吳 迪,王 清,張殿文,李 偉,李 響

(1吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院·吉林 長(zhǎng)春 130012;2吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院·吉林 長(zhǎng)春 130021)

發(fā)熱是各種疾病常見(jiàn)的臨床癥狀,西醫(yī)常規(guī)給予解熱藥等進(jìn)行治療,反復(fù)應(yīng)用易出現(xiàn)一定的副作用。而中藥治療不僅標(biāo)本兼治,可雙向調(diào)節(jié)且毒副作用較小[1-2]。黃芩是清熱復(fù)方制劑中應(yīng)用較為廣泛的中藥之一,具有清熱瀉火解功效[3]。黃芩黃酮類(lèi)化合物的含量較高,黃芩苷具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗抑郁、解熱、降壓和抗變態(tài)反應(yīng)等藥理作用[4]。在很黃芩復(fù)方制劑中,黃芩苷解熱作用顯著[5],其解熱機(jī)制還不十分清楚。本研究采用背部皮下注射干酵母方法構(gòu)建大鼠發(fā)熱模型,觀察不同劑量不同時(shí)間黃芩苷的解熱作用,通過(guò)檢測(cè)大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2和cAMP的含量以及腦組織NF-κB表達(dá),探討其解熱機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)SD 大鼠75 只,雄性,6周齡,體質(zhì)量180～200 g,購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)2020-0001,質(zhì)量合格證號(hào)為210726220101217356。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境3 d,屏障條件下常規(guī)喂養(yǎng),自由攝取水和食物。

1.2 藥物及試劑 黃芩苷：購(gòu)自潤(rùn)友化學(xué)(深圳)有限公司,批號(hào)G07S11L123706;阿司匹林腸溶片：購(gòu)自沈陽(yáng)奧吉娜藥業(yè)有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20065051。酵母浸粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司,批號(hào)20210302;RIPA裂解液：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒：上海碧云天公司;TNF-α、1L-1β、1L-6、PGE2和cAMP ELISA試劑盒：美國(guó)BD公司。

1.3 主要儀器 ST-360酶標(biāo)儀：上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司;DT5-3低速臺(tái)式離心機(jī)：北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司;HC-3618R型高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;KZ-II高速組織研磨儀：武漢賽維爾生物科技有限公司;微量移液器：德國(guó)Eppecdorf公司;BT255天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、造模及給藥 取適應(yīng)環(huán)境的SD大鼠75 只,實(shí)驗(yàn)前測(cè)量大鼠的基礎(chǔ)肛溫。剔除體溫超過(guò)正常范圍或相鄰兩次體溫差值過(guò)大的動(dòng)物。取其平均值作為基礎(chǔ)體溫。選出符合實(shí)驗(yàn)條件的大鼠70 只,分為正常對(duì)照組10 只(蒸餾水10 mL/kg)、造模組60 只(20%干酵母10 mL/kg)。造模組隨機(jī)分為模型組(蒸餾水10 mL/kg),阿司匹林腸溶片組(0.1 g/kg),黃芩苷高、中、低劑量組(160、80、40 mg/kg),每組12 只。正常組和模型組灌胃相同體積的蒸餾水,其他各組分別給予相應(yīng)藥液,每日1 次,連續(xù)3 d。第3 天采用酵母菌誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱模型[6-7]。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水,給藥第3 天,除正常組背部皮下注射生理鹽水(10 mL/kg),其余各組均背部皮下注射20%干酵母混懸液(10 mL/kg)。酵母菌注射2 h后,給予第3 天藥液。

2.2 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

2.2.1 體溫測(cè)定 造模組大鼠皮下注射干酵母混懸液后,每間隔1 h測(cè)量1 次體溫,造模成功后(約2 h),每組選擇造模成功的10 只大鼠進(jìn)行測(cè)溫。各組分別灌胃給予相應(yīng)藥液,藥后1、2、3、4 h各測(cè)量體溫1 次,記錄數(shù)據(jù)。

2.2.2 血清TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2與cAMP含量測(cè)定 末次測(cè)溫后,3%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉(300 mg/kg,10 mL/kg),解剖大鼠,腹主動(dòng)脈取血,靜置,4 ℃、離心半徑8 cm,2 500 r/min離心10 min,收集上清液,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法,ELISA方法測(cè)定大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、cAMP含量。

2.2.3 腦組織NF-κB p65蛋白表達(dá)的Western Blot檢測(cè) 稱(chēng)取100 mg腦組織加入RIPA裂解液及磷酸酶抑制劑于1.5 mL的EP管中,超聲粉碎后靜置15～20 min,4 ℃、12 000 r/min離心15 min,取上清用BCA法進(jìn)行蛋白定量;Western blot法檢測(cè)NF-κB p65蛋白表達(dá),以β-actin為內(nèi)參,根據(jù)蛋白灰度比值,計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠體溫變化 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體溫變化比較

