鄧 娟，王秀芳，孫瑞青

空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，陜西 西安 710032

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)是一種復(fù)雜的免疫介導(dǎo)的肝病,患者大多數(shù)需要終身治療,以防止肝硬化和終末期肝病的發(fā)展[1]。目前,關(guān)于AIH的治療主要以糖皮質(zhì)激素和硫唑嘌呤治療,但治療效果有限。漢黃芩素(wogonin,WG)是一種黃酮類物質(zhì),是從黃芩根(scutellarin radix)中分離得到的天然成分,是一種常用的用于過敏和癌輔助治療的藥材[2-3]。WG的抗氧化作用已在多種疾病中得到證實,特別是與炎性反應(yīng)有關(guān)的疾病,如非酒精性脂肪性肝炎[4]。WG不僅能夠激活小鼠肝細(xì)胞(AML12)中轉(zhuǎn)錄因子4(transcription factor 4,ATF4)-成纖維細(xì)胞生長因子21(fibroblast growth factor 21,FGF21)表達(dá),改善代謝性疾病,還能通過核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf 2)介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子(kappa B,NF-κB)信號緩解膿毒癥肝損傷[5-6]。AIH與自身免疫紊亂直接相關(guān),輔助性T細(xì)胞17(Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)失衡會導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂促進(jìn)AIH的發(fā)生[7]。Notch信號的持續(xù)失調(diào)會促進(jìn)肝臟炎性反應(yīng)和腫瘤發(fā)展產(chǎn)生[8]。下調(diào)Notch信號軸會促進(jìn)肝卵圓細(xì)胞分化為肝細(xì)胞進(jìn)而緩解肝損傷[9]。本研究旨在探究WG對AIH大鼠Th17/Treg細(xì)胞平衡和Notch信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:SPF級雄性SD大鼠(200～220 g)[貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,生產(chǎn)許可證號:SCXK(黔)2018-0001]。本研究已獲得本院動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑及試劑盒:漢黃芩素(WG)(北京伊塔生物科技有限公司);伴刀豆球蛋白A(concanavalin A,ConA,上海源葉生物科技有限公司);Notch信號通路激活劑丙戊酸(valproic acid,VPA)(北京百奧萊博科技有限公司);丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)試劑盒和腫瘤壞死因子-β(tumor necrosis factor-β,TNF-β)試劑盒[博輝生物科技(廣州)有限公司];白介素10(interleukin 10,IL-10)試劑盒、白介素17(interleukin 17,IL-17)試劑盒和白介素-23(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);CD4-APC、IL-17-PE抗體、抗-類視黃酸相關(guān)孤兒受體γt(retinoid acid-related orphan receptor γ t,RORγt)、-叉頭框蛋白P3(forkhead box protein P3,Foxp3)、-Notch、-hes家族bHLH轉(zhuǎn)錄因子1(hes family bHLH transcription factor 1 gene,HES1)和-含YRPW基序的bHLH轉(zhuǎn)錄因子hes相關(guān)家族1(hes related family bHLH transcription factor with YRPW motif 1,HEY1)抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理: 隨機選擇10只大鼠作為對照組,其余大鼠參考先前文獻(xiàn)[4],通過尾靜脈注射ConA溶液12.5 mg/kg,每周1次,連續(xù)注射6周,構(gòu)建AIH大鼠模型。隨機選擇5只大鼠根據(jù)HE染色情況判斷造模是否成功,將造模成功大鼠隨機分為AIH組、L-WG組、M-WG組、H-WG組和H-WG+丙戊酸(VPA)組,每組10只。L-WG組、M-WG組、H-WG組分別腹腔注射WG 10、20、30 mg/kg[10],每天1次,持續(xù)10 d。H-WG+VPA組在注射WG(30 mg/kg)的基礎(chǔ)上,隨后,注射300 mg/kg VPA[11],每天1次,持續(xù)10 d。AIH組和對照組給予等量0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 采集標(biāo)本: 藥物治療結(jié)束第2天,通過腹主動脈采血3 mL,經(jīng)3 000 r/min離心10 min后取上清液,置于-20 ℃保存以備后續(xù)ELISA檢測。麻醉后處死大鼠,分離肝臟和脾臟組織,一部分肝臟組織固定于4%多聚甲醛中用于HE染色和免疫組化,剩下的肝臟組織和脾臟組織儲存于-80 ℃中用于Western blot和流式細(xì)胞測量術(shù)。

1.2.3 ELISA檢測血清中炎性因子及肝功能: 取上述保存的血清,參照ELISA試劑盒步驟檢測大鼠血清中肝功能指標(biāo)(ALT和AST)以及炎性因子(IL-10、TNF-β、IL-17和IL-23)水平。

1.2.4 HE染色觀察肝臟組織形態(tài): 取4%多聚甲醛溶液中固定的肝臟組織,經(jīng)過水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋后切成4 μm薄片,隨后將切片置于烤箱1 h,脫蠟、脫水后,用蘇木精和伊紅染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)。

