顏子文，謝毅鵬，王車禮

1.常州大學(xué)藥學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常州 213164；

2.常州大學(xué)石油化工學(xué)院，江蘇 常州 213164

蛋白類酶是具有催化功能的生物大分子，與化學(xué)催化劑相比其具有諸多優(yōu)點，如在常溫常壓下具有極高的活性及專一性。但蛋白質(zhì)易受環(huán)境影響而變性失活[1-3]，其在工業(yè)上未能得到廣泛應(yīng)用。為了克服游離酶在應(yīng)用上的諸多限制（如穩(wěn)定性低、易受抑制及回收困難等），固定化酶技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生[4-6]。傳統(tǒng)酶固定化的方法有交聯(lián)法、共價鍵法、吸附法和包埋法。近年來新型的復(fù)合物固定化技術(shù)受到了越來越多的關(guān)注，Ge 等[7]在2012 年首次提出采用有機(jī)-無機(jī)復(fù)合物對酶進(jìn)行固定化，采用這種固定化方法，酶的穩(wěn)定性、操作簡易性和重復(fù)利用性有了很大的提高。Cui 等[8]用磷酸銅共沉淀牛胰腺脂肪酶，然后加入表面活性劑活化牛胰腺脂肪酶，其活性相比于未經(jīng)活化的牛胰腺脂肪酶提高了460%。

金屬有機(jī)骨架（MOF）具有超高的比表面積和穩(wěn)定性，因而在化學(xué)催化、氣體分離、藥物輸送等方面有極大的發(fā)展?jié)摿9]。MOF 是由金屬離子通過配位鍵連接有機(jī)配體組成，金屬離子和有機(jī)配體的連接可以形成眾多的幾何形狀，因此可以根據(jù)功能需要設(shè)計和定制MOF 的結(jié)構(gòu)[10]。沸石咪唑酸骨架（ZIF）是MOF 家族的一類，由于其出色的比表面積、熱穩(wěn)定性，以及合成條件溫和簡單、成本低等優(yōu)點而被廣泛研究[11-15]。ZIF 是由金屬離子和2-甲基咪唑通過自組裝形成的[16-18]。Liang 等[19]通過仿生礦化，將酶、蛋白質(zhì)和脫氧核糖核酸（DNA）等生物大分子包埋進(jìn)ZIF-8，由此提高了它們的穩(wěn)定性以及重復(fù)利用性。Campbell 等[20]提出用ZIF-8 固定化脲酶，固化后的脲酶具有更好的溫度耐受范圍和穩(wěn)定性。然而，合成條件對ZIF-8 固定化蛋白質(zhì)有較大的影響，本研究將以牛血清蛋白（BSA）為模板蛋白，著力探究不同合成條件對ZIF-8 固定BSA（BSA@ZIF-8）固化物性質(zhì)的影響，并采用掃描電鏡（SEM）、傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、X 射線衍射儀（XRD）、激光粒度儀、物理吸附儀和熱重分析等表征手段對制備出的復(fù)合物進(jìn)行表征。

1 實驗部分

1.1 ZIF-8 固定化BSA 的制備

按一定物質(zhì)的量比將乙酸鋅、2-甲基咪唑（HmIm）和H2O（Zn:HmIm:H2O）配置成混合溶液，于25 ℃下靜置24 h，此時燒杯底部有白色沉淀生成，在7 000 r/min 下離心10 min 后去除上清液，沉淀物用去離子水洗滌三次，用冷凍干燥機(jī)干燥得到ZIF-8-1，ZIF-8-2，ZIF-8-3，ZIF-8-4（Zn:HmIm:H2O分別為1:20:450，1:20:890，1:20:2 228，1:40:2 228）。

