杜學(xué)勛，史晶晶，張斯穎

（1.上海老港固廢綜合開(kāi)發(fā)有限公司，上海 200237；2.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院，上海 201210）

0 引言

餐廚垃圾是居民在日常飯后所剩余的各類殘?jiān)目偡Q，也是城市生活垃圾的重要組成部分［1］。隨著生活水平的提升，餐廚垃圾的產(chǎn)生量逐年上漲［2］，預(yù)計(jì)到2025 年我國(guó)餐廚垃圾產(chǎn)生量將超過(guò)1.7×108t［3］。餐廚垃圾具有高含水量、高有機(jī)物含量的特點(diǎn)，如果不及時(shí)處理，極易腐爛變質(zhì)、產(chǎn)生惡臭氣味并滋生細(xì)菌和蚊蟲(chóng)，不僅會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，還會(huì)危害人類健康［4］。但同時(shí)餐廚垃圾也具有高有機(jī)質(zhì)的能源屬性，能夠產(chǎn)生生物質(zhì)能源［5］。因此近年來(lái)，如何高效處理餐廚垃圾，將餐廚垃圾的資源與環(huán)境屬性相統(tǒng)一，在2060 年基本完成低碳能源轉(zhuǎn)型目標(biāo)成為研究的重點(diǎn)。

厭氧消化技術(shù)是目前處理餐廚垃圾的主流技術(shù)，主要由厭氧微生物經(jīng)過(guò)水解、酸化、乙酸化、產(chǎn)甲烷這4 個(gè)階段降解有機(jī)物，將其轉(zhuǎn)化為清潔能源，實(shí)現(xiàn)廢棄物再利用，是一種高效可行的技術(shù)［6］。然而餐廚垃圾的厭氧消化過(guò)程容易受到抑制，這是由于餐廚垃圾低C/N、高油高鹽的特性導(dǎo)致微生物活性低，最終造成了厭氧消化效率低下甚至系統(tǒng)崩潰。而生物強(qiáng)化技術(shù)可以通過(guò)在厭氧消化系統(tǒng)中加入經(jīng)過(guò)篩選、優(yōu)化的優(yōu)勢(shì)功能菌種純培養(yǎng)物，提高有機(jī)物的生物轉(zhuǎn)化效率［7］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，加入具有一定功能的微生物能夠在很大程度上提高厭氧消化的效率。在馬纓丹（Lantana camara）厭氧消化體系中接種2 種纖維素降解菌Microbacteriumsp.DSB1、Arthobactersp.DSB12進(jìn)行生物強(qiáng)化，甲烷產(chǎn)量分別提高了57%和60%［8］。有研究利用在生物炭上生長(zhǎng)的嗜熱甲烷單胞菌（Methanosarcina thermophile）對(duì)餐廚垃圾進(jìn)行生物強(qiáng)化，甲烷產(chǎn)率最高增加了37%［9］。另外有研究發(fā)現(xiàn)將富集得到的耐丁酸微生物菌群（屬水平主要包括Sporanaerobacter、Proteiniphilum、Syntrophomonas）加入到以餐廚垃圾為原料的酸化發(fā)酵罐中進(jìn)行生物強(qiáng)化后，酸化系統(tǒng)得到明顯恢復(fù)，產(chǎn)甲烷量（以VS 計(jì)）提高了52.2 mL/g［10］。因此添加功能微生物是提高厭氧消化效率切實(shí)可行的方式。

此前，實(shí)驗(yàn)室從餐廚垃圾的高溫厭氧消化反應(yīng)器中分離出1 株水原脲芽孢桿菌（Ureibacillus suwonensisE11），目前Ureibacillus suwonensis僅被報(bào)道在棉花廢棄物堆肥的堆體中分離得到，其功能還未被研究［11］，也沒(méi)有將其應(yīng)用在厭氧消化過(guò)程中。因此有必要探究從高溫厭氧消化系統(tǒng)中分離得到的E11 對(duì)餐廚垃圾高溫厭氧消化系統(tǒng)的生物強(qiáng)化作用。前期已經(jīng)通過(guò)甲烷潛力測(cè)定實(shí)驗(yàn)證實(shí)E11 的添加可以有效提高餐廚垃圾的高溫厭氧消化系統(tǒng)的甲烷產(chǎn)量，然而功能微生物的添加量是影響生物強(qiáng)化效果及成本的重要因素，故本研究考察功能微生物E11 對(duì)餐廚垃圾高溫厭氧消化生物強(qiáng)化效果的影響，確定最佳劑量，并揭示生物強(qiáng)化的微生物機(jī)理，為生物強(qiáng)化提高餐廚垃圾的高溫厭氧消化性能提供理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 底物與接種物

