吳天樂(lè)，王磊，王冰楠，孫雪，楊曉偉，周榮瓊

西南大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 榮昌 402460

犬弓首蛔蟲(chóng)(Toxocaracanis,T.canis)是一種廣泛分布于世界各地的人獸共患寄生線蟲(chóng).T.canis生活史復(fù)雜,其蟲(chóng)卵隨糞便排出后,在適宜的自然環(huán)境下發(fā)育為感染性蟲(chóng)卵[1-3].終末宿主攝入感染性蟲(chóng)卵后,幼蟲(chóng)經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)移行至腸道發(fā)育為成蟲(chóng).非特異宿主攝入感染性蟲(chóng)卵后,幼蟲(chóng)不能發(fā)育為成蟲(chóng),而是移行到神經(jīng)、肌肉、內(nèi)臟等組織器官,成為滯育的感染性L3幼蟲(chóng)[4-5].人(特別是兒童)因污染的水、土壤、水果和蔬菜中的感染性蟲(chóng)卵或食入來(lái)自非特異性宿主如牛、羊、兔、雞等未煮熟的肉/內(nèi)臟中滯育的感染性幼蟲(chóng)而感染.根據(jù)侵入器官、感染強(qiáng)度、遷移持續(xù)時(shí)間及年齡和宿主的免疫反應(yīng),可以導(dǎo)致多種臨床綜合征[6-7].此外,感染性蟲(chóng)卵還可引起心肌內(nèi)膜炎、腦膜炎、眼內(nèi)炎、哮喘及癲癇等疾病,因此研究犬弓首蛔蟲(chóng)在獸醫(yī)學(xué)及公共衛(wèi)生學(xué)上都具有重要意義．

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)是一種廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)的金屬酶類[8-10].根據(jù)輔基所結(jié)合的金屬離子不同,SOD可分為4種類型,分別為Cu/Zn-SOD,Mn-SOD,Fe-SOD及Ni-SOD[11],只在某些極少數(shù)原核細(xì)菌中報(bào)道有NiSOD存在[12].SOD是維持抗氧化系統(tǒng)的第一道防線,它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成過(guò)氧化氫(H2O2)和氧(O2),在保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受氧自由基毒害中起到至關(guān)重要的作用,且與很多疾病的發(fā)生和發(fā)展緊密相關(guān)[13].寄生蟲(chóng)SOD在抗氧化、免疫逃避和蟲(chóng)體存活等過(guò)程中起著重要的作用.據(jù)報(bào)道,大片吸蟲(chóng)(Fasciolagigantica)分泌排泄蛋白SOD誘導(dǎo)的抗氧化作用與蟲(chóng)體逃避中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的免疫反應(yīng)有關(guān)[14]; 瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumvinckei) SOD通過(guò)降解宿主紅細(xì)胞的血紅蛋白產(chǎn)生ROS,以利于紅細(xì)胞內(nèi)瘧原蟲(chóng)的存活[15]; 克氏錐蟲(chóng)(Trypanosomacruzi) MnSOD缺乏會(huì)加劇線粒體電子傳遞鏈的功能障礙,并造成患病動(dòng)物心臟的過(guò)度氧化損傷[16]．

目前,對(duì)于犬弓首蛔蟲(chóng)超氧化物歧化酶的研究較少.本研究運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù),首先克隆Tc-sod基因并進(jìn)行序列分析; 隨后構(gòu)建Tc-sod/pET-32a原核表達(dá)載體并制備多克隆抗體,以期為進(jìn)一步研究Tc-SOD的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材料

T.canis蟲(chóng)體采自于西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)院的患病犬.蟲(chóng)體經(jīng)過(guò)洗滌及形態(tài)學(xué)鑒定后冷凍于液氮中.從T.canis雌蟲(chóng)卵巢收集蟲(chóng)卵,放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2周獲得L2幼蟲(chóng); 新西蘭大白兔購(gòu)自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心．

