劉國華 蔣永青 陳彤 黃婷 許芳

作者簡介：劉國華（1973－），男，大專，主要從事獸藥殘留檢測(cè)工作

*通信作者：陳彤（1992.9－ ），男，碩士，中級(jí)獸醫(yī)師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品及農(nóng)業(yè)投入品監(jiān)測(cè)；E-mail：348993329@qq.com

摘? 要：為快速檢測(cè)出豬肉等動(dòng)物源性食品中安眠酮的殘留，利用膠體金免疫層析技術(shù)制備安眠酮快速檢測(cè)試紙條。通過化學(xué)方法合成安眠酮半抗原和安眠酮抗原，利用免疫反應(yīng)制備安眠酮多克隆抗體，以安眠酮多克隆抗體和安眠酮包被抗原作為主要原料，制備安眠酮膠體金免疫快速檢測(cè)試紙條。結(jié)果表明，研制的試紙條對(duì)動(dòng)物組織樣本的檢測(cè)限為20 μg/kg，對(duì)尿樣的檢測(cè)限為30 μg/kg，檢測(cè)時(shí)間不超過5 min，與500 μg/kg的四環(huán)素類、喹諾酮類、磺胺類等藥物均無交叉反應(yīng)，特異性較好，假陽性率≤5％，假陰性率≤0.5％。該方法操作簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，適用于動(dòng)物源性食品中安眠酮?dú)埩舻默F(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和篩查。

關(guān)鍵詞：安眠酮；膠體金免疫層析技術(shù)；試紙條；快速檢測(cè)

中圖分類號(hào)：O657.63+TS254.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2023）06-0064-07

安眠酮（methaqualone，MTQ）又名甲苯喹啉酮，化學(xué)式為C16H14N2O，在臨床上常用作催眠藥、鎮(zhèn)定藥，主要用于動(dòng)物過度興奮或驚厥，可使其機(jī)體平靜，人若過量服用安眠酮?jiǎng)t會(huì)出現(xiàn)安眠酮中毒現(xiàn)象，表現(xiàn)為意識(shí)模糊不清、注意力不集中、惡心、頭暈、無力、煩躁不安甚至短時(shí)間內(nèi)精神失常等[1]。在醫(yī)學(xué)上，服用小劑量的安眠酮會(huì)使服用者進(jìn)入極端神經(jīng)質(zhì)和興奮狀態(tài)，長期服用則會(huì)產(chǎn)生依賴性或成癮性[2]。1978年以來隨著安眠酮使用量的逐漸增加，安眠酮成為濫用藥品之一。1971年《精神藥物公約》將安眠酮列入其中，并已有17個(gè)國家禁止使用和出口安眠酮，我國于1987年禁止了安眠酮的生產(chǎn)和流通。

同時(shí)，安眠酮還具有促進(jìn)畜禽生長、誘導(dǎo)畜禽入睡和提高產(chǎn)量的作用，隨著我國畜牧業(yè)的壯大，一些養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）因利益的驅(qū)動(dòng)，在飼喂畜禽時(shí)肆意補(bǔ)充，造成動(dòng)物源性食品的獸藥殘留量超標(biāo)，影響人類的身體健康[3-4]。2007年，中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第824號(hào)文件明確規(guī)定，國家管制的精神藥品，如安眠酮，在動(dòng)物源性食品中殘留為零。根據(jù)《食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》（中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號(hào)）文件規(guī)定，安眠酮為禁止使用的藥物，在動(dòng)物性食品中不得檢出。

目前，我國尚未規(guī)定安眠酮在動(dòng)物源性食品中的殘留限量和檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)，國際社會(huì)對(duì)安眠酮?dú)埩魴z測(cè)也尚未有相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。安眠酮的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）[5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[6]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[7]等。但在檢測(cè)過程中，這些方法存在樣本前處理復(fù)雜、所需儀器設(shè)備昂貴、操作繁瑣、效率較低、成本較高等缺陷，且無法快速檢測(cè)出動(dòng)物源性食品中安眠酮的殘留量。因此，亟須建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的安眠酮?dú)埩袅繖z測(cè)方法，對(duì)豬肉等動(dòng)物源性食品中安眠酮的殘留量進(jìn)行檢測(cè)和篩查，為我國畜禽產(chǎn)品中安眠酮?dú)埩袅繖z測(cè)方法的國家標(biāo)準(zhǔn)制定提供理論依據(jù)與技術(shù)支持。

1? 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)所用3只雄性新西蘭大白兔購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑

氯金酸、牛血清白蛋白均購自山東省青島市李滄區(qū)中恒展創(chuàng)生物技術(shù)中心公司，碳酸鉀購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，弗氏完全佐劑購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，二甲基甲酰胺、碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、檸檬酸三鈉復(fù)溶液均購自上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

