置于液氮中速凍后放于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2 藍星睡蓮不同發(fā)育時期花青苷和黃酮醇含量與成分的測定

新鮮藍星睡蓮花瓣經(jīng)液氮研磨后采用提取液提取花青苷和黃酮醇苷,提取方法參照Wu等[13]的方法.花青苷和黃酮醇苷含量采用Agilent 1260(Agilent,美國)測定.梯度洗脫程序為: 流動相A為0.1%甲酸,流動相B為乙腈; 0 min 5% B,6 min 45%B,9 min 90% B,9.1 min 10% B,13 min 10% B,13.5 min 5% B,20 min 5% B.流速0.5 mL/min,進樣量為7 μL.色譜柱為Agilent TC-C18 column(5 mm,4.6 mm × 250 mm),柱溫35 ℃,樣品室溫度10 ℃.以矢車菊素3-O-葡萄糖苷(Cyanidin 3-O-glucoside,Cy3G)和蘆丁(Rutin)作為標準品.以每克鮮質(zhì)量(FW)中含有的毫克數(shù)為單位計算,3個生物學(xué)重復(fù),使用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行Turkey方差分析,顯著性分析水平為p<0.05．

花青苷和黃酮醇苷成分采用UPLC-Triple-TOF/MS系統(tǒng).AcquityTMultra型高效液相色譜儀 (Waters,美國)和Triple TOF 5600+型飛行時間質(zhì)譜以及電噴霧離子源 (AB SCIEX,美國) 系統(tǒng)進行測定,具體方法參考文獻[22].僅梯度洗脫程序稍加改動: 流動相A為0.1%甲酸,流動相B為乙腈; 0 min 5% B,6 min 45%B,7 min 90% B,7.1 min 10% B,10 min 10% B,10.2 min 5% B,13 min 5% B.流速0.4 mL/min,進樣量為7 μL.花青苷和黃酮醇苷物質(zhì)通過質(zhì)譜結(jié)果,結(jié)合軟件數(shù)據(jù)庫搜索、出峰順序以及對應(yīng)參考文獻[5,10,13-17,20]進行成分鑒定．

1.3 藍星睡蓮不同發(fā)育時期總RNA提取及cDNA合成

藍色、白色藍星睡蓮5個發(fā)育時期的花瓣經(jīng)液氮充分研磨后,使用Omega Plant RNA Kit(Omega,美國)提取Total RNA.獲得的Total RNA經(jīng)質(zhì)檢合格后,采用反轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser Kit(Takara,日本)進行反轉(zhuǎn)錄,獲得相應(yīng)的cDNA后分別稀釋5倍后用于熒光定量PCR試驗．

1.4 藍星睡蓮花色形成過程中相關(guān)基因表達分析

分別以類黃酮生物合成途徑相關(guān)基因(CHS,CHI,F3H,FLS,F3′H,F3′5′H,DFR,ANS,GT,MYB1,bHLH1,WD40)和內(nèi)參基因NcACT11的RT-qPCR引物(表1),分析它們在藍星睡蓮不同花發(fā)育時期(S1～S5)的轉(zhuǎn)錄表達情況.RT-qPCR采用ABI QuantStudioTM3 Real-Time PCR Systems(ABI,美國)測定.熒光染料為NovoStart?SYBR qPCR Super Mix Plus(novoprotein,中國),反應(yīng)體系和反應(yīng)程序按說明書進行.試驗設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù),用2-ΔΔCT方法計算基因的相對表達量,使用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行Turkey方差分析,顯著性分析水平為p<0.05．

表1 本文熒光定量PCR所用相關(guān)引物

2 結(jié)果與分析

2.1 藍星睡蓮不同發(fā)育時期花瓣花青苷和黃酮醇苷含量

采用高效液相色譜法對兩種花色藍星睡蓮5個發(fā)育時期花瓣(S1～S5,圖1)的花青苷、黃酮醇苷含量進行了測定.結(jié)果表明,藍、白花瓣花青苷和黃酮醇苷在各個時期的成分一致.藍、白藍星睡蓮花瓣除在S1時期無花青苷積累,其他時期均檢出花青苷,其含量均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(圖2a).具體地講,在未著色的S1時期未檢測到花青苷,隨著花發(fā)育進程,花青苷在S2時期開始積累,花瓣呈藍紫色; 花青苷從頂部逐漸向基部擴展,藍花花瓣花青苷含量在S3時期達到最大值(0.015 mg/g FW),花色仍為藍紫色; 在S4和S5時期,花青苷含量逐漸降低,花瓣呈藍色.藍花花瓣花青苷含量在S3～S5時期無顯著性差異,但與其他時期均有顯著性差異.白花花瓣花青苷含量在S4時期達到最大值,僅0.040 mg/g,5個時期的花青苷含量無顯著性差異.在著色的花瓣中,除S2時期,藍花花瓣花青苷含量均顯著高于白花．