1.2.5 流式細(xì)胞測量術(shù)檢測脾臟Th17/Treg細(xì)胞水平: 分離脾臟組織的淋巴細(xì)胞,加入緩沖液細(xì)胞懸浮液,使每孔細(xì)胞濃度稀釋到1×109細(xì)胞/L,與CD4-APC、IL-17-PE避光孵育20 min,用流式細(xì)胞儀檢測Th17細(xì)胞數(shù)量,另外與CD4-APC、FOXP3-FITC避光孵育20 min,檢測Treg細(xì)胞數(shù)量。

1.2.6 Western blot檢測脾臟RORγt、Foxp3以及肝組織Notch信號通路蛋白表達(dá) 取-80 ℃保存的肝臟和脾臟組織,分別加入RIPA裂解緩沖液后提取總蛋白,將蛋白質(zhì)進(jìn)行定量、電泳、轉(zhuǎn)膜,將膜于室溫封閉3h后分別加入一抗:抗-RORγt(∶1 000)、-Foxp3(1∶1 000)、-Notch(1∶1 000)、-HES1(1∶1 000)、-HEY1(1∶2 000)和-GAPDH抗體(1∶1 000),于4 ℃孵育一夜,加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶2 000),室溫孵育3 h,加入ECL試劑使蛋白條帶顯影后。使用Image J軟件分析蛋白的吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 WG對大鼠血清ALT、AST活性的影響

與對照組相比,AIH組大鼠ALT、AST活性顯著上升(P<0.05);與AIH組相比,L-WG組、M-WG組、H-WG組大鼠ALT、AST活性依次顯著降低(P<0.05);與H-WG組相比,H-WG+VPA組大鼠ALT、AST活性顯著增加(P<0.05)(表1)。

表1 WG對大鼠血清ALT、AST活性的影響Table 1 Effect of WG on serum ALT and AST activity

2.2 WG對大鼠血清炎性因子的影響

與對照組相比,AIH組大鼠IL-17和IL-23含量顯著上升(P<0.05),IL-10和TNF-β含量顯著下降(P<0.05);與AIH組相比,L-WG組、M-WG組、H-WG組大鼠IL-17和IL-23水平顯著降低(P<0.05),IL-10和TNF-β水平顯著上升(P<0.05);與H-WG組相比,H-WG+VPA組大鼠IL-17和IL-23含量顯著增加(P<0.05),IL-10和TNF-β含量顯著減少(P<0.05)(表2)。

表2 WG對大鼠血清炎性因子的影響Table 2 Effect of WG on aerum inflammatory factors in rats pg/mL, n=10)

2.3 WG對大鼠肝臟組織損傷的影響

對照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常,染色清晰;AIH組大鼠肝組織細(xì)胞出現(xiàn)水腫,細(xì)胞體積增大導(dǎo)致肝竇受壓變窄,出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤及少量細(xì)胞壞死現(xiàn)象。L-WG組、M-WG組、H-WG組改善了以上現(xiàn)象;H-WG+VPA組與AIH組結(jié)構(gòu)相似(圖1)。

AIH.autoimmune hepatitis; WG.wogonin; VPA.valproic acid; H-WG.30 mg/kg wogonin.圖1 HE染色檢測肝臟組織病理變化Fig 1 HE staining for pathological changes in liver tissue(×200)

2.4 WG對大鼠脾臟Th17/Treg 細(xì)胞水平的影響

與對照組相比,AIH組大鼠Th17細(xì)胞水平、Th17/Treg均顯著上升(P<0.05),Treg細(xì)胞水平顯著下降(P<0.05);與AIH組相比,L-WG組、M-WG組、H-WG組大鼠Th17細(xì)胞水平以及Th17/Treg依次顯著降低(P<0.05),Treg細(xì)胞水平顯著上升(P<0.05);與H-WG組相比,H-WG+VPA組大鼠Th17細(xì)胞水平、Th17/Treg比例顯著增加(P<0.05),Treg細(xì)胞水平顯著減小(P<0.05)(表3)。

表3 WG對大鼠脾臟Th17/Treg 細(xì)胞水平的影響Table 3 Effect of WG on Th17/Treg cell levels

2.5 WG對大鼠脾臟中Foxp3、RORγt水平的影響

與對照組相比,AIH組大鼠RORγt水平顯著上升(P<0.05),Foxp3水平顯著下降(P<0.05);與AIH組相比,L-WG組、M-WG組、H-WG組大鼠RORγt水平依次顯著下降(P<0.05),Foxp3水平依次顯著升高(P<0.05);與H-WG組相比,H-WG+VPA組大鼠RORγt水平顯著增加(P<0.05),Foxp3水平顯著減少(P<0.05)(圖2)。