底物餐廚垃圾取自某單位食堂，主要包括餐后剩余的飯菜、廢棄的菜葉、果皮和生肉等。所有原料經(jīng)粉碎后于4 ℃儲(chǔ)存。原始發(fā)酵污泥取自上海某濕垃圾處置單位穩(wěn)定運(yùn)行的餐廚垃圾中溫（37 ℃）濕式厭氧發(fā)酵罐。采用一步式啟動(dòng)法馴化高溫接種物，將厭氧連續(xù)攪拌反應(yīng)器（CSTR）的運(yùn)行溫度設(shè)定至55 ℃，每天投加餐廚垃圾，其OLR（以VS 計(jì)）為1 g/（L·d），富集嗜熱厭氧微生物。接種物取自實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定運(yùn)行3 個(gè)月以上的CSTR。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，對(duì)接種物進(jìn)行饑餓處理，完全消耗接種物中的有機(jī)物直至不產(chǎn)氣。底物和接種物的基本特征如表1 所示。

1.2 微生物培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)生物強(qiáng)化使用的微生物取自實(shí)驗(yàn)室前期從餐廚垃圾高溫厭氧消化反應(yīng)器中分離出的土著微生物E11，鑒定為Ureibacillus suwonensis。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前，將保菌管內(nèi)的菌體稀釋涂布至固體培養(yǎng)基上活化，放置55 ℃厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。隨后將單菌落接至試管中培養(yǎng)24 h 作為一級(jí)種子培養(yǎng)液，再按3% 的比例接至125 mL 的液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)24 h 得到菌液。

固體培養(yǎng)基：葡萄糖5 g/L，蛋白胨3 g/L，牛肉粉2 g/L，酵母粉3 g/L，NaCl 4 g/L，（NH4）2SO43 g/L，KH2PO40.75 g/L，K2HPO40.75 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g/L，半胱氨酸0.25 g/L，瓊脂粉15 g/L，自然pH。

液體培養(yǎng)基：葡萄糖5 g/L，蛋白胨3 g/L，牛肉粉2 g/L，酵母粉3 g/L，NaCl 4 g/L，（NH4）2SO43 g/L，KH2PO40.75 g/L，K2HPO40.75 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g/L，半胱氨酸0.25 g/L，自然pH。

1.3 菌懸液制備方法

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組添加菌液的體積為CSTR 工作體積的5%、10%、15%和20%。為了排除菌液中培養(yǎng)基對(duì)厭氧消化的影響，本實(shí)驗(yàn)將不同體積的菌液在冷凍離心機(jī)中以6 000 r/min、15 min 的條件離心得到菌體沉淀，將不同體積菌液離心得到的沉淀分別重懸至100 mL 的無(wú)菌水中，得到不同濃度的菌懸液備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

在工作容積為5 L 的CSTR 中進(jìn)行高溫厭氧消化的甲烷潛力測(cè)定實(shí)驗(yàn)。所有反應(yīng)器均在55 ℃下穩(wěn)定運(yùn)行，以60 r/min 的速度攪拌。厭氧消化的接種物和底物比例（ISR），基于VS，設(shè)定為2.0。為研究不同添加量條件下餐廚垃圾厭氧消化的產(chǎn)甲烷性能，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置1 個(gè)對(duì)照組（CK）和4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組（R1、R2、R3、R4），實(shí)驗(yàn)組對(duì)應(yīng)的加菌濃度分別為5%、10%、15%、20%。CK 組加入100 mL 無(wú)菌水，實(shí)驗(yàn)組加入100 mL 菌懸液。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，用氮?dú)鉀_洗頂空15 min 以確保厭氧條件。在厭氧發(fā)酵過(guò)程中，每天記錄發(fā)酵系統(tǒng)的甲烷產(chǎn)量、甲烷含量、pH。定期采集發(fā)酵液樣品用來(lái)檢測(cè)氨氮和VFAs。所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 組平行樣。