同時測定了兩種顏色花瓣黃酮醇苷含量,結(jié)果表明,隨著花發(fā)育進程,藍星睡蓮藍花花瓣黃酮醇苷含量呈先緩慢升高后快速上升的趨勢,在S5時期達到最大值(1.327 mg/g),與其他時期花瓣黃酮醇苷含量均有顯著性差異.而白花花瓣黃酮醇苷含量在5個花發(fā)育時期變化不大,含量均在0.100 mg/g左右浮動.藍、白花瓣的黃酮醇苷含量在S1,S2時期相當,但在S3時期前者比后者增加了1倍,到S4,S5時期,藍花花瓣黃酮醇苷含量與白花的均呈現(xiàn)出顯著性差異,在S5時期,藍花是白花的10倍(圖2b)．

圖1 藍星睡蓮(Nymphaea colorata)5個發(fā)育時期花朵(S1～S5)的形態(tài)

藍星睡蓮花瓣花青苷和黃酮醇苷含量采用HPLC法測定,檢測波長分別為525 nm和350 nm.分別采用標準品Cy3G和蘆丁半定量的方法計算單位鮮質(zhì)量花瓣中花青苷和黃酮醇苷的質(zhì)量分數(shù).數(shù)據(jù)為3次生物學(xué)重復(fù)平均值,SE表示標準誤.方差分析采用Turkey統(tǒng)計方法,小寫字母不同表示不同花色不同發(fā)育時期花瓣類黃酮含量在p<0.05水平有顯著差異．圖2 HPLC測定藍星睡蓮5個發(fā)育時期花瓣的花青苷和黃酮醇苷質(zhì)量分數(shù)

2.2 藍星睡蓮不同發(fā)育時期花青苷和黃酮醇苷成分分析

通過UPLC-Triple-TOF/MS系統(tǒng)測定了花瓣花青苷和黃酮醇苷的主要成分,在正離子模式下,共推定了藍星睡蓮花瓣中的花青苷主要有3種(圖3a,表2,a1～a3).花瓣在S1時期無花青苷積累,在S2,S3時期主要呈色花青苷為a1飛燕草素-3-O-β-半乳糖苷(delphinidin 3-O-β-galactopyranoside,Dp3Ga),其次為a3飛燕草素-3-O-(2″-O-沒食子酰-6″-O-乙酰-β-半乳糖苷)(delphinidin 3-O-(2″-O-galloyl-6″-O-acetyl-β-galactopyranoside),Dp3galloyl-acetyl-Ga); 在S4和S5時期,花青苷a1和a3含量明顯減少,主要呈色花青苷為a2飛燕草素-3′-O-(2″-O-沒食子酰-6″-O-乙酰-β-半乳糖苷)(delphinidin 3′-O-(2″-O-galloyl-6″-O-acetyl-β-galactopyranoside),Dp3′galloyl-acetyl-Ga)(圖3a,表2)．

在負離子模式下,在藍星睡蓮花瓣中共鑒定出11種黃酮醇苷(圖3b,表2,f1～f11),主要為楊梅素、槲皮素和山奈酚的衍生物.組分f1～f3在所有時期的花瓣中均存在,其中組分f1槲皮素3-O-半乳糖苷(quercetin 3-O-galactoside,Qu3Ga)是S1～S3時期的主要黃酮醇苷.隨著花發(fā)育進程,其他組分也逐漸被檢出.在花發(fā)育后期S4,S5時期,其主要黃酮醇苷為組分f8楊梅素 3-O-α-L-(3″-O-丙二酰)-鼠李糖苷(myricetin 3-O-α-L-(3″-O-malonyl)-rhamnopyranoside,My3malonyl-Rh),其次是組分f4楊梅素 3-O-α-L-鼠李糖甘(myricetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside,My3Rh)、組分f6楊梅素 3-O-α-L-(3″-O-乙酰)-鼠李糖苷(myricetin 3-O-α-L-(3″-O-acetyl)-rhamnopyranoside,My3acetyl-Rh)、組分f1 Qu3Ga、f10槲皮素3-O-α-L-(3″-O-丙二酰)-鼠李糖苷(quercetin 3-O-α-L-(3″-O-malonyl)-rhamnopyranoside,Qu3malonyl-Rh)．

S1～S5為花瓣的5個花發(fā)育時期; a1～a3表示花青苷組分,f1～f11表示黃酮醇苷組分．圖3 藍星睡蓮藍色花瓣花青苷(a)和黃酮醇苷(b)色譜圖

表2 藍星睡蓮花瓣花青苷和黃酮醇苷質(zhì)譜參數(shù)及推斷結(jié)構(gòu)