PremixTaq DNA聚合酶、pMD19-T (simple)Vector、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、BamHI、PrimeScriptTMRT reagent Kit購(gòu)自TaKaRa公司; Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen(賽默飛)公司; HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自Sangon Biotech公司、Ni-NTA純化樹(shù)脂預(yù)裝柱、Protein A+G Agarose抗體純化試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司、EasyPure?膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京TransGen Biotech(全式金)公司．

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)T.canis基因組數(shù)據(jù)(GenBank: AAB00227.1),利用Primer-Premier 6.0對(duì)Tc-sod進(jìn)行引物設(shè)計(jì).基因克隆引物(F1: 5’-ATGACAGGATTGTTATTGGC-3’; R1: 5’-TTACGGTGCGCCTGAGCTC-3’)和原核表達(dá)引物(F2: 5’-CGCGGATCCATGCAAAGACCAAATTCA-3’,引入酶切位點(diǎn)BamHI; R2: 5’-CCGCTCGAGTTACGGTGCGCCTGAGCT-3’,引入酶切位點(diǎn)XhoⅠ),送至重慶擎科興業(yè)生物科技有限公司進(jìn)行合成．

1.2.2 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

采用TRIzol法提取T.canis雄蟲(chóng)、雌蟲(chóng)和L2幼蟲(chóng)的總RNA,并用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)其濃度和純度; 以提取的總RNA為模板,按PrimeScriptTMRT reagent Kit說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA．

1.2.3Tc-sod全長(zhǎng)基因克隆和序列分析

以反轉(zhuǎn)錄的T.canis雄蟲(chóng)、雌蟲(chóng)和L2幼蟲(chóng)cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)條件為: 94 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,共35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸10 min,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統(tǒng)掃描并記錄結(jié)果．

按照EasyPure?膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)切膠回收PCR產(chǎn)物,將回收產(chǎn)物與pMD19-T (simple)Vector載體進(jìn)行連接,全部連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至100 μL大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于含IPTG和X-gal的LB/Amp+瓊脂平板中,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)30 min,再倒置培養(yǎng)12～16 h.挑取單菌落接種于含LB/Amp+液體培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12～24 h,將菌液PCR鑒定為陽(yáng)性的重組菌液送至重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序.測(cè)序結(jié)果利用Clustal Omega軟件進(jìn)行多重序列比對(duì); 采用MEGA 7.0的鄰接法(Neighbour-joining,NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),并用Bootstrap進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)可靠性分析,共1 000個(gè)重復(fù)．

1.2.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

按質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒Tc-sod/pMD19-T和pET-32a質(zhì)粒,經(jīng)限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamHI雙酶切,切膠回收目的基因Tc-sod與pET-32a質(zhì)粒、DNA Ligation Kit進(jìn)行連接反應(yīng).在冰上配制連接反應(yīng)液: Digested pET-32a DNA 1 μL、Tc-sod4 μL、Ligation Mix 5 μL; 16 ℃反應(yīng) 1 h.重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)藍(lán)白斑篩選后挑取白色單個(gè)菌落接種于LB/Amp+液體培養(yǎng)基中,37 ℃ 185 r/min培養(yǎng)12～14 h.利用北京TransGen Biotech(全式金)質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒,進(jìn)行PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定．

1.2.5 目的蛋白的表達(dá)與純化

挑選陽(yáng)性菌,經(jīng)PCR鑒定后提取質(zhì)粒,并將其轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,挑單菌落接種于LB/Amp+液體培養(yǎng)基中,37 ℃ 185 r/min振蕩培養(yǎng)3 h,OD600值約為0.8,加入0.4 mmol/L的IPTG 37 ℃誘導(dǎo)8 h; 將菌液置于15 ℃離心機(jī),4 500 r/min離心10 min,收集菌體沉淀,用PBS洗滌離心2～3次后,再用Washing Buffer重懸菌體,并進(jìn)行超聲破碎、離心,分別取破碎上清液和破碎沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè); 采用Ni-NTA純化目的蛋白,并選擇不同濃度梯度的咪唑洗脫液對(duì)目的蛋白進(jìn)行洗脫,利用SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化結(jié)果．