1.5 分析方法

根據(jù)產(chǎn)氣情況分別使用規(guī)格為10、5、1 L 的沼氣采樣袋（E-switch，上海）收集沼氣，并通過(guò)沼氣流量計(jì)（VIPPEN HR03，碧臣儀器，中國(guó)）測(cè)量甲烷體積。所有甲烷產(chǎn)量數(shù)據(jù)都轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)溫度（273 K）和1 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓（101 325 Pa）下的體積。pH 通過(guò)pH 計(jì)（賽多利斯PB-10，德國(guó)）測(cè)定。氣體成分（甲烷、二氧化碳）含量采用日本島津氣相色譜儀GC-2010 Plus 測(cè)定，熱導(dǎo)池檢測(cè)器（TCD）；色譜柱為T(mén)DX-01（2 m×2 mm）填充柱，載氣為高純氬氣，流量40 mL/min；柱溫120 ℃，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度150 ℃，電流20 mA，進(jìn)樣量1 mL。揮發(fā)性脂肪酸（Volatile Fatty Acid，VFA）采用日本島津氣相色譜儀GC-2010 Plus 測(cè)定，氫火焰離子化檢測(cè)器（FID），色譜柱為Rtxwax（30 m×0.25 mm×0.25μm）彈性石英毛細(xì)管柱，載氣為高純氮?dú)猓粰z測(cè)器溫度為230 ℃；進(jìn)樣器溫度為220 ℃；程序升溫80 ℃（保持2 min），升溫速率20 ℃/min，最終溫度200 ℃（保持8 min）；進(jìn)樣量為0.3 μL。利用Nessler 試劑分光光度法分析總氨氮（Total Ammonia Nitrogen，TAN）。根據(jù)式（1） 計(jì)算游離氨氮（Free Ammonia Nitrogen，F(xiàn)AN）。

式中：T為溫度，℃。

1.6 宏基因組測(cè)序分析方法

使用100 mL 的無(wú)菌注射器從反應(yīng)器中收集后續(xù)用于基因組DNA 提取的樣品，置于4 ℃，6 000 r/min、15 min 離心后分離沉淀和上清液，沉淀用液氮速凍后存放于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)宏基因組分析。

全基因組DNA 提取利用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit（Omega Bio-tek，美國(guó)）試劑盒進(jìn)行樣品DNA抽提。之前的研究中詳細(xì)報(bào)道了雙端文庫(kù)構(gòu)建、宏基因組測(cè)序生成、拼接組裝和非冗余基因集構(gòu)建的方法［12］。使用Diamond 軟件（Version 0.8.35）將非冗余基因集的氨基酸序列與NR 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)（BLASTP 比對(duì)參數(shù)設(shè)置期望值e-value 為1×e-5），并通過(guò)NR 庫(kù)對(duì)應(yīng)的分類學(xué)信息數(shù)據(jù)庫(kù)獲得物種注釋，然后使用物種對(duì)應(yīng)的基因豐度總和計(jì)算該物種的豐度。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能微生物添加量對(duì)高溫厭氧消化產(chǎn)甲烷性能的影響