2.3 RT-qPCR分析藍星睡蓮不同發(fā)育時期類黃酮合成途徑基因的表達變化

為了探索藍星睡蓮花青苷和黃酮醇苷含量變化與物質(zhì)合成途徑相關(guān)基因表達的關(guān)系,依據(jù)本研究花青苷和黃酮醇苷分析結(jié)果與課題組前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),本研究選擇了類黃酮生物合成途徑中的編碼核心酶和調(diào)控蛋白的基因進行轉(zhuǎn)錄表達分析.結(jié)果表明,F3′5′H,FLS,DFR隨著藍色花瓣花發(fā)育進程均呈現(xiàn)出逐漸升高,在S3時期達到峰值,然后下降的趨勢,與其花青苷積累變化趨勢相似.此外,F3′5′H和GT在藍色藍星睡蓮花瓣中的表達量均高于白色種,F3′5′H和GT分別在藍色花瓣S3,S4時期和S4,S5時期的表達量顯著高于其他時期,而F3′H,DFR則在白色花瓣中的表達量略高于藍色種(圖4)．

S1～S5為花瓣的5個花發(fā)育時期; NcACT11為內(nèi)參基因,每列代表3次生物學(xué)重復(fù)的平均值,誤差線表示平均結(jié)果的標準誤(SE).方差分析采用Turkey統(tǒng)計方法,小寫字母不同表示基因在不同發(fā)育時期藍白花瓣中的表達在p<0.05水平有顯著差異．圖4 類黃酮合成途徑結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子基因在藍星睡蓮5個花發(fā)育時期花瓣中的轉(zhuǎn)錄表達分析

3 討論與結(jié)論

花瓣的呈色是多因素綜合的結(jié)果,其中色素種類和含量是最主要的因素[12,22-23,29].本研究中,藍星睡蓮不同花發(fā)育時期花色出現(xiàn)變化,在S2～S3時期花瓣呈藍紫色,主要呈色花青苷為Dp3Ga,其次為Dp3galloyl-acetyl-Ga; 在S4～S5時期花瓣呈藍色,主要呈色花青苷為Dp3′galloyl-acetyl-Ga.Zhu等[15]認為熱帶睡蓮花瓣呈藍紫色主要是因為飛燕草素3位被?；擒招揎?而呈藍色則是飛燕草素3′位發(fā)生酰基化糖苷修飾.在S2,S3時期,正是由于飛燕草素3位發(fā)生了糖苷和?；擒盏男揎?導(dǎo)致花瓣主要呈藍紫色; 在S4,S5時期,主要是飛燕草素3′位發(fā)生?；擒招揎?而使花瓣主要呈藍色.這與朱滿蘭[30]對35種熱帶睡蓮花青苷成分的分析結(jié)果一致,該研究結(jié)果認為熱帶藍色系睡蓮大部分只有Dp3Ga,少數(shù)品種以Dp3′Ga為主,Dp3Ga次之,而藍星睡蓮屬于這其中的少數(shù)品種．

本研究在藍星睡蓮花瓣中只檢出了1種花青素苷元即飛燕草素,但其衍生物花青苷有3種,其中S4,S5時期的主要呈色物質(zhì)為Dp3′galloyl-acetyl-Ga,與先前報道的結(jié)果一致[10].本研究細化了藍星睡蓮花色發(fā)育過程,在該物種中檢測到了另外2種花青苷物質(zhì)Dp3Ga和Dp3galloyl-acetyl-Ga,它們在其他熱帶睡蓮中也有報道[13,15].藍星睡蓮花瓣黃酮醇苷以楊梅苷為主,達6種; 其次是槲皮苷,共4種; 只檢測到了1種山奈酚苷.朱滿蘭[30]認為,在熱帶藍色系睡蓮中,絕大多數(shù)品種以槲皮苷型色素為主,少數(shù)以山奈酚苷為主,極少部分以楊梅苷為主; 而本研究中,在花瓣發(fā)育過程中,黃酮醇苷的主要成分由前期以槲皮苷為主逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楹笃谝詶蠲奋諡橹?這說明共色素黃酮醇苷的種類和含量也隨花色發(fā)育進程而發(fā)生變化．