1.2.6 多克隆抗體的制備及特異性鑒定

利用透析法去除重組蛋白中的咪唑,對(duì)蛋白進(jìn)行濃縮以達(dá)到免疫濃度.以新西蘭大白兔(體質(zhì)量2～2.5 kg)為免疫動(dòng)物,首免將250 μg重組蛋白與弗氏完全佐劑1∶1混合,乳化后在頸背部皮下以多點(diǎn)注射的方式對(duì)兩只健康新西蘭大白兔進(jìn)行首免; 初次免疫后每隔2周加強(qiáng)免疫1次,共加強(qiáng)免疫3次.采用250 μg重組蛋白與弗氏不完全佐劑1∶1混合,乳化后免疫.末次免疫7 d后采血,離心取血清.將純化后的重組蛋白用包被液稀釋為5 μg/mL,4包被過(guò)夜,利用ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià),酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450值,當(dāng)檢測(cè)孔與陰性孔的比值大于(等于)2.1時(shí)的最大稀釋倍數(shù)為該血清最高的抗體效價(jià).達(dá)到所需效價(jià)后采血制備、純化多克隆抗體,以兔抗Tc-SOD多克隆抗體1∶10 000稀釋作為一抗,并用辣根過(guò)氧化氫酶(HRP)、標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000)稀釋作為二抗,進(jìn)行Western Blot檢測(cè)．

2 結(jié)果及分析

2.1 Tc-sod全長(zhǎng)基因的PCR擴(kuò)增

經(jīng)PCR擴(kuò)增后1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示Tc-sod在雄蟲(chóng)、雌蟲(chóng)和L2幼蟲(chóng)的全長(zhǎng)CDS(Coding Sequence)序列大小約為573 bp(圖1A).將凝膠回收產(chǎn)物與pMD19-T(simple)連接,經(jīng)菌液PCR鑒定后,電泳結(jié)果顯示在573 bp處有特異性條帶,陰性對(duì)照沒(méi)有出現(xiàn)條帶(圖1B)．

圖1 Tc-sod全長(zhǎng)基因的PCR擴(kuò)增

2.2 Tc-SOD蛋白氨基酸多重序列比對(duì)及種系發(fā)育進(jìn)化分析

將陽(yáng)性克隆的菌液進(jìn)行測(cè)序,并對(duì)從雄蟲(chóng)、雌蟲(chóng)、L2幼蟲(chóng)獲得的堿基序列進(jìn)行分析,結(jié)果顯示Tc-sod全長(zhǎng)基因的序列長(zhǎng)度為573 bp,含有1個(gè)完整的CDS,共編碼190個(gè)氨基酸殘基; 功能結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示Tc-SOD蛋白的1～19位氨基酸為信號(hào)肽區(qū)域,含有一個(gè)跨膜區(qū),46～184位為SOD-Cu保守結(jié)構(gòu)域.將測(cè)序獲得的Tc-SOD氨基酸序列與曼氏血吸蟲(chóng)(Schistosomamansoni; GenBank NO. AAA29934.1)、異尖線蟲(chóng)(Anisakissimplex; GenBank NO. AXS78294.1)、美洲板口線蟲(chóng)(Necatoramericanus; GenBank NO. ETN83232.1),馬來(lái)絲蟲(chóng)(Brugiamalayi; GenBank NO. AAR06638.1)、犬鉤口線蟲(chóng)(Ancylostomacaninum; GenBank NO. RCN48093.1)的SOD蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì),結(jié)果顯示均含有SOD-Cu保守結(jié)構(gòu)域(圖2紅色方框標(biāo)記)．

圖2 Tc-SOD蛋白氨基酸序列多重序列比對(duì)