通過(guò)添加不同比例的功能微生物對(duì)餐廚垃圾的高溫厭氧消化進(jìn)行生物強(qiáng)化，探究最佳的功能微生物添加量。產(chǎn)甲烷量是評(píng)價(jià)厭氧消化性能最重要的指標(biāo)，不同處理組下餐廚垃圾厭氧消化的產(chǎn)氣性能如圖1 所示。接種后，R3 組的日產(chǎn)甲烷量在第1 天就達(dá)到峰值，其他處理組日產(chǎn)甲烷量均在第2 天達(dá)到最大值，隨后呈整體波動(dòng)下降的趨勢(shì)（圖1）。各組累積產(chǎn)氣量持續(xù)上升，在第17天達(dá)到最大值，隨后保持穩(wěn)定。由圖1 中可以看出，生物強(qiáng)化組的累積產(chǎn)甲烷量均高于CK 組。之前有研究指出，嗜熱尿芽孢桿菌（Ureibacillus thermophilus）能夠產(chǎn)生降解復(fù)雜有機(jī)物的裂解酶，進(jìn)而有效地降解污泥［13-15］。根據(jù)推測(cè)，經(jīng)E11 生物強(qiáng)化后的厭氧消化甲烷產(chǎn)量較高，這可能是因?yàn)镋11 的添加能夠產(chǎn)生降解有機(jī)物的活性酶，或者通過(guò)微生物之間的相互作用使其他功能微生物富集，最終表現(xiàn)在有機(jī)物水解更加徹底、甲烷產(chǎn)量更高。在生物強(qiáng)化組中累積產(chǎn)甲烷量隨著E11 添加量的增加而增加，R4 組的產(chǎn)甲烷量最高，在第18 天的累積產(chǎn)氣量（以VS 計(jì)）達(dá)到576.03 mL/g，相比于CK 組（452.86 mL/g）提高27.20%。當(dāng)菌種添加量為15%時(shí)（R3），累積產(chǎn)甲烷量（以VS 計(jì)）略低于 R4， 為 575.14 mL/g， 相 比 CK 組 提 高 了27.00%。雖然R4 中E11 的添加量更高但是累計(jì)產(chǎn)甲烷量和R3 組幾乎相同，這一現(xiàn)象與張新杰等［16］的研究結(jié)果相似，推測(cè)可能是由于功能微生物與本土菌株之間的競(jìng)爭(zhēng)以及營(yíng)養(yǎng)缺乏所致。結(jié)合產(chǎn)甲烷量的結(jié)果和經(jīng)濟(jì)性考慮，利用E11 進(jìn)行生物強(qiáng)化的最佳添加劑量為15%。

2.2 功能微生物添加量對(duì)高溫厭氧消化甲烷含量的影響

在厭氧消化的過(guò)程中甲烷含量是反映甲烷菌活性和消化性能的重要指標(biāo)。在本實(shí)驗(yàn)中，不同功能微生物添加量對(duì)甲烷含量的影響如圖2 所示。在初始階段，各組甲烷含量先下降，隨后增加，并在第5 天達(dá)到最高。在系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行的情況下，各組的甲烷含量差異不大，波動(dòng)范圍為50%～70%。相比于文獻(xiàn)中報(bào)道的甲烷含量［17-19］，本實(shí)驗(yàn)的甲烷含量均處于較高水平，可能是由于本實(shí)驗(yàn)的運(yùn)行條件是55 ℃，在高溫條件下水解產(chǎn)酸階段進(jìn)程更快、效率更高，使產(chǎn)甲烷菌有更多可利用的底物，從而提高甲烷濃度。各組的甲烷含量差異隨著消化進(jìn)程逐漸增大，CK 組整體的甲烷含量水平低于添加E11 的實(shí)驗(yàn)組，甲烷含量最大值出現(xiàn)在R3 中，達(dá)到73.53%。說(shuō)明E11 的添加可有效提高甲烷產(chǎn)率，其中添加量為15% 時(shí)甲烷產(chǎn)生的效果最佳。

圖2 功能微生物添加量對(duì)甲烷含量的影響Figure 2 Effect of bioaugmentation dosage on methane content

2.3 功能微生物添加量對(duì)高溫厭氧消化pH 和乙酸濃度的影響

對(duì)于厭氧消化系統(tǒng)中的產(chǎn)甲烷菌來(lái)說(shuō)，合適的pH 是非常重要的，pH 過(guò)高或過(guò)低都會(huì)直接影響微生物的活性，降低底物的轉(zhuǎn)化效率，導(dǎo)致厭氧消化失敗［12，20］。而VFAs 是厭氧消化過(guò)程中一種非常重要的中間產(chǎn)物，其中乙酸占比最高。乙酸是可以被產(chǎn)甲烷菌直接利用的一種物質(zhì)，乙酸濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致pH 的迅速降低，從而降低厭氧消化效率，但是濃度過(guò)低又會(huì)造成產(chǎn)甲烷菌可以利用的底物不足，導(dǎo)致產(chǎn)甲烷效率低。因此，pH和乙酸濃度是反映厭氧消化系統(tǒng)穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。

