史 寶, 王成剛, 湯曉華, 趙新宇, 晏科文, 馬曉東

星康吉鰻精子的超微結(jié)構(gòu)研究

史 寶1, 王成剛2, 湯曉華2, 趙新宇1, 晏科文1, 馬曉東1

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 海陽(yáng)市黃海水產(chǎn)有限公司, 山東 煙臺(tái) 265100)

為探討星康吉鰻()精子的超微結(jié)構(gòu)和形態(tài), 應(yīng)用掃描電鏡和透射電鏡對(duì)星康吉鰻精子結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。結(jié)果表明, 精子由頭部、中段和鞭毛3部分組成, 有其獨(dú)特的結(jié)構(gòu), 總長(zhǎng)度為35.75± 1.15μm。精子頭部為新月形, 主要由細(xì)胞核構(gòu)成, 細(xì)胞核內(nèi)有核泡, 無(wú)頂體結(jié)構(gòu)。精子頭部的質(zhì)膜內(nèi)包含單一的線粒體。精子頭部長(zhǎng)為3.33±0.16um, 頭寬為1.12±0.13 um。在精子頭部的凸面上, 有4條從中段到頭端的條紋。精子中段伸出一支根, 支根位于精子的中段末端。精子中段長(zhǎng)度為0.55±0.05 um, 支根長(zhǎng)度為1.38±0.08 um、直徑為90.48±6.06 nm。精子尾部鞭毛細(xì)長(zhǎng), 鞭毛橫切面呈圓形, 無(wú)側(cè)鰭, 鞭毛的軸絲結(jié)構(gòu)為“9+0”型; 一些鞭毛的末端呈現(xiàn)卷曲狀, 發(fā)育機(jī)制尚不明確。精子鞭毛長(zhǎng)為31.16±1.51 μm, 鞭毛直徑為0.17±0.01 μm。通過(guò)比較分析發(fā)現(xiàn)精子的這些形態(tài)學(xué)特征不僅表現(xiàn)在星康吉鰻精子, 還表現(xiàn)在鰻鱺目其他屬的精子; 表明是鰻鱺目精子的共同特征。本研究揭示了星康吉鰻精子的形態(tài)結(jié)構(gòu), 為突破星康吉鰻人工繁殖技術(shù)提供了理論參考。

星康吉鰻(); 精子; 超微結(jié)構(gòu); 精子形態(tài)

在超過(guò)17.1萬(wàn)種已做過(guò)分類(lèi)學(xué)研究的水生動(dòng)物中, 有超過(guò)3.3萬(wàn)種是魚(yú)類(lèi), 其中1.98萬(wàn)種是海洋魚(yú)類(lèi)[1]。在大約350種魚(yú)類(lèi)研究了精子的形態(tài)、活力, 精液生化等生物學(xué)特征[2]。精子將雄性單倍體染色體組運(yùn)送到卵母細(xì)胞。精子的形態(tài)與精子的質(zhì)量密切相關(guān), 高質(zhì)量的配子是成功受精的先決條件, 并確保獲得優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)養(yǎng)殖苗種[3-4]。硬骨魚(yú)類(lèi)的繁殖方式和系統(tǒng)進(jìn)化上所處的位置影響其精子結(jié)構(gòu)。而且, 魚(yú)類(lèi)精子的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)在不同科之間甚至在亞科之間存在差異[5]。精子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)研究對(duì)于鑒定魚(yú)類(lèi)系統(tǒng)進(jìn)化分類(lèi)[6]以及確定冷凍保存操作引起的細(xì)胞損傷[7]等方面也具有指導(dǎo)作用。