3.2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、cAMP含量變化 見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、cAMP水平比較

3.3 各組大鼠腦組織NF-κB p65蛋白表達(dá)的Western Blot檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)圖1～圖2。

注：1.正常組;2.模型組;3.阿司匹林組;4～6.黃芩苷高、中、低劑量組圖1 各組大鼠腦組織NF-κB p65蛋白表達(dá)的Western Blot 檢測(cè)結(jié)果

注：1.正常組;2.模型組;3.阿司匹林組;4～6.黃芩苷高、中、低劑量組與模型組比較 *P<0.05,**P<0.01圖2 各組大鼠腦組織NF-κB p65表達(dá)的比較

4 討論

利用干酵母構(gòu)建發(fā)熱模型是研究藥物解熱作用機(jī)制的常用方法[8]。注射酵母菌后,注射部位發(fā)生局部潰爛,從而引發(fā)劇烈炎癥反應(yīng)而發(fā)熱[9]。龔春燕[10]利用干酵母誘導(dǎo)發(fā)熱模型明確了酵母菌的致熱作用。黨玨[11]吳佳霖[12]等的研究證實(shí)干酵母致熱后動(dòng)物體溫的發(fā)展變化趨勢(shì),本文模型組動(dòng)物體溫的發(fā)展變化與之相一致。干酵母誘導(dǎo)體溫升高后,促進(jìn)內(nèi)生致熱原的產(chǎn)生和釋放,同時(shí)激活體內(nèi)的內(nèi)生致熱原細(xì)胞[13]。目前公認(rèn)的參與多種致熱性發(fā)熱的重要細(xì)胞因子包括 TNF-α、IL-1β、IL-6[14],其通過(guò)作用于中樞體溫正性調(diào)節(jié)介質(zhì),促使下丘腦前部視前區(qū)的體溫正調(diào)節(jié)中樞核將體溫調(diào)定點(diǎn)上調(diào),引起發(fā)熱[15]。PGE2是與體溫調(diào)節(jié)有關(guān)的主要介質(zhì),同時(shí)也是最強(qiáng)的內(nèi)生致熱源之一[16-17]。研究表明,發(fā)熱時(shí)動(dòng)物的血清或者腦脊液中PGE2含量增高。cAMP是發(fā)熱中樞正調(diào)節(jié)介質(zhì)[18],cAMP含量增多,體溫相對(duì)應(yīng)升高,二者成顯著正相關(guān)[19]。PGE2和cAMP可通過(guò)某種特定方式作用于下丘腦,使體溫調(diào)定點(diǎn)上移,引起體溫升高。NF-κB是細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子家族的通用名稱(chēng),參與機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等,是重要的核轉(zhuǎn)錄因子和關(guān)鍵介質(zhì)[20]。一系列致病刺激如：細(xì)菌毒性產(chǎn)物和病毒蛋白、炎性細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、物理化學(xué)因子、致凋亡因子、輻射、缺血/再灌注和氧化應(yīng)激均可激活NF-κB通路。由此可見(jiàn),NF-κB的活化是引起炎癥的關(guān)鍵步驟[21]。NF-κB家族成員有P50(NFκB1)、P65(RelA)、P52(NFκB2)、RelB和c-Rel。其發(fā)揮生物學(xué)作用的前提是各個(gè)亞型形成二聚體,最常見(jiàn)的就是NF-κB p65[22]。許多包含中藥成分的抗炎藥物,都以NF-κB p65炎癥信號(hào)通路的激活為靶點(diǎn)[23]。因此,抑制NF-κB是抑制發(fā)熱的有效途徑。

本研究結(jié)果表明,模型組大鼠皮下注射酵母菌懸液后體溫持續(xù)升高達(dá)6 h,而黃芩苷高劑量組大鼠體溫明顯低于模型組,且血清TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2和cAMP含量明顯降低;提示黃芩苷對(duì)致熱炎癥因子有顯著抑制作用。同時(shí),模型組大鼠下丘腦NF-κB p65蛋白表達(dá)量增多,而黃芩苷高劑量組大鼠NF-κB p65蛋白表達(dá)下降,提示黃芩苷對(duì)腦組織NF-κB p65蛋白有抑制作用。表明黃芩苷通過(guò)抑制炎癥因子的分泌和釋放以及降低腦組織NF-κB p65蛋白的活性從而影響NF-κB信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮解熱作用。