厭氧消化期間pH 變化如圖3 所示，pH 在所有組之間的變化趨勢(shì)相似，每組的pH 均在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第1 天迅速下降，隨著消化過(guò)程的進(jìn)行pH 持續(xù)升高，第6 天后逐漸穩(wěn)定，最終穩(wěn)定在8.5 左右，這與He 等［21］的研究中由于VFAs 的轉(zhuǎn)化和氨的積累，導(dǎo)致高溫消化系統(tǒng)中的高pH 現(xiàn)象一致。第1 天pH 的迅速降低可能是由于底物的快速水解，產(chǎn)生大量的乙酸，產(chǎn)甲烷菌未將其及時(shí)轉(zhuǎn)化。這一現(xiàn)象在Zhang 等［22］的文章中得到證實(shí)。乙酸在消化過(guò)程中經(jīng)過(guò)產(chǎn)甲烷菌的代謝生成甲烷和其他產(chǎn)物，導(dǎo)致系統(tǒng)中的pH 升高。

圖3 功能微生物添加量對(duì)高溫厭氧消化系統(tǒng)中pH 和乙酸濃度的影響Figure 3 Effects of bioaugmentation dosage on pH and acetic acid concentration in thermophilic anaerobic digestion system

在厭氧消化過(guò)程中僅有乙酸和極少量丙酸被檢出，由圖3 中可以觀察到乙酸濃度在不同組中的變化規(guī)律。所有組的乙酸濃度變化趨勢(shì)相似，均在第1 天達(dá)到了最大值，隨著消化的進(jìn)行乙酸被快速代謝，濃度迅速下降，從第6 天開(kāi)始趨于穩(wěn)定。R1、R2、R3 組第1 天的乙酸濃度都比CK組高，但最后穩(wěn)定階段CK 組的乙酸濃度最高，并且R3 組的乙酸濃度在第9 天降為0，說(shuō)明R3 組中的乙酸被完全利用，這可能是R3 組累積產(chǎn)甲烷量較高的原因之一。在其他生物強(qiáng)化組中甲烷產(chǎn)量的高低和穩(wěn)定階段的乙酸濃度成反比，說(shuō)明添加E11 的生物強(qiáng)化措施可以有效促進(jìn)乙酸被產(chǎn)甲烷菌利用，提高沼氣產(chǎn)量。

綜上，生物強(qiáng)化可以在一定程度上提高乙酸的利用率。當(dāng)E11 的添加量為15% 時(shí)，乙酸被利用得最徹底。

2.4 功能微生物添加量對(duì)高溫厭氧消化TAN 和FAN 濃度的影響

在餐廚垃圾的厭氧消化過(guò)程中，由于有機(jī)氮化合物的轉(zhuǎn)化，氨氮含量和pH 會(huì)逐漸增加，當(dāng)TAN 超過(guò)閾值濃度時(shí)會(huì)產(chǎn)生抑制作用。TAN 是FAN 和NH4+測(cè)量值的總和，從現(xiàn)有研究來(lái)看，F(xiàn)AN 似乎是導(dǎo)致氨氮抑制更為重要的因素，F(xiàn)AN可能直接抑制特定酶的活性或通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入微生物細(xì)胞，改變細(xì)胞外基質(zhì)，隨后改變鈉鉀平衡。在本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)對(duì)TAN 和FAN 濃度的監(jiān)測(cè)來(lái)評(píng)判高溫厭氧消化體系的穩(wěn)定性。不同生物強(qiáng)化劑量下厭氧消化系統(tǒng)TAN 和FAN 濃度的變化如圖4 所示。圖4 顯示了每組TAN 濃度的變化，5 個(gè)反應(yīng)器的TAN 濃度范圍為880～3 660 mg/L。有文獻(xiàn)報(bào)道稱當(dāng)TAN 濃度高于8 000 mg/L 時(shí)，通常會(huì)發(fā)生完全氨抑制［23］，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系中的TAN濃度推測(cè)該反應(yīng)體系相對(duì)較為穩(wěn)定，并沒(méi)有明顯的氨抑制現(xiàn)象發(fā)生。CK、R1、R2 組的TAN 濃度均在第1 天達(dá)到最低值，R3 組和R4 組在第2 天達(dá)到最低，隨后各組TAN 濃度開(kāi)始增加，從第6天開(kāi)始基本穩(wěn)定。此外，由圖4 可看出，各組FAN 濃度波動(dòng)范圍為71～645 mg/L，所有組的FAN濃度變化趨勢(shì)與TAN 的變化趨勢(shì)基本一致。有研究指出高溫厭氧消化系統(tǒng)中FAN 的濃度會(huì)高于中溫厭氧消化，一般波動(dòng)范圍為400～800 mg/L［24］，本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的FAN 濃度均處于正常范圍，消化系統(tǒng)可以穩(wěn)定運(yùn)行。