將1 mg/mL 的BSA 溶液（50 mmol/L，一定pH 值的Tris-HCl 為緩沖溶液）加入上述乙酸鋅和HmIm 混合溶液，在設(shè)定溫度下固化一定時間，離心洗滌凍干后得到BSA@ZIF-8 復(fù)合物樣品。計算其中BSA 的包埋率（α，摻入復(fù)合物中BSA 質(zhì)量占合成時加入BSA 總質(zhì)量的百分比）和負(fù)載率（β，復(fù)合物中包埋的BSA 占整個復(fù)合物質(zhì)量的百分比）。

1.2 樣品的表征

將冷凍干燥后的ZIF-8 以及BSA@ZIF-8 樣品噴金處理后在5.0 kV 電壓下進(jìn)行SEM（JSM-5900，德國蔡司）檢測，觀察它們的表面形態(tài)。采用NEXUSFTTR670 型紅外光譜儀（IS-50，美國賽默飛世爾）測定樣品的FT-IR，溴化鉀壓片法。XRD 檢測（MAX2500，日本島津公司）采用Cu-Kα輻射，波長（λ）為0.154 18 nm，外加電壓為40 kV，電流為30 mA，掃描2θ為7°～50°。使用馬爾文ZS-90納米粒度儀測定ZIF-8 及復(fù)合物粒徑分布。采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量：取待測蛋白溶液1.0 mL置于10 mL 的試管中，加入5.0 mL 考馬斯亮藍(lán)溶液并震蕩，反應(yīng)5 min 后在595 nm 的波長下進(jìn)行吸光度的測定。

2 結(jié)果和討論

2.1 X 射線衍射

樣品的XRD 表征結(jié)果見圖1。由圖1 可知，BSA@ZIF-8-4 的特征峰與ZIF-8-4 的特征峰非常相似，BSA@ZIF-8-4 復(fù)合物幾乎保留了ZIF-8-4 的所有特征峰，說明加入BSA 以后依然形成了ZIF-8晶體。

圖1 ZIF-8-4 以及BSA@ZIF-8-4 的XRD 圖譜Fig.1 XRD spectra of ZIF-8-4 and BSA@ZIF-8-4

2.2 傅里葉紅外光譜

圖2 所示為樣品的FT-IR 圖譜。由BSA 圖譜可見，1 649 cm-1處有一個吸收峰，其與酰胺I帶在1 640～1 660 cm-1處的特征峰相吻合（主要來自C=O 伸縮振動），1 557 cm-1處的吸收峰則對應(yīng)酰胺Ⅱ帶在1 510～1 560 cm-1處的特征峰（主要來自C—N 伸縮振動及N—H 彎曲振動）。在ZIF-8-4 的FT-IR圖譜上并未出現(xiàn)上述特征峰，而BSA@ZIF-8-4 復(fù)合物圖譜中則出現(xiàn)了與BSA 相同的特征峰，證明BSA 已成功包埋于復(fù)合物內(nèi)。

圖2 ZIF-8-4，BSA@ZIF-8-4 和BSA 的傅里葉紅外光譜Fig.2 FT-IR spectra of ZIF-8-4, BSA@ZIF-8-4 and BSA

ZIF-8-4 譜圖中420 cm-1處的吸收峰為ZIF-8 獨(dú)特的Zn—N 伸縮振動，692 cm-1及756 cm-1處的強(qiáng)烈吸收峰則屬于咪唑環(huán)平面外彎曲振動，952 cm-1及1 310 cm-1處的吸收峰則為咪唑環(huán)平面內(nèi)彎曲振動，1 450 cm-1處的強(qiáng)烈吸收峰為2-甲基咪唑甲基的彎曲振動。以上諸特征峰在BSA 的紅外圖譜中皆未體現(xiàn)，而在復(fù)合物譜圖中出現(xiàn)了相應(yīng)的特征峰，證明成功形成了ZIF-8 骨架。

