李婉文，杜寧寧，周娟娟，秦俊豪，黎華壽，陳桂葵

(華南農(nóng)業(yè)大學 資源環(huán)境學院,廣東 廣州 510642)

高氯酸鹽(ClO4-)在水中溶解度高、易遷移、難降解，因此被認為是一種持久性污染物[1-2]。高氯酸鹽是火箭的固體推進器、煙花爆竹、火柴等的重要原料之一，應用范圍廣[3]。高氯酸鹽已經(jīng)成為一個全球性污染的環(huán)境問題，在人類難以到達的南極和北極都能檢測到高氯酸鹽的存在[4]。低劑量的高氯酸鹽便能影響動物甲狀腺的正常功能[5-6]。此外，高氯酸鹽還會造成大鼠生殖細胞的DNA 損傷，產(chǎn)生生殖毒性[7]。由于高氯酸鹽具有極高的水溶性且不易被土壤礦物質(zhì)吸附，使得高氯酸鹽一旦進入環(huán)境中，極易在水中富集，通過飲用水、食物鏈進入人體，影響身體健康[8]。最早發(fā)現(xiàn)水體中高氯酸鹽污染并開展系統(tǒng)性研究的國家是美國。研究顯示，內(nèi)華達州 Herderson 地下水中的高氯酸鹽質(zhì)量濃度為3.7×106μg·L-1，地面水質(zhì)量濃度為1.2×105μg·L-1，飲用水中質(zhì)量濃度高達8.11×102μg·L-1[9]。我國亦存在不同程度的高氯酸鹽水體污染。史亞利等[10]檢測發(fā)現(xiàn)，瀏陽河水體中的高氯酸鹽質(zhì)量濃度高達65.8～170.0 μg·L-1。我國13 個省份的地下水高氯酸鹽平均質(zhì)量濃度最高達3.04 μg·L-1[11]。

重金屬鉻(Cr6+)是我國水體中重要的污染物之一[12]，Cr6+能被植物吸收，在植物體內(nèi)積累[13-14]，進而通過食物鏈損害人體健康[15]。鉻在化工行業(yè)應用廣泛，導致環(huán)境中的鉻含量越來越高，我國的鉻污染也愈發(fā)嚴重[16]。與高氯酸鹽相似的是，Cr6+極易溶于水，在水體中極易遷移[16]。此外，高氯酸鹽和鉻鹽常常被用于皮革鞣制和電鍍等工業(yè)領域[17]，兩者的分布區(qū)域重疊范圍大。因此，它們是我國水體中的共同污染物[18]。目前已有大量文獻報道了ClO4-和Cr6+分別對動植物的毒性研究，而它們對水生生態(tài)系統(tǒng)造成的生態(tài)毒理效應的報道極為匱缺。關注污染物對生態(tài)系統(tǒng)如何造成危害，開展相關研究，意義重大。為了研究ClO4-和Cr6+在水生生態(tài)系統(tǒng)中的聯(lián)合效應，本研究設置了一個人工水生生態(tài)系統(tǒng)，考察這2 種污染物對水葫蘆Eichhornia crassipes、隆線溞Daphniacarinata和福壽螺Pomaceacanaliculata的影響，以評估ClO4-和Cr6+復合污染對水生生態(tài)系統(tǒng)帶來的風險，為水環(huán)境監(jiān)測和水體復合污染的治理提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試底泥選用華南農(nóng)業(yè)大學六一區(qū)邵陽湖底泥，去除石子與雜物，經(jīng)測定，該底泥不含ClO4-和Cr6+。供試污水選用華南農(nóng)業(yè)大學嵩山區(qū)生活污水，經(jīng)測定，不含ClO4-和Cr6+。本研究選用的斜生四鏈藻Tetradesmusobliquus購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫；水葫蘆購自廣州市芳村花卉市場，選用長勢一致的植株；隆線溞為單克隆生物株，選用長勢良好的4 齡中型隆線溞；福壽螺取自華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)場試驗基地，選用螺殼高度處于5 ～ 15 mm 的個體。

