張樂(lè)怡,張曉芹,王慧玉,雷后興

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬麗水市中醫(yī)院藥劑科·浙江 麗水 323000)

小兒疳證是指由于喂養(yǎng)不當(dāng)或罹患他病導(dǎo)致小兒脾胃受損,運(yùn)化失健,氣液耗傷,肌膚筋骨經(jīng)脈臟腑失養(yǎng)而形成的一種慢性消耗性疾病,是兒科的四大病癥之一[1-3]。隨著國(guó)內(nèi)對(duì)民族醫(yī)藥的關(guān)注與深入研究,近年來(lái),畬醫(yī)藥在小兒疳證等多種疾病的治療中取得了良好的進(jìn)展[4-8]。消疳健胃方為畬族民間驗(yàn)方,經(jīng)畬醫(yī)的民間應(yīng)用和本院前期臨床應(yīng)用表明,該方具有消食化積、健脾和胃的功效,對(duì)小兒疳癥、食積、食欲改善等病癥具有較好的臨床治療效果[2]。消疳健胃方由食涼茶、陳皮、山楂、茯苓、麥芽、稻芽、雞內(nèi)金組成。其中食涼茶為畬族特有藥材,在民間畬族常用其治療傷食所致的痞滿證和慢性胃炎,在臨床上對(duì)于風(fēng)熱表證、脾虛食滯、胃脘痛、泄瀉、吞酸等病癥均具有較好的治療效果[9-11],為方中君藥。陳皮具有理氣健脾功效,常用于脘腹脹滿,為方中臣藥。研究表明,山柰酚-3-O-蕓香糖苷為君藥食涼茶的主要化學(xué)成分,具有抗氧化、抑制脂肪合成、減輕急性肝損傷等作用,常作為食涼茶質(zhì)量特征的表征成分[12-15];橙皮苷、川陳皮素為陳皮主要活性成分,具有興奮胃腸道、促進(jìn)胃排空、抑制腸上皮細(xì)胞炎性損傷、改善代謝紊亂、抗病毒等作用,常作為陳皮質(zhì)量特征的表征成分[16-20]。本文在文獻(xiàn)考證的基礎(chǔ)上,選擇君藥和臣藥的主要化學(xué)成分進(jìn)行制劑的整體質(zhì)量考察。

該方原劑型為湯劑,煎煮不當(dāng)容易影響后續(xù)藥效,且不易保存、攜帶不便。因此本研究參考消疳健胃湯的組方特點(diǎn)和臨床應(yīng)用形式,考察該方劑的水提取工藝,結(jié)合層次分析法進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn),優(yōu)選消疳健胃合劑最佳提取工藝,為該制劑的制備提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀,配置Empower 3 Personal Single System SW化學(xué)工作站：Waters公司,美國(guó);Smart2Pure Pro型超純水機(jī)：Thermo Electron LED GmbH公司,德國(guó);十萬(wàn)分之一電子分析天平：上海良平儀器儀表有限公司;TC-15系列恒溫電熱套：海寧市華星儀器廠。

1.2 試藥與試劑 橙皮苷(批號(hào)：110721-201818,純度96.2%)、山柰酚-3-O-蕓香糖苷(批號(hào)：112007-201602,純度90.8%)、川陳皮素(批號(hào)：112055-202001,純度99.6%)標(biāo)準(zhǔn)品均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。實(shí)驗(yàn)用的中藥飲片均來(lái)源于本單位中藥庫(kù),經(jīng)本單位中藥飲片驗(yàn)收小組驗(yàn)收,食涼茶符合2015年版《浙江省中藥炮制規(guī)范》,其余均符合《中國(guó)藥典》2020年版的相關(guān)規(guī)定;見表1。乙腈為色譜純,水為超純水,其他試劑為分析純。

表1 中藥飲片信息

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters XTERRA C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流速1.0 mL·min-1,進(jìn)樣量10 μL,柱溫：30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm;流動(dòng)相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B),梯度洗脫,(0～10 min,5%A→15%A;10～20 min,15%A→21%A;20～25 min,21%A→22%A;25～30 min,22A%→23%A;30～35 min,23%A→30%A;35～45 min,30%A→48%A;45～55 min,48%A→55%A;55～60 min,55%A→5%A);理論塔板數(shù)按山柰酚-3-O-蕓香糖苷計(jì)算不低于3500。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液制備 精密稱取橙皮苷7.50 mg置于20 mL容量瓶中,山柰酚-3-O-蕓香糖苷10.30 mg、川陳皮素10.80 mg,置于10 mL容量瓶中,甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,即分別得對(duì)照品母液。分別精密量取一定量的對(duì)照品母液至10 mL容量瓶中,制成含橙皮苷23.45 mg·L-1、山柰酚-3-O-蕓香糖苷51.44 mg·L-1、川陳皮素10.76 mg·L-1的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 精密量取消疳健胃合劑水煎液1 mL,用甲醇定容至10 mL,用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò),作為供試品溶液。