2.3 熱重分析

樣品的熱重分析結(jié)果見圖3。由圖3 可知，對于ZIF-8-4，在溫度升至100 ℃后開始有質(zhì)量損失，此時15.57%的質(zhì)量損失為ZIF-8-4 晶體中所含的結(jié)合水，當(dāng)溫度升至 600 ℃后質(zhì)量迅速損失，此時ZIF-8-4 開始分解。說明低于600 ℃時ZIF-8-4 有良好的熱穩(wěn)定性。由BSA@ZIF-8-4 的熱重分析結(jié)果可知，樣品在加熱過程中也只有兩個失重臺階。溫度從100 ℃升至200 ℃的過程中，BSA@ZIF-8-4 復(fù)合物的質(zhì)量損失為28.67%，與ZIF-8-4 相比多出13.10%的質(zhì)量損失為包埋的BSA 及BSA 所帶結(jié)合水。測量得知BSA@ZIF-8-4 中BSA 負(fù)載率約為3%（見表1），因此剩余約25%的質(zhì)量損失均為結(jié)合水。當(dāng)溫度升至600 ℃后的質(zhì)量損失仍為ZIF-8 骨架的降解。

表1 不同配比BSA@ZIF-8 的BSA 包埋率和負(fù)載率Table 1 Embedding ratios and loading ratios of BAS in BSA@ZIF-8 with different material ratios

圖3 ZIF-8-4 和BSA@ZIF-8-4 熱重分析結(jié)果Fig.3 Thermogravimetric analysis results of ZIF-8-4 and BSA@ZIF-8-4

2.4 粒徑分析

Zn:HmIm:H2O 不同時制得的ZIF-8 和BSA@ZIF-8（恒定溫度為25 ℃，反應(yīng)時間為24 h，pH 值為7.4）的粒徑分布見圖4。由圖4 可以看出，當(dāng)ZIF-8 包埋入BSA 后，其顆粒粒徑普遍增大，復(fù)合物的粒徑普遍在100 nm 以上，但未超過1 000 nm，說明其晶體的生長存在一定的限制。

圖4 不同Zn:HmIm:H2O 時制備的ZIF-8 以及BSA@ZIF-8 的粒徑分布Fig.4 Particle size distributions of ZIF-8 and BSA@ZIF-8 synthesized for different Zn:HmIm:H2O

圖5 為不同條件（pH，反應(yīng)時間，溫度）下制備的BSA@ZIF-8-3 的粒徑分布。由圖5（a）可見，4℃下制備的復(fù)合物的粒徑分布更集中且平均粒徑比25 ℃下的稍大，這可能是由于低溫下晶體的生長速率較低、生長較均一；而40 ℃下晶體的生長速率較快但生長并不均一，導(dǎo)致其粒徑較為分散。由圖5（b）可知，合成時間為24 h 與72 h 時得到的復(fù)合物的粒徑分布幾乎一致，且均比合成時間為2h 時樣品的要大，這說明當(dāng)合成時間為2 h 時復(fù)合物晶體還在繼續(xù)生長，時間達(dá)24 h 時已停止生長。由圖5（c）可知，當(dāng)pH 為中性（pH=7.4）時得到的復(fù)合物粒徑稍小，這可能是因為酸性或堿性溶液中蛋白表面會帶較多的正、負(fù)電荷，有利于復(fù)合物的形成。

圖5 不同條件下制備的BSA@ZIF-8-3 的粒徑分布Fig.5 Particle size distributions of BSA@ZIF-8-3 synthesized under different conditions

2.5 掃描電鏡

不同配比的ZIF-8 以及對應(yīng)復(fù)合物的掃描電鏡照片見圖6。由圖6 可見，當(dāng)Zn:HmIm:H2O 為1:20:450 時，合成的ZIF-8-1 顆粒輪廓較為模糊，當(dāng)水的比例增大至2 228 時（ZIF-8-3），則呈現(xiàn)非常規(guī)則的正十二面菱形結(jié)構(gòu)，而在此基礎(chǔ)上再增加2-甲基咪唑的量（ZIF-8-4），則反而會導(dǎo)致結(jié)構(gòu)出現(xiàn)缺陷。對應(yīng)的BSA@ZIF-8 復(fù)合物（如圖6E～圖6H 所示）基本體現(xiàn)了相應(yīng)的ZIF-8 結(jié)構(gòu)但其表面十分粗糙，這可能是由于合成過程是以BSA 為內(nèi)核的外延生長，從而導(dǎo)致生長不均一，晶體表面粗糙。