在類黃酮含量方面,藍星睡蓮花瓣著色從頂端開始向基部蔓延,藍花花青苷積累隨花發(fā)育進程出現(xiàn)先穩(wěn)步上升后逐漸降低的趨勢,在S3～S5時期顯著高于白花品種; 在含量差異最大的S3時期,藍花花瓣花青苷含量比白花高約50倍.黃酮醇苷作為花青苷的共色素,可以提升植物的顯色[31].本研究中,藍星睡蓮藍花花瓣黃酮醇含量隨花發(fā)育進程逐漸增加,其中,在S4,S5時期急劇增加,顯著高于同時期的白花花瓣.在藍花花瓣中,花青苷和黃酮醇苷含量和主要呈色物質(zhì)隨發(fā)育進程而出現(xiàn)變化,從而導(dǎo)致花色也隨之改變,而在白花花瓣中,雖在S2～S5時期檢測到了花青苷,但含量顯著低于藍花; 此外,白花花瓣中的黃酮醇苷含量在5個花發(fā)育時期變化不大,在0.100 mg/g附近輕微浮動,尤其是在S4～S5時期,含量遠低于藍花花瓣.因此,花青苷成分變化是引起藍花花色變化的直接原因,而花青苷含量的巨大差異是造成藍、白花色差異的主要原因,黃酮醇苷含量差異加劇了這種花色差異．

研究表明,CHS,CHI,F3H,FLS,F3′H,F3′5′H,DFR,ANS,GT這一系列催化酶和轉(zhuǎn)錄復(fù)合物MYB-bHLH-WD40在類黃酮合成路徑中發(fā)揮重要作用[21-22].本研究中,通過RT-qPCR分析編碼這些酶的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因在藍、白色花瓣中的表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著花發(fā)育進程的推進,F3′5′H,FLS,DFR表達變化與藍色花瓣花青苷積累變化趨勢一致,推測其可能是藍色花形成的關(guān)鍵基因.通過對藍星睡蓮MYB1-bHLH1-WD40轉(zhuǎn)錄復(fù)合物進行轉(zhuǎn)錄表達分析,發(fā)現(xiàn)它們與花色發(fā)育關(guān)系不大,可能不是影響藍星睡蓮花色發(fā)育的調(diào)控因子,具體的關(guān)鍵調(diào)控因子還有待進一步挖掘.吳倩[27]和田潔[28]推定GT6和MYB6是“泰國王”睡蓮花色形成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子.在葡萄風(fēng)信子亞美尼亞(Muscariarmeniacum)藍色花發(fā)育過程中,R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因MaAN2與MaDFR和MaANS協(xié)同表達,且與花瓣花青苷積累趨勢一致,表明它們可能是葡萄風(fēng)信子花瓣花色發(fā)育的關(guān)鍵基因[32],進一步的研究表明轉(zhuǎn)錄因子MaMybA,MaAN2與MabHLH1互作靶向MaDFR和MaANS,協(xié)作調(diào)控藍色花瓣花青苷的積累[33]．

Zhang等[10]通過對藍星睡蓮盛開的(等同于本研究中的S5時期)藍白花瓣轉(zhuǎn)錄組測序,推測ANS和GT可能是造成藍白花色差異的關(guān)鍵基因.本研究通過動態(tài)檢測類黃酮合成途徑中關(guān)鍵基因在不同發(fā)育時期的藍白花瓣中的表達,結(jié)果表明,ANS在藍白花瓣各時期的表達差異不明顯,而F3′5′H和GT在藍花中的表達量均高于白花,DFR和F3′H則剛好相反,推測在藍花中表達上調(diào)的F3′5′H將底物向飛燕草素方向分流,且GT將不穩(wěn)定的花青素轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的花青苷; 而在白花中上調(diào)的DFR將底物向無色花青素方向催化,F3′H將底物向黃酮醇方向催化,且GT在白花中低表達,導(dǎo)致白花花青苷和黃酮醇苷積累減弱,花色減淡.Liu等[34]通過研究不同花色毛茛的基因表達情況發(fā)現(xiàn),紅色花品種中F3H,F3′H,3GT,5GT和FMT2(類黃酮-O-甲基轉(zhuǎn)移酶2基因)上調(diào)表達,而紫色花品種中,F3′5′H和3MAT(花色苷3-O-葡萄糖苷-6-O-丙二酰基轉(zhuǎn)移酶基因)轉(zhuǎn)錄水平升高,說明不同花色毛茛中的高表達基因不同.葡萄風(fēng)信子亞美尼亞藍白花色差異的主要原因是白色葡萄風(fēng)信子DFR低表達和FLS高表達,FLS強勢競爭底物導(dǎo)致白色葡萄風(fēng)信子無法合成飛燕草素[35].由此可見,植物花色豐富,花色形成差異的原因也因物種不同而不同.因此,只有有針對性地解析不同物種花色形成的機理,總結(jié)花色發(fā)育規(guī)律,才能更好地為花色分子育種提供可靠的理論參考．