圖4 功能微生物添加量對(duì)TAN 和FAN 的影響Figure 4 Effects of bioaugmentation dosage on TAN and FAN

2.5 生物強(qiáng)化對(duì)高溫厭氧消化微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

根據(jù)累積甲烷產(chǎn)量的數(shù)據(jù)并考慮經(jīng)濟(jì)性，E11 的最佳添加量為15%。為探究生物強(qiáng)化高溫厭氧消化產(chǎn)沼氣的微生物作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)選擇CK 組和R3 組消化達(dá)到穩(wěn)定時(shí)（第7 天）的樣品進(jìn)行宏基因組測(cè)序，將得到的序列與NR 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，其微生物群落差異分析如圖5～圖7所示。

圖5 功能微生物添加量對(duì)門(mén)水平微生物群落的影響Figure 5 Effects of bioaugmentation dosage on microorganism at phylum level

CK 組和R3 組在門(mén)水平上的微生物結(jié)構(gòu)的差異如圖5 所示，添加E11 后雖然E11 所在的厚壁菌門(mén)（Firmicutes）的相對(duì)豐度并沒(méi)有增加，但是反應(yīng)器中的熱袍菌門(mén)（Thermotogae）、廣古菌門(mén)（Euryarchaeota）和增效菌門(mén)（Synergistetes）微生物的相對(duì)豐度明顯增加。熱袍菌門(mén)在之前的研究中被報(bào)道是嗜熱厭氧消化中的優(yōu)勢(shì)門(mén)，可以在高溫下穩(wěn)定存活并且降解糖產(chǎn)生CO2和乙酸，為產(chǎn)甲烷菌提供可以利用的底物。熱袍菌門(mén)微生物的增加說(shuō)明在添加E11 后糖類物質(zhì)的降解更加徹底，從而提高甲烷的產(chǎn)率。廣古菌門(mén)是厭氧消化系統(tǒng)中非常重要的一類微生物，包含能夠產(chǎn)生甲烷的產(chǎn)甲烷菌，這可能是添加E11 后甲烷產(chǎn)率高的原因之一。在厭氧消化過(guò)程中蛋白質(zhì)被水解為肽和氨基酸，這些肽和氨基酸隨后被發(fā)酵為VFAs，最后被混合微生物種群發(fā)酵為甲烷和CO2，增效菌門(mén)已經(jīng)被證明可以降解氨基酸［25］，屬于該門(mén)的微生物很可能在消化系統(tǒng)中的產(chǎn)酸階段發(fā)揮重要作用。添加E11 后增效菌門(mén)相對(duì)豐度的提升說(shuō)明厭氧系統(tǒng)的水解效率在一定程度上可能被提高，這與生物強(qiáng)化組的乙酸濃度較高的現(xiàn)象基本一致。VFAs在乙酸生成過(guò)程中的氧化通常發(fā)生在與產(chǎn)甲烷菌的協(xié)同共生關(guān)系中，產(chǎn)乙酸菌通常將醇類和VFAs分解成乙酸鹽、甲酸鹽、H2和CO2，這些物質(zhì)隨后被產(chǎn)甲烷菌利用［26］。因此，這類細(xì)菌的豐度增加可以提高甲烷產(chǎn)量。