1.2 主要藥品和試劑

KClO4(AR，上海凌峰化學試劑有限公司) 和K2Cr2O7(AR，上海凌峰化學試劑有限公司)。

1.3 試驗設計

采用2 因素3 水平完全組合試驗方案設計，Cr6+的質(zhì)量濃度分別為0、0.02 和0.20 mg·L-1，分別用Cr0 (CK)、Cr0.02 和Cr0.2 表示，ClO4-的質(zhì)量濃度分別為0、20 和200 mg·L-1，分別用P0 (CK)、P20 和P200 表示，共9 個處理，每個處理3 個重復。

在長×寬×高=0.6 m×0.3 m×0.4 m 的水族缸中鋪一層6 cm 厚的底泥(濕質(zhì)量6 kg)，加入20 L 的生活污水和20 L 的自來水，平衡14 d 后加入100 mL密度為1.0×103mL-1的斜生柵藻、100 只中型隆線溞、2 株水葫蘆、8 只小型福壽螺，1 d 后按試驗設計分別加入9 個處理的污染物Cr6+和ClO4-，分別在第1、4、7、14、21、28 天采集樣品進行測定。

每天用自來水補充蒸發(fā)失水，使人工水生生態(tài)系統(tǒng)的體積保持在40 L。

1.4 主要指標的測定方法

1.4.1 ClO4-含量的檢測 植物、動物樣品前處理：將樣品烘干至恒質(zhì)量，粉碎，混合均勻后過40 目篩。稱0.5 g 樣品放入50 mL 的錐形瓶中，加入10 mL超純水，室溫下放入搖床以200 r·min-1速度萃取2 h?；旌弦阂? 000 r·min-1速度離心25 min，吸取表面溶液用RP 小柱過濾，上機前過0.22 μm 微孔濾膜。

ClO4-含量的測定采用離子色譜法，利用美國戴安 ICS-900 離子色譜儀進行測定，測定參數(shù)：分離柱為IonpacAS20-HC，保護柱為IonpacAG20-H0 C，流動相為30 mmo1·L-1的 KOH，電流87 mA，柱溫30 ℃，流速1.0 mL·min-1。

1.4.2 Cr6+含量的檢測 將動、植物樣品進行微波消解，消解液過濾，用火焰原子光譜儀測定Cr6+含量。

1.4.3 富集系數(shù)的計算 富集系數(shù)[Bio-concentration factors，BCF/(L·kg-1)]是指生物體某一部位的元素含量(mg·kg-1)與環(huán)境中相應元素含量(mg·L-1)之比，它在一定程度上反映著生態(tài)系統(tǒng)中該元素遷移的難易程度。

1.4.4 ClO4-和Cr6+的交互作用類型判斷 為了比較不同污染物處理水平下對人工水生生態(tài)系統(tǒng)中隆線溞和福壽螺生長的作用強度，本研究按照以下方法計算抑制率(Inhibitory rate，Ri)[19]：

式中：C為對照值，T為處理值。當Ri≥0 時，表示處理組與對照組相比具有抑制作用；當Ri＜0 時，表示處理組與對照組相比具有促進作用。

根據(jù)Bliss[20]提出的污染物間交互作用類型：相加、拮抗和協(xié)同作用，本文按照以下方法判斷ClO4-和Cr6+的交互作用類型[21]：

相加作用：ClO4-和Cr6+單一處理之和=ClO4-、Cr6+復合污染；

拮抗作用：ClO4-和Cr6+單一處理之和＞ClO4-、Cr6+復合污染；

協(xié)同作用：ClO4-和Cr6+單一處理之和＜ClO4-、Cr6+復合污染。

先計算各處理組(包括單一處理和復合處理)的抑制率，將相應濃度的ClO4-和Cr6+單一處理的抑制率相加，并與其對應濃度的復合污染進行比較，再根據(jù)上面3 個計算式來判斷ClO4-和Cr6+復合污染的交互作用類型。