2.1.4 陰性對(duì)照品溶液制備 按處方中比例稱取各藥材,分別制備缺食涼茶陰性對(duì)照樣品,缺陳皮陰性對(duì)照樣品,缺食涼茶、陳皮陰性對(duì)照樣品,按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.1.5 專屬性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果表明,在供試品溶液色譜圖中,在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)保留時(shí)間處有相同色譜峰出現(xiàn),峰形良好,且陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見圖1。

圖1 專屬性檢查色譜圖(1.橙皮苷;2.山柰酚-3-O-蕓香糖苷;3.川陳皮素)

2.1.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液,在“2.1.1”色譜條件下,分別進(jìn)樣1,3,5,10,15,20 μL,以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),各組分含量為橫坐標(biāo)(X),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見表2,可知在線性范圍內(nèi),3個(gè)組分的峰面積與進(jìn)樣量線性關(guān)系良好。

表2 回歸方程及線性范圍

2.1.7 儀器精密度試驗(yàn) 精密量取10 μL混合對(duì)照品溶液,在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下,連續(xù)進(jìn)樣6 次,測(cè)得橙皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、川陳皮素的峰面積RSD分別為0.85%、0.95%、0.87%,表明儀器精密度良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批水煎液,按“2.1.3”項(xiàng)下方法,平行制備6份供試品溶液,在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定,測(cè)得橙皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、川陳皮素峰面積RSD分別為2.35%、2.57%、2.51%,表明此方法重復(fù)性良好。

2.1.9 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液,在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下,于0,3,6,9,12,18 h分別進(jìn)樣,測(cè)得橙皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、川陳皮素峰面積RSD分別為2.38%、2.00%、2.00%,表明在18 h內(nèi),該溶液穩(wěn)定。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知各組分含量的供試品溶液,共6 份,分別加入約等量成分的對(duì)照品溶液,按“2.1.3”項(xiàng)制備供試品溶液,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2 水提工藝試驗(yàn)

2.2.1 因素水平 查閱文獻(xiàn),選擇浸泡時(shí)間(A)、加水量(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D)作為影響因素[21-25],因素水平見表4。

表4 因素水平表

2.2.2 層次分析法確定權(quán)重[26-28]根據(jù)復(fù)方中食涼茶為君藥、陳皮為臣藥的君臣佐使配伍關(guān)系及活性成分藥理作用,選取橙皮苷(Y1)、山柰酚-3-O-蕓香糖苷(Y2)、川陳皮素(Y3)的含量(μg)和干膏得率(Y4)為權(quán)重指標(biāo)給予量化,根據(jù)1～9 級(jí)標(biāo)度法對(duì)4 項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行兩兩比較,按9 分位比率評(píng)判各評(píng)價(jià)指標(biāo)相對(duì)重要順序[24],確定各指標(biāo)的先行順序?yàn)椋荷借头?3-O-蕓香糖苷>橙皮苷=川陳皮素>干膏率,指標(biāo)判斷優(yōu)先矩陣見表5。根據(jù)和積法計(jì)算得各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)分別為0.2272,0.4231,0.2272,0.1225,隨機(jī)一致性比率CR=0.004<0.1,表明指標(biāo)成對(duì)比較的判斷矩陣滿足一致性檢驗(yàn),權(quán)重系數(shù)有效。

表5 指標(biāo)成對(duì)比較的判斷優(yōu)先矩陣

2.2.3 正交試驗(yàn)方法 按比例稱取處方中各藥材,共63 g,稱取9 份,按正交實(shí)驗(yàn)表L9(34)安排的試驗(yàn)方案[29-31]進(jìn)行全方水提,濾過(guò),合并兩次水提液,并將其濃縮至150 mL,每個(gè)正交試驗(yàn)號(hào)平行3 次試驗(yàn)。制備得到的樣品溶液,按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別測(cè)定正交供試品溶液中橙皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、川陳皮素的含量,分別取其平均值進(jìn)行綜合評(píng)分。