BSA4202S電子天平購自賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，XYZ三維劃膜噴金儀、ZQ2000切條機(jī)由上海金標(biāo)生物科技有限公司生產(chǎn)，HD-9623A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，TWCL-T1000加熱磁力攪拌器由鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)，H2-16KR高速冷凍離心機(jī)購自湖南可成儀器設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 安眠酮半抗原的制備及鑒定

以鄰乙酰氨基苯甲酸和3-甲基-4-氨基苯甲酸甲酯為化學(xué)原料，通過一系列縮合反應(yīng)和水解反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，最終獲得安眠酮半抗原，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.2.2 安眠酮抗原的制備

10.0 mg安眠酮半抗原溶解于1 mL二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF）中作為反應(yīng)液Ⅰ；30 mg碳化二亞胺（carbo diimide，EDC）和20 mg N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）用0.5 mL DMF充分溶解后加入反應(yīng)液Ⅰ中，室溫下攪拌24 h，作為反應(yīng)液Ⅱ；60 mL牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）充分溶解在6.0 mL pH為8.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）中，將反應(yīng)液Ⅱ逐滴緩慢滴加到BSA溶液中，并于室溫下攪拌24 h，作為反應(yīng)液Ⅲ；用0.01 mol/L PBS在4 ℃時(shí)透析3 d，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，獲得包被抗原，于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 安眠酮多克隆抗體的制備及鑒定

用合成的抗原免疫試驗(yàn)動(dòng)物，制備多克隆抗體。選擇雄性新西蘭大白兔3只，體重2 kg左右，編號(hào)分別為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)，采用頸背部皮下多點(diǎn)注射法免疫。免疫程序如下：將相同體積的免疫抗原與弗氏完全佐劑混合進(jìn)行乳化，初次免疫劑量為0.5 mg/只。初次免疫后第21天和第42天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，劑量為0.4 mg/只，乳化方法相同。以后每隔21 d加強(qiáng)免疫一次，共免疫8次。從第3次加強(qiáng)免疫開始，每次免疫7 d后對(duì)動(dòng)物采血并進(jìn)行血清效價(jià)測(cè)定和特異性檢測(cè)，安眠酮陽性濃度設(shè)定為10 μg/kg和30 μg/kg。

1.2.4 膠體金的制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金。取500 mL超純水置于1 L圓底燒瓶中，放入3.0 cm轉(zhuǎn)子，上接冷凝管置于磁力加熱攪拌器上加熱煮沸，煮沸后繼續(xù)加熱3 min。準(zhǔn)確吸取2.4 mL 1％ AuCl3溶液加入圓底燒瓶中，繼續(xù)加熱至煮沸，煮沸持續(xù)5 min，再吸取? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?9.1 mL 1％檸檬酸三鈉溶液，迅速加入圓底燒瓶中，繼續(xù)煮沸，同時(shí)觀察瓶中的顏色變化；當(dāng)顏色呈穩(wěn)定的酒紅色后，繼續(xù)煮沸10 min，取出圓底燒瓶置于操作臺(tái)上，冷卻至室溫，補(bǔ)水至原體積，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 膠體金最適標(biāo)記pH

取4根無菌的1.5 mL試管，每管加入1 mL膠體金溶液，分別加入2、3、4、5 μL K2CO3（0.2 mol/L）調(diào)整各管溶液pH。反應(yīng)? 10 min后，每管加入10 μg/mL的安眠酮多克隆抗體，混勻靜置15 min后觀察膠體金顏色。每管加入100 μL BSA（10％）溶液混勻封閉1 h，4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，200 μL復(fù)溶液重懸，使用試紙條檢測(cè)，確定最適標(biāo)記pH。

1.2.6 膠體金最佳蛋白標(biāo)記量

取3個(gè)無菌的1.5 mL 試管，每管加入1 mL膠體金溶液，加入4 μL 0.2 mol/L K2CO3溶液混勻，再分別加入3.52、7.40和10.92 μg/mL的安眠酮多克隆抗體，混勻靜置20 min，向每管中加入100 μL BSA（10％）溶液，混勻后封閉1 h，4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，200 μL復(fù)溶液重懸，使用試紙條檢測(cè)，確定最佳蛋白標(biāo)記量。