1.5 統(tǒng)計分析

所得數(shù)據(jù)為平均值±標準差(Mean ± SD)，采用Microsoft excel 和SPSS16.0 進行計算和統(tǒng)計分析，并用Duncan’s 檢驗法對不同處理的差異顯著性進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 ClO4-、Cr6+單一或復合污染對人工水生生態(tài)系統(tǒng)中植物的影響

經(jīng)不同處理后，水葫蘆各部位中ClO4-、Cr6+含量和富集系數(shù)分別見表1 和表2?？傮w上看，隨著ClO4-處理濃度升高，其在水葫蘆各部位的含量顯著升高。不論是單一還是復合污染處理，在同一ClO4-處理濃度中，水葫蘆體內(nèi)的ClO4-含量大致相同。但在高濃度ClO4-(200 mg·L-1)和Cr6+復合處理時，水葫蘆莖和葉中ClO4-含量隨著Cr6+濃度的升高而顯著提高，在水葫蘆根中則無明顯差異。在單一ClO4-和復合污染處理中，水葫蘆各部位的ClO4-含量依次為葉＞莖＞根，葉片的富集系數(shù)最大，根部的富集系數(shù)最小，說明水葫蘆葉是富集ClO4-的主要部位。

表1 不同處理下水葫蘆各部位的ClO4-、Cr6+含量1)Table 1 The contents of ClO4- and Cr6+ in various parts of Eichhornia crassipes under different treatments

表2 不同處理下水葫蘆各部位的ClO4-、Cr6+富集系數(shù)(BCF)1)Table 2 The bio-concentration factor (BCF) of ClO4- and Cr6+ in various parts of Eichhornia crassipes under different treatments

水葫蘆對Cr6+具有一定的吸收作用。在所有處理組中，隨著Cr6+處理濃度升高，水葫蘆各部位累積的Cr6+含量也明顯提高。在同一Cr6+處理濃度中，不論是單一還是復合污染處理，水葫蘆根內(nèi)的Cr6+含量相差不大。高濃度ClO4-(200 mg·L-1)和高濃度Cr6+(0.2 mg·L-1)復合處理時，水葫蘆根、莖和葉內(nèi)的Cr6+含量比單一Cr6+處理時高。在單一Cr6+和復合污染處理中，水葫蘆各部位的Cr6+含量基本上表現(xiàn)為根＞莖＞葉，葉片的富集系數(shù)最小，根部的富集系數(shù)最大，說明水葫蘆根部積累Cr6+的能力最強。

從表2 可以看出，水葫蘆對重金屬Cr6+的富集系數(shù)均比ClO4-的富集系數(shù)大，說明水葫蘆對重金屬Cr6+的富集能力比對ClO4-的富集能力強。在所有Cr6+處理中，水葫蘆對低濃度處理Cr6+(0.02 mg·L-1)富集能力最強，其富集系數(shù)比高濃度處理Cr6+(0.20 mg·L-1)大。在ClO4-單一和復合污染中，水葫蘆各部位對ClO4-的富集系數(shù)均較小，富集系數(shù)最大的處理組是P20+Cr0.2 中的水葫蘆葉，富集系數(shù)僅為22.60 L·kg-1。

2.2 ClO4-和Cr6+單一或復合污染對人工水生生態(tài)系統(tǒng)中隆線溞的影響

研究結(jié)果(圖1)顯示：各個處理中，隆線溞種群增長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與“S”型增長模式基本符合，最大密度出現(xiàn)在第14 天，且此時總體上表現(xiàn)出低濃度促進、高濃度抑制的現(xiàn)象。

圖1 ClO4-、Cr6+及兩者復合污染對隆線溞生長的影響Fig.1 Effects of ClO4-,Cr6+ and their combined pollution on the growth of Daphnia carinata