將Tc-sod編碼的氨基酸序列與GenBank收錄的馬來(lái)絲蟲(chóng)(B.malayi,GenBank NO. AAR06638.1)、曼氏血吸蟲(chóng)(S.mansoni,GenBank NO. AAA29934.1)、家鼠(Musmusculus,GenBank NO. CAA59335.1)、膜殼絳蟲(chóng)(Hymenolepismicrostoma,GenBank NO. CUU99344.1),盤(pán)尾絲蟲(chóng)(Onchocercavolvulus,GenBank NO. CAA57657.1)、犬鉤口線蟲(chóng)(A.caninum,GenBank NO.RCN48093.1)、李斯特菌(Listeriaivanovii,GenBank NO. PZG50121.1)、豬帶絳蟲(chóng)(Taeniasolium,GenBank NO.AEL75047.1)、豬蛔蟲(chóng)(Ascarissuum,GenBank NO. ADY46004.1)、異尖線蟲(chóng)(A.simplex,GenBank NO.AXS78294.1)、有齒食道口線蟲(chóng)(Oesophagostomumdentatum,GenBank NO. KHJ97909.1)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖3),結(jié)果顯示Tc-SOD與馬來(lái)絲蟲(chóng)(B.malayi,GenBank NO. AAR06638.1)處于同一分支,表明其進(jìn)化關(guān)系較近．

圖3 蛋白Tc-SOD氨基酸種系發(fā)育進(jìn)化分析

2.3 Tc-sod/pET-32a表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

將測(cè)序成功的Tc-sod序列亞克隆至pET-32a,經(jīng)菌液PCR檢測(cè),可見(jiàn)1%瓊脂凝膠電泳結(jié)果具有清晰明亮的條帶,且大小與預(yù)期相符(圖4B); 經(jīng)雙酶切鑒定,結(jié)果表明已成功連接至pET-32a(圖4C)．

圖4 Tc-sod/pET-32a表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

2.4 Tc-SOD重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞后挑取單個(gè)菌落培養(yǎng),于37 ℃經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE分析,結(jié)果顯示表達(dá)產(chǎn)物大多數(shù)都是以可溶性蛋白的形式存在于上清液中,只有少量存在于包涵體內(nèi)(圖5A); 重組蛋白Tc-SOD大小約為37 ku; 利用Ni-NTA對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化,結(jié)果表明純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)無(wú)明顯雜帶(圖5B),蛋白具有較高的濃度和純度; 且在篩選純化條件時(shí),選擇70 mmol/L咪唑洗脫液進(jìn)行洗脫的蛋白濃度更高,效果更好(圖6A)．

圖5 Tc-SOD重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

2.5 多克隆抗體的特異性鑒定

將純化后的重組蛋白Tc-SOD包被96孔板,免疫前的血清為陰性對(duì)照,利用間接ELISA法測(cè)定兔抗Tc-SOD多克隆抗體的效價(jià),結(jié)果顯示抗體滴度>1∶320 000,具有較高的效價(jià),可用于后續(xù)試驗(yàn).Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示兔抗Tc-SOD多克隆抗體較高,能和重組Tc-SOD蛋白特異性結(jié)合,表明其具有較好的特異性．

圖6 Tc-SOD蛋白純化及多克隆抗體的特異性鑒定

3 討論

超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)普遍存在的一類重要金屬抗氧化酶,在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用,其經(jīng)典功能是清除體內(nèi)超氧陰離子并參與活性氧自由基代謝.研究表明,SOD與抗氧化、心血管疾病、腫瘤及免疫逃避等密切相關(guān)[17-19].此外,SOD還參與生物機(jī)體的多種生理/病理反應(yīng).在小鼠體內(nèi)SOD參與調(diào)節(jié)乳腺發(fā)育所需的蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子對(duì)氧化應(yīng)激的不同敏感反應(yīng),被證明與小鼠的乳腺發(fā)育及哺乳有關(guān)[20].在微生物中ROS細(xì)胞水平由抗氧化酶和小分子抗氧化劑控制,當(dāng)細(xì)菌被免疫效應(yīng)細(xì)胞吞噬后暴露在氧化應(yīng)激環(huán)境下,細(xì)菌將能量從細(xì)胞質(zhì)NADPH轉(zhuǎn)移到抗氧化酶中,從而增強(qiáng)其毒力作用[21]．

