賈思思，曾瑞珍，張志勝，魏 倩，謝 利，郭和蓉

(廣東省植物分子育種重點實驗室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院,廣東 廣州 510642)

蘭花是蘭科Orchidaceae 植物的總稱，但在中國，蘭花是指蘭科蘭屬Cymbidium植物，特別是其中的地生種類，也就是今天的國蘭[1]。蘭科是開花植物中最大的科之一，已鑒定的蘭科植物有899 屬29 199 種，約占開花植物的8%～10%，除極地和極端干旱的沙漠外，世界各地均有蘭花分布[2-3]。蘭花具有很高的觀賞價值、藥用價值、食用價值、生態(tài)價值和文化價值，是世界著名的觀賞花卉，也是中國傳統(tǒng)十大名花之一[3]。作為觀賞花卉，蘭花既可以做切花、也可以做盆花，既可以觀花、也可以賞葉，同時也是園林造景優(yōu)良植材，深受世界各國人民的喜愛。作為進(jìn)化程度最高、種類最豐富的植物，蘭花也是當(dāng)今生物學(xué)領(lǐng)域研究生命和進(jìn)化的理想模式植物。新品種選育是蘭花產(chǎn)業(yè)自主和高質(zhì)量發(fā)展的基礎(chǔ)，而育種方法是快速高效選育蘭花優(yōu)良品種的關(guān)鍵。目前，蘭花育種的主要方法有引種馴化、選擇育種、雜交育種、誘變育種和多倍體育種等[4-5]。這些育種方法雖然有效，但可利用資源范圍窄、育種周期長，不能定向培育市場所需品種。分子育種是采用轉(zhuǎn)基因或基因編輯技術(shù)創(chuàng)造變異、或通過分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)培育新品種的方法，主要包括轉(zhuǎn)基因育種、基因編輯育種和分子標(biāo)記輔助選擇育種。近年來，隨著蘭花組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，蘭花主要育種目標(biāo)性狀的分子遺傳基礎(chǔ)、基因鑒定和克隆、高密度分子圖譜構(gòu)建等取得巨大進(jìn)步，蘭花轉(zhuǎn)基因技術(shù)和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)也取得明顯進(jìn)展，本文對此進(jìn)行綜述并對未來蘭花分子育種技術(shù)研究的重點和品種創(chuàng)新進(jìn)行了展望，為進(jìn)一步推動蘭花分子育種技術(shù)研究和新品種選育提供參考。

1 蘭花基因組測序和功能基因鑒定

1.1 基因組測序

自2015年Cai 等[6]完成小蘭嶼蝴蝶蘭Phalaenopsisequestris基因組測序以來，迄今有來自4 亞科8 屬18 種共27 份蘭花完成了基因組測序，包括附生、地生和腐生3 類(表1)[6-31]。其中，廣東舌唇蘭Platantheraguangdongensis基因組最大(4.27 Gb)[20]，深圳擬蘭Apostasiashenzhenica基因組最小(348.73 Mb)[30]，天麻Gastrodiaelata預(yù)測基因數(shù)最少(17 895 個)[25]，染色體數(shù)最少的香莢蘭Vanillafragrans預(yù)測基因數(shù)最多(59 128 個)[29]?；诨蚪M測序結(jié)果，對蘭花葉藝、花型、花色、花期、適應(yīng)性等性狀的分子遺傳基礎(chǔ)分析結(jié)果表明，CH1基因家族顯著縮減可能是導(dǎo)致墨蘭Cymbidiumsinense葉藝形成的重要原因[7]；光合天線和代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)水平降低引起建蘭C.ensifolium葉藝的形成，葉片中與花發(fā)育相關(guān)的MADS-box基因表達(dá)水平顯著提高導(dǎo)致花被狀葉的形成[8]。

表1 蘭花基因組測序Table 1 Genome sequencing of orchid

MADS-box基因影響花發(fā)育和形態(tài)。通過測序分析，在多枝擬蘭A.ramifera、深圳擬蘭、天麻、紫金舌唇蘭Platantherajaponica、廣東舌唇蘭、香莢蘭、小蘭嶼蝴蝶蘭、臺灣蝴蝶蘭P.aphrodite、鼓槌石斛Dendrobiumchrysotoxum、鐵皮石斛D.catenatum、春蘭C.goeringii、建蘭和墨蘭中分別鑒定出30、36、40、43、43、55、51、56、58、63、69、71 和94 個MADS-box基因[2,7,9,19]，且多數(shù)蘭花中沒有FLC、AGL12和AGL15基因。在小蘭嶼蝴蝶蘭中有20 個基因優(yōu)先在花組織中表達(dá)，MIKC等5 個基因只在花中表達(dá)，C/D 類和B 類基因AP3、AGL6基因家族的擴(kuò)張和分化可能是蘭花高度特化花型形成的原因[6]。CsSEP4基因正調(diào)控墨蘭合蕊柱發(fā)育[7]。C 類基因CeAG-1和CeAG-2在建蘭花瓣中的高表達(dá)形成鼻狀花瓣，在花芽中低表達(dá)時，則花中沒有鼻，取而代之的是幾輪花被片，形成具有多花被片分枝花序的花；CeSEP-2基因表達(dá)上調(diào)對蘭花形成特化的唇瓣十分重要，下調(diào)則形成菊瓣花；唇瓣結(jié)構(gòu)由CeAP3-1、CeAP3-2、CeAP3-3、CeAP3-4和CeAGL6-2基因控制，CeAP3-3、CeAP3-4和CeAGL6-2在萼片和花瓣中高表達(dá)則分別形成唇瓣狀萼片和花瓣突變體[8]。