從屬水平（圖6～圖7）上看，Defluviitoga的相對(duì)豐度在R3 組中顯著提高（p＜0.05），Defluviitoga是厭氧消化過(guò)程中相對(duì)豐度最高的水解細(xì)菌，可以產(chǎn)生不同的碳水化合物活性酶，并利用多糖（如纖維素、幾丁質(zhì)和木聚糖）產(chǎn)生乙酸、H2和CO2，隨后被產(chǎn)甲烷古菌利用產(chǎn)生甲烷［27］。Defluviitoga豐度的提升可以有效促進(jìn)厭氧消化過(guò)程中底物的水解。Hydrogenispora同樣是一種在厭氧消化系統(tǒng)中豐度較高的水解菌，這類微生物可將葡萄糖、麥芽糖和果糖等碳水化合物發(fā)酵成乙酸、乙醇和H2。這2 類關(guān)鍵水解菌豐度的提高表明生物強(qiáng)化系統(tǒng)中微生物對(duì)底物的水解能力加強(qiáng)，底物可以更加充分地被利用。醋微菌屬Acetomicrobium是一類嚴(yán)格厭氧的耐高溫細(xì)菌，可以將底物中的糖轉(zhuǎn)化為乙酸鹽、乙醇、CO2和H2，該菌屬的增加有助于厭氧消化過(guò)程中有機(jī)質(zhì)的分解和沼氣的產(chǎn)生［28］。Syntrophaceticus是一類共養(yǎng)型乙酸氧化菌，可以將乙酸鹽氧化為CO2和H2，該菌屬是以互養(yǎng)乙酸鹽氧化為主要產(chǎn)甲烷途徑的產(chǎn)甲烷過(guò)程中的關(guān)鍵微生物，其相對(duì)豐度的增加對(duì)厭氧消化有促進(jìn)作用。脲芽孢桿菌屬Ureibacillus在R3 組中也顯著增加，可以認(rèn)為E11 添加后可以有效在消化體系內(nèi)定殖。Methanoculleus的相對(duì)豐度在R3 組中也被發(fā)現(xiàn)明顯升高（p＜0.05），這是一類嗜氫產(chǎn)甲烷菌，其含有以H2和CO2為底物的產(chǎn)甲烷途徑的編碼基因，可以高效利用H2和CO2生成甲烷［29］。在產(chǎn)甲烷代謝途徑中，氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷途徑能效更高，嗜氫產(chǎn)甲烷菌Methanoculleus豐度的增加可以有效提高甲烷的生成效率。并且Methanoculleus具有很強(qiáng)的耐氨性，其中銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和甲基銨通透酶的缺失可解釋對(duì)富含銨或氨的環(huán)境的適應(yīng)性特征［29］。之前的研究表明當(dāng)TAN 的濃度維持在1 000 mg/L 以上時(shí)，這類產(chǎn)甲烷菌會(huì)成為優(yōu)勢(shì)微生物，本實(shí)驗(yàn)的TAN 處于1 000 mg/L 以上，所以這類產(chǎn)甲烷菌在本實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)器中豐度較高［30-31］?？傊?，生物強(qiáng)化使Methanoculleus相對(duì)豐度的提升可能是高溫厭氧消化產(chǎn)甲烷效率提高的原因之一。

圖6 功能微生物添加量對(duì)屬水平微生物群落的影響Figure 6 Effects of bioaugmentation dosage on microorganism at genus level

3 結(jié)論

利用Ureibacillus suwonensisE11 對(duì)餐廚垃圾高溫厭氧消化系統(tǒng)進(jìn)行生物強(qiáng)化可以有效促進(jìn)甲烷產(chǎn)生，其中15% 的添加劑量最佳，累積甲烷產(chǎn)量（以VS 計(jì)） 達(dá)到575.14 mL/g，相比 于CK 組（452.86 mL/g）提高了27.00%。功能微生物添加量為15% 時(shí)不僅有效提高了乙酸濃度，為產(chǎn)甲烷菌提供可利用的底物，還提高了產(chǎn)甲烷菌對(duì)乙酸的利用效率，使乙酸最終被完全利用。微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律表明E11 可以在厭氧消化系統(tǒng)內(nèi)定殖，并且該菌株的添加不僅可以提高重要水解細(xì)菌的相對(duì)豐度，促進(jìn)消化系統(tǒng)中的水解步驟，還提高了嗜氫產(chǎn)甲烷菌Methanoculleus的相對(duì)豐度，從而提高甲烷產(chǎn)率。