1.2.7 膠體金標(biāo)記抗體制備

取100 mL膠體金溶液置于250 mL燒杯中，將燒杯放于磁力攪拌器上，放入轉(zhuǎn)子，向其中加入400 μL 0.2 mol/L K2CO3溶液，用保鮮膜封口，200 r/min攪拌10 min。用超純水稀釋抗體使其蛋白濃度為7.4 μg/mL，向調(diào)整好pH的膠體金溶液中逐滴加入稀釋好的抗體溶液，待溶液攪勻20～30 s后吸取膠體金溶液，加入到稀釋抗體的離心管中，洗凈管壁上殘留的抗原，吹吸3～5次，并將溶液加回至燒杯中。繼續(xù)攪拌30 min，向標(biāo)記好的膠體金溶液中加入10 mL BSA（10％）溶液，室溫?cái)嚢璺忾]30 min，4 ℃ 10 000 r/min離心30 min。結(jié)束后取出離心管收集下層濃縮的金標(biāo)抗體。根據(jù)量取的膠體金體積計(jì)算加入的復(fù)溶液體積，向收集的金標(biāo)抗體中加入復(fù)溶液，混勻，備用。

1.2.8 試紙條的組裝

使用噴膜儀在玻璃纖維上噴金標(biāo)抗體，噴量為8 μL/cm，38 ℃下干燥24 h，即得金標(biāo)墊；將偶聯(lián)抗原安眠酮-卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）用0.02 mol/L PBS緩沖液（pH為7.4）稀釋至0.8 mg/mL，用噴膜儀噴于硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜上，噴量為2 μL/cm，為檢測(cè)線（T線）；在檢測(cè)線上面5 mm處噴涂羊抗鼠IgG（0.8 mg/mL），噴量為2 μL/cm，為質(zhì)控線（C線），38 ℃下干燥24 h。干燥完成后依次將NC膜、金標(biāo)墊、樣本墊、吸水墊貼在聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）板上，組裝成半成品試紙。將組裝好的半成品試紙用切條機(jī)切割成4 mm寬的試紙條，分別裝入塑料卡殼中，用壓殼機(jī)將殼封閉，制備成成品檢測(cè)試紙條。

1.2.9 檢測(cè)時(shí)間分析

按照安眠酮膠體金免疫快速檢測(cè)試紙條操作流程，2人一組，共計(jì)5組，對(duì)陰陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，記錄樣本檢測(cè)時(shí)間。

1.2.10試紙條操作方法

將檢測(cè)卡平放，用微量移液器吸取待檢樣本100 μL加入檢測(cè)卡加樣孔中，靜置5～8 min后觀察結(jié)果并讀數(shù)，其他時(shí)間讀數(shù)無效。如果T線顯色強(qiáng)于C線或與C線顯色無明顯差異，說明樣本呈陰性，即樣本不含安眠酮或其濃度低于檢測(cè)限；如果T線顯色明顯弱于C線顯色，或者T線不顯色，說明樣本呈陽性，即樣本中安眠酮濃度等于或高于檢測(cè)限；如果C線不顯色，則無論T線顯色與否都說明此試紙條已經(jīng)失效（圖1）。

1.2.11 試紙條的性能評(píng)價(jià)

1.2.11.1 敏感性試驗(yàn) 將安眠酮標(biāo)準(zhǔn)品配成1 μg/kg濃度，再將5個(gè)陰性尿樣配制成不同濃度（0、10、20、30、40、50 μg/kg），分別用試紙條進(jìn)行檢測(cè)，觀察顯色結(jié)果。每個(gè)濃度重復(fù)3次，根據(jù)結(jié)果確定試紙條的敏感性。

1.2.11.2 特異性試驗(yàn) 將其他相關(guān)動(dòng)物常見獸藥殘留物質(zhì)包括四環(huán)素類、喹諾酮類、磺胺類等藥物，用0.02 mol/L PBS（pH 7.4）緩沖液配制成濃度為500 μg/kg的溶液，分別取100 μL用試紙條進(jìn)行檢測(cè)，觀察顯色結(jié)果。每個(gè)濃度的樣本重復(fù)檢測(cè)3次，根據(jù)結(jié)果確定試紙條的特異性。

1.2.11.3 準(zhǔn)確性試驗(yàn) 試紙條的準(zhǔn)確性通常以假陽性率和假陰性率表示，假陽性率應(yīng)小于5％，假陰性率應(yīng)為0。用試紙條檢測(cè)經(jīng)儀器確證的50份陰性樣本（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜30 μg/kg）和50份陽性樣本（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞30 μg/kg），計(jì)算假陽性率和假陰性率。

1.2.11.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次和不同批次的試紙條分別檢測(cè)已經(jīng)儀器確證的20份陰性樣本（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜30 μg/kg）和20份陽性樣本（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞30 μg/kg），每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定3次，確定試紙條的重復(fù)性。

1.2.11.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將制備好的試紙條密封后儲(chǔ)存于37 ℃，分別在第0、5、10、15、20、25、30天，抽取不同保存期限的試紙條，檢測(cè)已經(jīng)儀器確證的樣本，確定試紙條的穩(wěn)定性。