萜類化合物在蘭花香氣和抗逆性中起關(guān)鍵作用。在深圳擬蘭、小蘭嶼蝴蝶蘭、鼓槌石斛、金釵石斛D.nobile和墨蘭中鑒定出TPS基因數(shù)分別為14、21、48、51 和59 個[6,7,14,17,30]。墨蘭的花香與TPS基因家族擴(kuò)張有關(guān)，與無香的墨蘭相比，有香的墨蘭TPS家族基因表達(dá)量更高[7]。單萜和倍半萜主要在花發(fā)育晚期和開花期形成，與其生物合成的相關(guān)基因GDPS、FDPS和LIS高表達(dá)有關(guān)，F(xiàn)DPS和GDPS主要在萼片、花瓣和唇瓣中表達(dá)，說明萜類化合物主要在花被中合成[8]。

花色是蘭花主要育種目標(biāo)性狀。通過基因組測序和表達(dá)分析，在墨蘭中鑒定出56 個花青素合成代謝相關(guān)基因和125 個MYBs，花青素合成代謝相關(guān)基因在綠色、黃色、粉色和紫黑色花中差異表達(dá)，其中，4 個F3′H基因在紅色和紫色花中高表達(dá)。調(diào)控花青素合成途徑上游的MYBs一般在開紫黑色花的墨蘭中表達(dá)上調(diào)，而調(diào)控下游的平行基因表達(dá)譜存在顯著差異，此外，MYBs通過調(diào)控F3′5′H的表達(dá)影響墨蘭的花色[7]。在白色和粉色臺灣蝴蝶蘭中，F(xiàn)3H的表達(dá)模式明顯不同，R2R3-MYB在不同顏色蝴蝶蘭中表達(dá)模式也不同[19]。

次生代謝物是藥用蘭花的主要育種目標(biāo)性狀。測序分析結(jié)果表明，鐵皮石斛中SPS和SuSy基因擴(kuò)張與石斛多糖形成有關(guān)[12]；甲基赤蘚糖醇磷酸途徑中DXS、LUT1、LUT2、LCY1、LUT5等相關(guān)基因的丟失，導(dǎo)致天麻中葉黃素、胡蘿卜素和脫落酸等物質(zhì)的缺乏[23]；OMT基因在秋水仙素生物合成中起重要作用[24]。

其他性狀研究結(jié)果表明，墨蘭CsSVP基因與其互作蛋白CsAP1 和CsSOC1 共同調(diào)控低溫誘導(dǎo)開花[7]。附生蘭耐熱性與SDD1、PPP7和3MAT基因家族擴(kuò)張有關(guān)[12]。鼓槌石斛花期短是由于在開花至凋謝過程中類胡蘿卜素含量逐漸增加、葉黃素含量逐漸減少，導(dǎo)致ABA 含量減少、乙烯含量增加所致[14]。

1.2 功能基因鑒定

功能基因鑒定是蘭花分子育種的基礎(chǔ)。迄今采用轉(zhuǎn)基因、RNAi 和VIGS 等技術(shù)已從蘭屬、石斛屬、蝴蝶蘭屬和文心蘭屬Oncidium蘭花中鑒定出功能基因91 個[32-103]。其中，通過將基因轉(zhuǎn)入蘭花中并驗證功能的有24 個，占比24.7%。已鑒定出功能的基因包括植株生長發(fā)育、葉色、花發(fā)育、花色、開花時間、多糖合成、抗病、抗逆和組培快繁特性等基因(表2)，其中，花色、花發(fā)育、花期、抗逆和多糖合成的基因數(shù)分別為20、19、15、13 和 5 個，占比分別為22.0%、20.9%、16.5%、14.3%和5.5%。