圖6 不同配比的ZIF-8 以及對應(yīng)BSA@ZIF-8 的SEM 圖片F(xiàn)ig.6 SEM images of ZIF-8 with different material ratios and corresponding BSA@ZIF-8 BSA@ZIF-8: 25 ℃, 24 h, pH=7.4

2.6 復(fù)合物中BAS 的包埋率和負(fù)載率

不同配比ZIF-8 在固化溫度為25 ℃，固化時間為24 h，緩沖溶液pH 值為7.4 的條件下制得了BSA@ZIF-8 復(fù)合物，其中BAS 的包埋率和負(fù)載率見表1。由表1 可知，當(dāng)水的比例由450 增加至2 228時，BSA 的包埋率和負(fù)載率均有明顯增加，而將2-甲基咪唑比例增加后，包埋率和負(fù)載率均有下降，說明2-甲基咪唑濃度的增加不利于BSA 的包埋和負(fù)載。

在不同固化溫度、不同固化時間以及不同pH 緩沖溶液的條件下由ZIF-8-3 制備的BSA@ZIF-8-3中BSA 的包埋率和負(fù)載率見表2。如表2 所示，固定化溫度對BSA 包埋率和負(fù)載率的影響較大，40 ℃下合成樣品的BSA 負(fù)載率約為25 ℃下合成樣品的一半，而包埋率卻未有顯著降低，說明較高的溫度有利于ZIF-8 的生長，導(dǎo)致其晶體質(zhì)量較大，負(fù)載率較低，圖5（a）也印證了這一點。對比不同固化時間得到的樣品的BSA 包埋率和負(fù)載率發(fā)現(xiàn)，從2 h 到24 h 有顯著增加，而72 h 時有顯著下降，說明在2～24 h 的固定化過程中復(fù)合物有一定生長，而24 h 以后部分復(fù)合物可能發(fā)生重構(gòu)，一部分BSA重新溶解，從而導(dǎo)致其尺寸不變[見圖5（b）]的情況下BSA 包埋率與負(fù)載率均降低。中性條件（pH=7.4）下得到復(fù)合物樣品的BSA 包埋率和負(fù)載率明顯更大，與圖5（c）相結(jié)合分析可知，中性環(huán)境有利于BSA 的包埋，而酸性與堿性環(huán)境則有利于ZIF-8 晶體的生長。

表2 不同條件下得到的BSA@ZIF-8-3 的BSA 包埋率和負(fù)載率Table 2 Embedding ratios and loading ratios of BAS in BSA@ZIF-8-3 prepared under different conditions

3 結(jié) 論

本研究通過FT-IR、SEM、TGA 和激光粒度計對不同合成條件下制備的BSA@ZIF-8 復(fù)合物進(jìn)行了表征分析。發(fā)現(xiàn)原料配比中2-甲基咪唑的濃度越高，BSA@ZIF-8 復(fù)合物中的BSA 負(fù)載率和包埋率越低，較高的固定化溫度有利于ZIF-8 晶體的生成，從而導(dǎo)致較大的粒徑和較低的BSA 包埋率和負(fù)載率，固定化時間在2～24 h 仍有生長，BSA@ZIF-8 復(fù)合物粒度與其中的BSA 負(fù)載率和包埋率均有顯著增長，而24 h 以后一部分BSA 反而會重新溶解，中性固定化環(huán)境下有利于BSA 的包埋，而酸或堿性環(huán)境有利于ZIF-8 的生長。本工作對模板蛋白的研究結(jié)果可為其他酶的包埋研究提供一些參考。