2.2.4 干膏得率測(cè)定 精密吸取9 種工藝條件下水煎液50 mL,水浴蒸干,置105 ℃烘箱中干燥至恒重,按下式計(jì)算干膏得率：

干膏得率(%)=(50 mL濃縮液中固形物質(zhì)量/50 mL×定容體積mL)/生藥材重量×100%

2.2.5 結(jié)果分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用綜合評(píng)分法,根據(jù)層次分析法所得權(quán)重系數(shù)計(jì)算綜合評(píng)分。綜合評(píng)分=(Y1/Y1最大值)×0.2272+(Y2/Y2最大值)×0.4231+(Y3/Y3最大值)×0.2272+(Y4/Y4最大值)×0.1225。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6,直觀分析結(jié)果見表7,方差分析結(jié)果見表8。

表6 水提工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

表7 直觀分析結(jié)果

表8 方差分析

由表7直觀分析可知,以橙皮苷、川陳皮素、干膏得率為指標(biāo),煎煮次數(shù)(D)為主要影響因素;以山柰酚-3-O-蕓香糖苷為指標(biāo),各因素的作用為C>D>B>A,工藝組合為A1B2C1D2;對(duì)于綜合評(píng)分,各因素作用為D>C>B>A,工藝組合為A1B2C2D2。分別以極值最小的因素為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析,結(jié)果顯示：對(duì)于橙皮苷和干膏得率,D因素有顯著影響;對(duì)于川陳皮素,C、D因素均有顯著性影響;對(duì)于山柰酚-3-O-蕓香糖苷和綜合評(píng)分,各因素均無(wú)顯著影響。結(jié)合直觀分析結(jié)果和生產(chǎn)成本考慮,最終選取A1B2C2D2條件為最佳水提工藝,即藥材飲片不浸泡,加8 倍量水,煎煮2 次,每次2 h。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照處方比例稱取3份藥材63 g,按照確定的最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),測(cè)定結(jié)果見表9。

表9 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

消疳健胃湯原為藥材水煎劑,在臨床上已取得較好療效。消疳健胃合劑的制備選用水作為提取溶劑,能最大程度保留原方的煎藥方式,降低物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)生變化的隱患[32]。

通過(guò)文獻(xiàn)查閱、對(duì)照品比對(duì)以及陰性溶液專屬性考察發(fā)現(xiàn),山柰酚-3-O-蕓香糖苷為方中食涼茶特有,橙皮苷、川陳皮素為陳皮所特有,專屬性良好且含量相對(duì)較高。通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描后發(fā)現(xiàn)在230 nm波長(zhǎng)處3 個(gè)成分指標(biāo)均有較大吸收,且基線穩(wěn)定、分離度良好。因此選取230 nm作為試驗(yàn)檢測(cè)波長(zhǎng)。

傳統(tǒng)中藥復(fù)方組分復(fù)雜,作用機(jī)制不明確,僅采用單一成分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)缺乏全面性[33]。本文以方中君臣藥的主要化學(xué)成分為測(cè)定指標(biāo),同時(shí)結(jié)合層次分析法建立判斷矩陣可將各指標(biāo)間的相互聯(lián)系轉(zhuǎn)為可量化的權(quán)重系數(shù),使綜合評(píng)價(jià)更具科學(xué)性。

水提是中藥合劑的重要工藝單元,其加水倍數(shù)、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)處方有效成分的保留和制劑具有重要意義。針對(duì)橙皮苷、川陳皮素、干膏率指標(biāo)而言,加水量為10 倍、提取次數(shù)為3 次評(píng)分效果最好,然而以山柰酚-3-O-蕓香糖苷和綜合評(píng)分指標(biāo)而言,加水量為8 倍、提取次數(shù)為2 次效果最好,考慮到正交結(jié)果未發(fā)現(xiàn)顯著性差異,且加水量、提取次數(shù)減少可以節(jié)約成本和效能,另外,在臨床實(shí)際煎煮中,也是以煎煮2 次為最佳,因此最終選擇加水量為8 倍、提取次數(shù)為2 次。

本文采用層次分析法結(jié)合多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià),對(duì)消疳健胃合劑的最佳水提工藝進(jìn)行了考察,為消疳健胃合劑的進(jìn)一步開發(fā)研究和臨床應(yīng)用提供了參考依據(jù)。