2 轉(zhuǎn)基因和基因編輯

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是蘭花分子育種核心技術(shù)之一。自Kuehnlehe 等[104]利用基因槍法將PRVCP基因轉(zhuǎn)入石斛蘭原球莖以來，蘭花轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究取得巨大進(jìn)展(表3)。迄今已建立蝴蝶蘭、石斛蘭、文心蘭、大花蕙蘭C.hybrida、春蘭、墨蘭、寒蘭C.kanran、萬代蘭Vanda和小扇葉蘭Erycina pusilla等蘭花轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系，主要轉(zhuǎn)基因方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法，涉及的性狀包括花型、花色、花期、花壽命、次生代謝物、抗病、抗逆和組培快繁特性等[85-131]。通過過表達(dá)外源基因或自身基因、基因沉默、RNAi 和激活標(biāo)簽系統(tǒng)等手段已獲得花色變深的蝴蝶蘭‘TS444’[33]和‘V3’[94]，花期提前的石斛蘭[102]，抗除草劑小扇葉蘭[89]，多糖和甘露糖含量高、抗逆性強(qiáng)的鐵皮石斛[96]，PLB 形成能力增強(qiáng)的蝴蝶蘭[97]，頂端分生組織形成多芽和花期提前的石斛蘭[98]，花瓣中出現(xiàn)紅色斑點的南茜文心蘭OncidiumGower Ramsey[101]和寒蘭[103]，鮮切花壽命增加、花蕾脫落延遲的石斛蘭[119]，抗病毒的蝴蝶蘭[122,124]、石斛蘭[104,123]和抗低溫的蝴蝶蘭[131]等轉(zhuǎn)基因蘭花。

基因編輯技術(shù)是一種有效定向育種技術(shù)。Kui 等[90]以原球莖為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法建立了鐵皮石斛CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)體系，C3H、C4H、4CL、CCR和IRX基因編輯效率為10%～100%。Tong 等[95]以培養(yǎng)30 d 的原球莖為受體，對小蘭嶼蝴蝶蘭MADS基因進(jìn)行編輯，從20 個外植體中共獲得47 個突變體，其中，46 個突變體在3 個位點均發(fā)生突變，總突變率為97.90%。

3 分子標(biāo)記輔助選擇

高密度遺傳連鎖圖譜構(gòu)建對QTL 定位、基因克隆和分子標(biāo)記輔助選擇等具有重要作用。在石斛蘭、蝴蝶蘭和兜蘭Paphiopedilum等蘭花上已構(gòu)建出了高密度分子遺傳圖譜(表4)[19,132-139]。Lu 等[135]以細(xì)莖石斛D.moniliforme×鐵皮石斛雜交后代為作圖群體，構(gòu)建了含 8 573 個SLAF 標(biāo)記、19 個連鎖群的石斛蘭分子遺傳圖譜，標(biāo)記間平均距離為0.32 cM，鑒定出5 個與莖多糖含量相關(guān)的QTLs。Li 等[136]以100 個金釵石斛和大苞鞘石斛D.wardianumF1雜交后代為作圖群體，構(gòu)建出含9 564個SNP 標(biāo)記、19 個連鎖群的石斛蘭分子遺傳圖譜，標(biāo)記間平均距離為 0.41 cM，鑒定出2 個與莖長和1 個與莖粗相關(guān)的QTLs。Hsu 等[138]通過測序基因分型(Genotyping-by-sequencing，GBS)鑒定出1 191個SNPs，基于1 191 個SNPs 和22 個SSRs 構(gòu)建出含19 個連鎖群的蝴蝶蘭高密度分子遺傳圖譜，通過基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study，GWAS)，鑒定出7 個與1 個花部顏色相關(guān)聯(lián)的SNPs。Li 等[139]以同色兜蘭Paph.concolor和帶葉兜蘭Paph.hirsutissimum的95 個雜種后代為作圖群體，構(gòu)建出具有13 個連鎖群、8 410 個SNP 標(biāo)記的遺傳圖譜，標(biāo)記間平均距離為0.19 cM，篩選出與葉長、葉寬、葉厚和葉數(shù)連鎖的SNP 標(biāo)記共12 個。

表4 蘭花分子遺傳圖譜構(gòu)建Table 4 Construction of genetic map in orchid by molecular marker

王健等[140]利用RAPD 分子標(biāo)記對16 種有香和無香春蘭進(jìn)行分析，篩選到引物BA0088，該引物在有香春蘭中擴(kuò)增出一條特異性370 bp 條帶，帶型清晰，重復(fù)性好。劉澤強(qiáng)[141]利用大花蕙蘭和墨蘭雜交后代F1群體篩選到2 個與蘭花香氣性狀緊密連鎖的ISSR 標(biāo)記b19 和b21，b19 對蘭花有香后代的預(yù)測準(zhǔn)確率為84%、b21 的預(yù)測準(zhǔn)確率為88%，雙標(biāo)記預(yù)測準(zhǔn)確率為98%。李曉紅[142]篩選到8 個與蘭花純黃綠色花連鎖的SSR 標(biāo)記，這些標(biāo)記輔助純黃綠色花選擇的準(zhǔn)確率為52%～100%。肖文芳等[143]以黃金豹蝴蝶蘭P.Frigdaas Oxford 和白天使蝴蝶蘭P.Join Angel 及其雜交后代為材料，篩選到2 個與蝴蝶蘭花底色關(guān)聯(lián)的SNP 標(biāo)記，Marker35886 和Marker70907 的2 個SNP 位點對花底色的鑒定準(zhǔn)確率分別為66.67%和73.33%，雙標(biāo)記鑒定準(zhǔn)確率達(dá)93.33%。