2? 結(jié)果

2.1 安眠酮半抗原的鑒定結(jié)果

對(duì)獲得的安眠酮半抗原進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，半抗原的理論相對(duì)分子質(zhì)量是365.3，質(zhì)譜的正離子模式（+1），測(cè)出的相對(duì)分子質(zhì)量是366.3（圖2），說明安眠酮半抗原合成成功。

2.2 安眠酮抗原的制備結(jié)果

本研究制備的安眠酮半抗原，其結(jié)構(gòu)上有活性基團(tuán)羧基，利用羧基和氨基成為酰胺鍵的原理，以此偶聯(lián)載體蛋白。偶聯(lián)結(jié)果采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，掃描結(jié)果顯示（圖3和圖4），BSA和卵清白蛋白的波峰均在278 nm，安眠酮在264 nm處有一個(gè)波峰，偶聯(lián)產(chǎn)物的波峰分別在303 nm和305 nm。偶聯(lián)產(chǎn)物紫外吸收峰發(fā)生偏移可能是半抗原交聯(lián)到載體蛋白上引起的，說明兩種完全抗原均偶聯(lián)成功。

2.3 安眠酮多克隆抗體的鑒定

兔血清ELISA測(cè)定結(jié)果見表1。由表1可知，制備的安眠酮多克隆抗體可以特異性識(shí)別安眠酮，說明多克隆抗體制備成功。

2.4 膠體金最適標(biāo)記pH結(jié)果

膠體金最適標(biāo)記pH結(jié)果見圖5。由圖5可知，含2 μL K2CO3的膠體金幾乎呈黑色，3 μL碳酸鉀的膠體金呈黑紫色，4 μL K2CO3的膠體金呈酒紅色，5 μL K2CO3的膠體金也呈酒紅色。說明安眠酮抗體標(biāo)記調(diào)節(jié)pH的K2CO3用量為4 μL。

2.5膠體金最佳蛋白標(biāo)記量結(jié)果

膠體金最佳蛋白標(biāo)記量結(jié)果見圖6。圖6表明，安眠酮抗體標(biāo)記最佳用量為7.4 μg/mL。

2.6 檢測(cè)時(shí)間分析結(jié)果

檢測(cè)時(shí)間分析結(jié)果見表2。表2表明，研制的試紙條檢測(cè)時(shí)間小于5 min。

2.7 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

不同濃度的樣本分別與試紙條反應(yīng)后，觀察試紙條顯色。由表3可知，試紙條能夠檢測(cè)出安眠酮的敏感性較高，為30 μg/kg。

2.8 特異性試驗(yàn)結(jié)果

試紙條的特異性檢測(cè)結(jié)果見表4。由表4可知，試紙條檢測(cè)500 μg/kg的四環(huán)素類、喹諾酮類、磺胺類等藥物，結(jié)果均為陰性，說明制備出的試紙條能夠特異性地與安眠酮結(jié)合，與其他小分子藥物沒有交叉反應(yīng)，特異性較好。

2.9 準(zhǔn)確性試驗(yàn)結(jié)果

用檢測(cè)卡分別檢測(cè)50份陰性樣本，檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，均為陰性，說明假陽性率＜5％；用檢測(cè)卡分別檢測(cè)50份陽性樣本，檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，均為陽性，說明試紙條假陰性率≤0.5％。

2.10 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

同一批次和不同批次的試紙條分別檢測(cè)每個(gè)樣本，并重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果顯示檢測(cè)結(jié)果相同，說明試紙條重復(fù)性良好。

2.11 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

試紙條的穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果見表5。由表5可知，檢測(cè)卡在儲(chǔ)存溫度37 ℃下，一個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定性指標(biāo)均符合要求，無假陽性或假陰性情況發(fā)生，說明試紙條穩(wěn)定性較好。

3? 結(jié)論

本研究成功制備出安眠酮半抗原，使之與牛血清白蛋白/卵清白蛋白偶聯(lián)，分別得到安眠酮免疫抗原和安眠酮包被抗原，以安眠酮多克隆抗體和安眠酮包被抗原作為主要原料，制備出安眠酮膠體金免疫快速檢測(cè)試紙條，并對(duì)其性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)，證明該試紙條敏感性較高、特異性較好、準(zhǔn)確性較高、重復(fù)性良好、穩(wěn)定性較好，且具有操作方便、快速的優(yōu)點(diǎn)。因此，本研究開發(fā)的安眠酮膠體金免疫快速檢測(cè)試紙條對(duì)動(dòng)物源性食品中安眠酮?dú)埩袅康默F(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和篩查具有較大的實(shí)際意義。

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