寄生蟲(chóng)SOD具有抗氧化、免疫逃避和蟲(chóng)體存活等多種生物學(xué)功能.寄生蟲(chóng)在寄生過(guò)程中既有宿主作為防御系統(tǒng)產(chǎn)生的ROS,也有蟲(chóng)體代謝產(chǎn)生的ROS,因此清除這雙重來(lái)源的ROS成為寄生蟲(chóng)能夠建立長(zhǎng)期寄生的重要前提,而ROS的產(chǎn)生被認(rèn)為是蟲(chóng)體針對(duì)宿主產(chǎn)生免疫逃避的一個(gè)重要防御機(jī)制.盤(pán)尾絲蟲(chóng)(Onchocercavolvulus)微絲蚴和成蟲(chóng)在人體遷移和寄居過(guò)程中通過(guò)SOD清除有毒自由基,以利于蟲(chóng)體存活[22].Lalrinkima等[14]報(bào)道大片吸蟲(chóng)SOD誘導(dǎo)的抗氧化作用與蟲(chóng)體逃避巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(ROS)的免疫反應(yīng)有關(guān)．

本研究發(fā)現(xiàn)犬弓首蛔蟲(chóng)SOD含有保守的SOD-Cu結(jié)構(gòu)域.SOD-Cu作為銅伴侶能介導(dǎo)特定細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子的傳遞途徑,其主要功能是將Cu2+輸送到Cu/Zn SOD不同細(xì)胞內(nèi)的特定靶點(diǎn),對(duì)其功能的發(fā)揮至關(guān)重要.Cu2+與酶活性水平也有密切關(guān)系.在哺乳動(dòng)物中缺乏銅伴侶的小鼠組織SOD基因活性明顯減少,對(duì)氧化應(yīng)激敏感程度更高[23].銅伴侶在介導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中參與激活SOD活性調(diào)節(jié)機(jī)制,通過(guò)調(diào)節(jié)其表達(dá)水平以應(yīng)對(duì)氧化環(huán)境的變化[24].Feng等[25]證明甲殼動(dòng)物的SOD被Cu2+激活后,在免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用．

在重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)中,大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前最為成熟的原核表達(dá)系統(tǒng).本研究所選擇的pET-32a載體表達(dá)的目的蛋白帶有組氨酸標(biāo)簽,能通過(guò)鎳柱有效純化重組蛋白.對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,在37 ℃誘導(dǎo)8 h,能得到大量的可溶性重組蛋白; 通過(guò)鎳柱親和層析純化,最終在70 mmol/L咪唑濃度洗脫時(shí)得到的目的蛋白條帶單一,表明重組蛋白具有較高的濃度和純度.將純化后的重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體,通過(guò)間接ELISA法對(duì)制備的抗Tc-SOD多克隆抗體效價(jià)及抗原特異性進(jìn)行鑒定.結(jié)果顯示本研究成功制備出了抗Tc-SOD多克隆抗體,效價(jià)高達(dá)1>320 000.Western Blot檢測(cè)顯示制備的多克隆抗體能夠識(shí)別Tc-SOD,具有較好的特異性．

4 結(jié)論

犬弓首蛔蟲(chóng)Tc-sod基因全長(zhǎng)序列為573 bp,共編碼190個(gè)氨基酸; 成功構(gòu)建了Tc-sod/pET-32a原核表達(dá)載體,得到了可溶性重組蛋白,免疫新西蘭大白兔并得到了高效價(jià)的多克隆抗體; Western Blot檢測(cè)顯示抗體特異性較高.本試驗(yàn)為后續(xù)Tc-SOD的生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)．