4 展望

蘭花種類繁多、用途廣泛、市場前景廣闊。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們個性化需求的增加，市場對蘭花新品種的需求逐漸提高，如何快速高效選育蘭花新品種，滿足市場需求已成為育種家急需解決的問題。分子育種能夠最大限度利用種質(zhì)資源，快速定向培育蘭花新品種，目前已成為蘭花育種方法研究的熱點[2,5]。隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子育種技術(shù)將成為影響蘭花新品種選育、決定產(chǎn)業(yè)競爭力和高質(zhì)量發(fā)展的關(guān)鍵核心技術(shù)。

21 世紀(jì)以來，蘭花分子育種技術(shù)研究取得了巨大進(jìn)步，但鮮見利用分子育種方法培育出蘭花新品種的報道，原因是蘭花轉(zhuǎn)基因、基因編輯和分子標(biāo)記輔助選擇等技術(shù)還處于技術(shù)研發(fā)階段，且目前的研究主要是從技術(shù)創(chuàng)新而非品種創(chuàng)新的角度進(jìn)行的。為了將分子育種技術(shù)更好地應(yīng)用于品種創(chuàng)新，今后應(yīng)加強(qiáng)以下幾個方面的研究工作。

1)加強(qiáng)優(yōu)良商業(yè)化品種轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究，建立穩(wěn)定高效蘭花轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。轉(zhuǎn)基因技術(shù)不僅是轉(zhuǎn)基因和基因編輯育種的技術(shù)基礎(chǔ)，也是挖掘蘭花主要育種目標(biāo)性狀基因的關(guān)鍵技術(shù)。目前蘭花轉(zhuǎn)基因技術(shù)只在蝴蝶蘭、石斛等少數(shù)蘭花的個別材料中取得成功，而且轉(zhuǎn)基因效率不高，今后應(yīng)研究其他主要商業(yè)化蘭花和優(yōu)良品種的高效轉(zhuǎn)基因技術(shù)，為選育具有商業(yè)化應(yīng)用前景的蘭花新品種奠定基礎(chǔ)。

2)加強(qiáng)遺傳圖譜構(gòu)建和標(biāo)記輔助選擇技術(shù)研究，構(gòu)建以SSR、Indel 等分子標(biāo)記為主的高密度分子遺傳圖譜，建立分子標(biāo)記輔助主要育種目標(biāo)性狀選擇技術(shù)體系。雖然目前已構(gòu)建出幾種蘭花高密度分子遺傳圖譜，但這些圖譜主要是SNP 標(biāo)記圖譜，育種應(yīng)用價值不高，已建立分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的只有花香和黃綠色花等少數(shù)性狀，今后應(yīng)加強(qiáng)篩選與育種早期無法選擇或選擇難度大、成本高和準(zhǔn)確率低的性狀緊密連鎖分子標(biāo)記，建立其輔助目標(biāo)性狀選擇技術(shù)，實現(xiàn)育種早期高效定向選擇的目的，以進(jìn)一步提高育種效率和效益。

3)加強(qiáng)控制主要育種目標(biāo)性狀的主效基因挖掘。不管是轉(zhuǎn)基因還是基因編輯育種，獲得功能基因是前提，目前雖然鑒定出許多育種目標(biāo)性狀基因，但這些基因都是通過反向遺傳學(xué)方法獲得的，多數(shù)基因的功能未經(jīng)驗證，其效應(yīng)和遺傳規(guī)律不清楚，今后應(yīng)加強(qiáng)采用正向遺傳學(xué)方法或結(jié)合傳統(tǒng)遺傳學(xué)研究結(jié)果挖掘關(guān)鍵基因。

4)加強(qiáng)蘭花基因編輯技術(shù)研究。利用CRISPR/Cas9 編輯蘭花基因效率高[90,95]，顯示出其在蘭花育種上的巨大應(yīng)用潛力。因此，大力加強(qiáng)蘭屬蘭花、卡特蘭、文心蘭等蘭花基因編輯技術(shù)研究、建立基因編輯技術(shù)體系，對進(jìn)一步推動蘭花育種和產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展具有重要意義。