AIH.autoimmune hepatitis; L-WG.10 mg/kg wogonin; M-WG.20 mg/kg wogonin; H-WG.30 mg/kg wogonin; VPA.valproic acid; *P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with AIH; △P<0.05 compared with H-WG.圖2 WG對大鼠肝中Foxp3、RORγt水平的影響Fig 2 Effect of WG on Foxp3 and RORγt levels in rat n=10)

2.6 WG對大鼠肝組織Notch信號通路蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比,AIH組大鼠Notch、HES1、HEY1蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05);與AIH組相比,L-WG組、M-WG組、H-WG組大鼠Notch、HES1、HEY1蛋白表達(dá)依次顯著降低(P<0.05);與H-WG組相比,H-WG+VPA組大鼠Notch、HES1、HEY1蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)(圖3)。

AIH.autoimmune hepatitis; L-WG.10 mg/kg wogonin; M-WG.20 mg/kg wogonin; H-WG.30 mg/kg wogonin; VPA.valproic acid; *P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with AIH; △P<0.05 compared with H-WG.圖3 WG對大鼠肝組織Notch、HES1、HEY1蛋白表達(dá)的影響Fig 3 Effect of WG on Notch, HES1, and HEY1 protein expression in rat liver n=10)

3 討論

AIH是一種病因不明的慢性進(jìn)行性肝病,全球AIH患病率呈上升趨勢,特別是在男性中。AIH會導(dǎo)致肝硬化和相關(guān)并發(fā)癥,甚至有發(fā)展為肝細(xì)胞癌的風(fēng)險[12]。因此,尋找AIH的潛在治療藥物極其重要。WG可通過調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的活化和凋亡來減輕肝纖維化,成為治療和預(yù)防肝慢性炎性的潛在藥物[13]。WG可以改善氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng),從而成為緩解敗血癥肝損傷的潛在治療劑[4]。本研究發(fā)現(xiàn),AIH組大鼠肝組織出現(xiàn)明顯的病理損傷,同時ALT、AST活性升高,與既往研究[14]一致,表明AIH大鼠造模成功;不同劑量WG的干預(yù)不僅改善了肝臟病理損傷現(xiàn)象,還降低了ALT、AST活性,表明WG尤其是高劑量(30 mg/kg)WG可減輕肝損傷,提示W(wǎng)G可能是AIH的潛在治療靶點。

Th17細(xì)胞在多種免疫性疾病中發(fā)揮促炎作用,而Treg細(xì)胞是維持免疫穩(wěn)態(tài)和誘導(dǎo)免疫耐受的關(guān)鍵因子,Th17/Treg失衡促進(jìn)了AIH的發(fā)生[8]。Th17細(xì)胞可以通過產(chǎn)生促炎因子(IL-17、IL-22和IL-23),募集中性粒細(xì)胞,進(jìn)而加重炎性反應(yīng);而Treg細(xì)胞可以通過產(chǎn)生抗炎因子(IL-10和TGF-β),維持免疫穩(wěn)態(tài)。RORγt與Foxp3分別是Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[15]。本研究發(fā)現(xiàn),WG可通過調(diào)節(jié)炎性因子水平促進(jìn)AIH大鼠Th17/Treg平衡。

Notch激活會破壞肝臟穩(wěn)態(tài),加重小鼠肝纖維化[16]。下調(diào)Notch、HES1、HEY1表達(dá)可以抑制肝癌的發(fā)展[17]。下調(diào)Notch信號軸會恢復(fù)Th17/Treg平衡進(jìn)而緩解大鼠自身免疫性葡萄膜炎[18]。在本研究中,Notch、HES1、HEY1蛋白高表達(dá),與相關(guān)報道[19]相似,提示AIH大鼠中Notch信號通路處于激活狀態(tài);而WG治療后Notch、HES1、HEY1蛋白水平下降,提示W(wǎng)G可通過下調(diào)Notch信號通路,促進(jìn)Th17/Treg平衡,減輕AIH大鼠肝損傷。為了進(jìn)一步證實此推測,在H-WG治療的基礎(chǔ)上,注射Notch信號通路激活劑VPA,結(jié)果發(fā)現(xiàn)VPA可消除H-WG對AIH大鼠肝損傷的治療作用。

綜上所述,WG可能通過下調(diào)Notch信號軸來維持Th17/Treg平衡,進(jìn)而改善AIH大鼠肝臟損傷。且WG治療效果呈劑量依賴性。然而,WG是否可以通過調(diào)控其他通過起到同樣緩解肝損傷的效果需要進(jìn)一步探究。