由表3 可知，第14 天時 20 mg·L-1的ClO4-對隆線溞的生長沒有明顯的影響，但是200 mg·L-1的ClO4-對隆線溞的生長有顯著的抑制作用；0.02 mg·L-1的Cr6+處理明顯促進了隆線溞的生長，該組隆線溞的種群密度在各處理組中最大；當Cr6+質(zhì)量濃度為0.20 mg·L-1時，隆線溞的密度明顯低于CK 組，抑制作用明顯。除P200+Cr0.2 處理組的交互作用類型拮抗作用外，其余3 組復合污染處理均表現(xiàn)為協(xié)同作用。從表4 可以看出，隆線溞體內(nèi)的ClO4-含量總體上較低。ClO4-單一脅迫時，隆線溞體內(nèi)的ClO4-含量隨ClO4-處理濃度的升高而明顯升高。當高質(zhì)量濃度ClO4-(200 mg·L-1)與重金屬Cr6+復合處理時，其在隆線溞體內(nèi)的含量明顯低于200 mg·L-1ClO4-單一脅迫時體內(nèi)的含量；而低質(zhì)量濃度ClO4-(20 mg·L-1)與重金屬Cr6+復合時，其在隆線溞體內(nèi)的含量與20 mg·L-1ClO4-單一脅迫時體內(nèi)的含量相差不大。

表3 第14 天不同處理對隆線溞生長的影響及ClO4-、Cr6+的交互作用類型Table 3 Effects of different treatments on the growth of Daphnia carinata on the 14th day and the interaction types of ClO4- and Cr6+

表4 不同處理下隆線溞體內(nèi)ClO4-的含量以及富集系數(shù)(BCF)1)Table 4 The content and bio-concentration factor (BCF)of ClO4- in Daphnia carinata under different treatments

2.3 ClO4-和Cr6+單一或復合污染對人工水生生態(tài)系統(tǒng)中福壽螺的影響

研究結(jié)果表明，ClO4-、Cr6+單一污染及其復合污染對福壽螺的生長都有顯著的影響(圖2)。由圖2 可知，ClO4-單一脅迫時，福壽螺的高度和體質(zhì)量增長量都隨著ClO4-的濃度升高而顯著減少，福壽螺的體質(zhì)量增長受到的抑制更明顯。在200 mg·L-1的ClO4-作用下，螺高和體質(zhì)量的增長量明顯少于其他處理組，當福壽螺受到200 mg·L-1的ClO4-和0.02、0.20 mg·L-1的Cr6+共同作用時，其受到的抑制作用有所緩解，但螺高和體質(zhì)量增長量仍少于CK。重金屬Cr6+單一脅迫時，低濃度(0.02 mg·L-1)的Cr6+對螺高和螺體質(zhì)量增長量沒有顯著影響，0.20 mg·L-1的Cr6+則對螺高和螺體質(zhì)量增長量均產(chǎn)生了顯著的抑制作用。低濃度(20 mg·L-1ClO4-+ 0.02 mg·L-1Cr6+)復合時表現(xiàn)為協(xié)同作用，其他復合處理則表現(xiàn)為拮抗作用(表5)。

圖2 不同處理對福壽螺生長的影響Fig.2 Effects of different treatments on the growth of Pomacea canaliculata

表5 ClO4-和Cr6+復合污染對福壽螺生長的交互作用類型Table 5 Interaction types of ClO4- and Cr6+ combined pollution on the growth of Pomacea canaliculata

如表6 所示，ClO4-主要在福壽螺螺殼積累，螺肉則未檢出。螺殼的ClO4-含量隨著ClO4-處理濃度的升高而明顯升高，與重金屬Cr6+復合污染后，螺殼的ClO4-含量也呈現(xiàn)出同樣的趨勢。在所有處理組中，螺殼和螺肉的Cr6+含量隨著處理濃度的增加而顯著增加。整體上看，螺肉中的Cr6+含量比螺殼中的含量高，螺肉的Cr6+富集系數(shù)也高于螺殼，說明福壽螺富集重金屬Cr6+的主要部位是螺肉。

表6 不同處理下福壽螺各部位的ClO4-、Cr6+含量及對應富集系數(shù)(BCFs)1)Table 6 Contents and relative bio-concentration factors (BCFs) of ClO4- and Cr6+ in different parts of Pomacea canaliculata under different treatments

3 討論與結(jié)論

鑒于ClO4-水溶性強、易遷移的理化性質(zhì)，植物的根、莖部較難持留ClO4-，葉肉細胞則較易將ClO4-持留在葉片中[22-23]。He 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，ClO4-在植物地上部的積累量遠超過地下部，葉片是植物積累ClO4-的主要組織。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果相吻合，ClO4-在水葫蘆葉片的積累量遠遠高于根、莖部，說明水葫蘆對ClO4-的轉(zhuǎn)移運輸能力較強。不同植物種類對ClO4-的吸收能力不同[23]，研究發(fā)現(xiàn)，在同一處理條件下，菠菜Spinacia oleracea的ClO4-累積量可達700 μg·kg-1，而甘蔗Saccharum officinarum的積累量不到1 0 0 μg·kg-1[25]。ClO4-在植物葉片大量累積，可能會引起植物葉片的一系列損傷。陳倩等[26]用不同濃度的KClO4溶液脅迫水稻幼苗，發(fā)現(xiàn)水稻幼苗的相對葉綠素含量以及凈光合速率都受到了不同程度的抑制。Vijaya 等[27]發(fā)現(xiàn)，輪葉黑藻Hydrillaverticillata在29 mg·L-1的ClO4-脅迫下，葉綠素含量顯著降低，并出現(xiàn)了腐爛的現(xiàn)象。ClO4-對動物的傷害更大，低濃度的ClO4-能干擾動物甲狀腺的功能[5]。在ClO4-污染的河流中采樣發(fā)現(xiàn)，魚體中的甲狀腺濾泡細胞出現(xiàn)增生現(xiàn)象[28]。有研究表明，西方爪蛙Siluranatropicalis長期暴露于環(huán)境相關濃度的KClO4后，雌蛙的體質(zhì)量、后肢長度等都顯著減少[29]。譚敏卿等[30]將受精1 h 的斑馬魚Danio rerio胚胎暴露在不同濃度的NaClO4溶液里，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著溶液濃度增加，斑馬魚胚胎的孵化率降低、死亡率上升。Park 等[31]發(fā)現(xiàn)1 mg·L-1的NaClO4溶液能夠在一定程度上促進食蚊魚Gambusia affinis生長，而10 和100 mg·L-1的NaClO4溶液則明顯抑制食蚊魚的生長，呈現(xiàn)出“低促高抑”的趨勢，本研究也呈現(xiàn)出類似趨勢。本試驗結(jié)果顯示，20 mg·L-1的ClO4-與對照組相比，隆線溞的密度沒有明顯變化，而200 mg·L-1的ClO4-處理組的隆線溞密度只有對照組的83%，顯著低于對照組。Zhou 等[18]發(fā)現(xiàn)ClO4-的質(zhì)量濃度增加到100 mg·L-1時，隆線溞的死亡率與對照組相比沒有顯著差異，說明隆線溞對ClO4-的耐受性較強。

重金屬鉻不僅能抑制藻類合成葉綠素，對藻類產(chǎn)生毒害[32]，還對水生動物產(chǎn)生一定的毒害作用。李玲等[33]分別用1、2、3 和4 mg·L-1的Cr(NO3)3脅迫水葫蘆，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水葫蘆根的鉻含量分別是葉片含量的4.54、5.43、7.68 和6.21 倍。本研究用0.20 mg·L-1的Cr6+脅迫水葫蘆，水葫蘆根中的Cr6+含量分別是莖和葉的4.0 和9.5 倍，與前人結(jié)果相一致。與ClO4-相比，水葫蘆對Cr6+的轉(zhuǎn)移運輸能力較弱。在0.20 mg·L-1的Cr6+脅迫下，隆線溞的密度顯著降低，這與Zhou 等[18]的研究結(jié)果相一致，說明隆線溞對Cr6+的耐受能力較弱。因此，隆線溞可作為水體Cr6+污染的指示生物。姜東生等[12]發(fā)現(xiàn)，搖蚊(Chironomidae)幼蟲對Cr6+的耐受能力較強，在1 500 mg·L-1的Cr6+脅迫48 h 后，搖蚊幼蟲的死亡率只有15%。Cr6+在生物體內(nèi)積累會產(chǎn)生有害自由基，引起一系列的氧化損傷[34-35]。

復合污染與單一污染相比，污染物之間存在著復雜的交互作用[6]。任新等[36]發(fā)現(xiàn)，四溴二苯醚與ClO4-復合后，斑馬魚肝臟的超氧化歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量明顯比單一暴露組高，說明兩者復合對斑馬魚肝臟造成的氧化損傷更大。Mukhi 等[37]發(fā)現(xiàn)單獨使用ClO4-脅迫斑馬魚時，斑馬魚生長沒有受到明顯的影響，但用ClO4-和甲狀腺素T4 復合時，斑馬魚的死亡率顯著升高。張茹等[19]發(fā)現(xiàn)，低濃度的ClO4-與Pb 復合后，對泰國空心菜Ipomoeaaquatica幼苗根長的抑制作用顯著高于兩者單獨處理。本研究使用高濃度的ClO4-與Cr6+復合，試驗結(jié)果以拮抗作用為主，低濃度復合處理主要呈現(xiàn)出協(xié)同效應，這與楊杰峰等[21]的研究結(jié)果一致。

總的來說，在人工水生生態(tài)系統(tǒng)中，水葫蘆內(nèi)ClO4-、Cr6+的含量比隆線溞和福壽螺體內(nèi)的含量高。在所有處理中，水葫蘆對這2 種污染物的富集系數(shù)高于隆線溞和福壽螺，說明水葫蘆對ClO4-、Cr6+污染的富集能力比隆線溞和福壽螺強。隆線溞體內(nèi)的污染物濃度最低，富集系數(shù)也最小，說明隆線溞對污染物的富集能力在人工水生生態(tài)系統(tǒng)中最弱。本研究選用的2 種污染物都具有強氧化性，且水溶性強，容易被水生生物吸收，進入生物體內(nèi)后，它們會與生物體內(nèi)的成分發(fā)生反應，產(chǎn)生有害的自由基[38]，對生物造成不同程度的氧化損傷。因此，當兩者在復雜的水生環(huán)境中同時存在時，它們?nèi)绾螌λ锂a(chǎn)生危害以及兩者間具體的交互作用機理值得深入研究。

綜上所述，本研究得出結(jié)論如下：

1) ClO4-、Cr6+及其復合污染對水生生態(tài)系統(tǒng)中的生物具有不同的毒性效應，對系統(tǒng)中隆線溞生長的影響總體呈現(xiàn)低濃度促進、高濃度抑制的規(guī)律；隨著ClO4-、Cr6+及其復合濃度升高，福壽螺的生長受到的抑制作用越來越明顯。

2)水葫蘆對ClO4-和Cr6+有較強的富集能力，其富集ClO4-的主要器官是葉片，富集Cr6+的主要器官是根部。隆線溞和福壽螺對ClO4-也有一定的吸收，但吸收能力弱于水葫蘆。

3) ClO4-與Cr6+低濃度復合時，對隆線溞生長的交互作用類型以協(xié)同作用為主，高濃度復合時則主要表現(xiàn)為拮抗作用；20 mg·L-1ClO4-+ 0.02 mg·L-1Cr6+復合時對福壽螺生長表現(xiàn)為協(xié)同作用，其他復合處理則表現(xiàn)為拮抗作用。