星康吉鰻()隸屬于脊索動(dòng)物門(mén)(Chordata)、腹鰭魚(yú)綱(Actinopterygii)、鰻鱺目(Anguil-liformes)、康吉鰻科(Congridae)、康吉鰻屬(), 系暖溫性近海底層魚(yú)類(lèi), 主要分布于中國(guó)黃渤海、東海, 以及朝鮮、日本、韓國(guó)等海域沿岸, 具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值, 是重要的捕撈對(duì)象[8-9]。星康吉鰻肉質(zhì)鮮美、出口創(chuàng)匯潛力大, 是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)種之一[10]。2011—2017年在中國(guó)東黃海進(jìn)行的底拖網(wǎng)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示星康吉鰻開(kāi)發(fā)率過(guò)高, 處于過(guò)度捕撈狀態(tài)[11]; 1995—2008年日本農(nóng)林水產(chǎn)省官網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示日本海域星康吉鰻漁獲量從13 000 t降到6 300 t[12]; 1985—2001年聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)數(shù)據(jù)顯示韓國(guó)海域星康吉鰻漁獲量從20 000 t降到8 000 t, 然后逐步恢復(fù)到20 000 t[13]。因?yàn)樾强导犦^高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和持續(xù)增加的捕撈力度, 東亞國(guó)家的漁政管理者、科研工作者和水產(chǎn)養(yǎng)殖、加工企業(yè)加大對(duì)星康吉鰻這一重要漁業(yè)資源的關(guān)注[14-15]。但發(fā)展星康吉鰻養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè), 當(dāng)前主要限制因素是還不能通過(guò)人工繁育技術(shù)提供玻璃鰻苗種, 亟需開(kāi)展星康吉鰻繁育技術(shù)研究。

國(guó)內(nèi)外對(duì)日本鰻鱺()、歐洲鰻鱺()等鰻鱺目魚(yú)類(lèi)的精子超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究[16-20]; 星康吉鰻為體外受精魚(yú)類(lèi), 但其精子形態(tài)結(jié)構(gòu)方面研究資料相對(duì)匱乏。在星康吉鰻繁育探索試驗(yàn)中, 我們發(fā)現(xiàn)精子活力弱、受精率低的現(xiàn)象。精子的形態(tài)和功能存在密切的關(guān)系, 影響精子游動(dòng)速度、授精能力[21-23]。本研究采用掃描電鏡和透射電鏡對(duì)星康吉鰻精子形態(tài)的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察, 并和鰻鱺目魚(yú)類(lèi)精子形態(tài)進(jìn)行比較分析, 探討了星康吉鰻精子的形態(tài)和精細(xì)結(jié)構(gòu)特征, 以期豐富星康吉鰻繁殖生物學(xué)的內(nèi)容, 為提高星康吉鰻高精子活力、受精率和精子冷凍保存效果等研究提供科學(xué)依據(jù), 并為提高其人工繁殖的成功率提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚(yú)和精液采集

挑選體質(zhì)健壯、性成熟的雄性星康吉鰻親魚(yú)30尾用于本研究。試驗(yàn)魚(yú)體質(zhì)量范圍84.9～2 413.7 g, 全長(zhǎng)范圍36.1～96.2 cm, 培育水溫12～22 ℃, 鹽度27～ 32, 光照強(qiáng)度 200～1 000 lx, 溶氧大于≥6 mg/L, pH 為7.8～8.2, 日換水率400%～900%; 試驗(yàn)所用的雄鰻培育在海陽(yáng)市黃海水產(chǎn)有限公司的星康吉鰻親魚(yú)培育系統(tǒng)。

對(duì)性成熟雄性星康吉鰻親魚(yú)采用人工擠壓的方式采集精液。采精時(shí)先將實(shí)驗(yàn)魚(yú)以240 mg/L的MS222輕度麻醉, 后用干凈紗布輕輕擦拭魚(yú)體生殖孔及其周?chē)鷧^(qū)域, 防止體表尿液和糞便等污染。將雄鰻置于墊有干凈濕毛巾的泡沫板上, 輕輕擠壓雄鰻的生殖腺, 擠出精液, 待流出的精液呈乳白色后, 用經(jīng)過(guò)消毒的干燥玻璃管吸取精液并置于潔凈的離心管, 放入2.5%的戊二醛(0.1 mol/L PBS配制, pH 7.4, 4 ℃)固定, 置于4 ℃冰箱保存, 用于電鏡制樣和實(shí)驗(yàn)觀察。同時(shí), 每批雄鰻精子采集時(shí), 取1 μL精液, 使用過(guò)濾的海水激活精子, 快速在顯微鏡下觀察精子運(yùn)動(dòng)情況; 鏡檢發(fā)現(xiàn)精子運(yùn)動(dòng)率在90%以上的樣品, 該批精子用于后續(xù)電鏡試驗(yàn)研究。

1.2 掃描電鏡樣品準(zhǔn)備

分別對(duì)10尾性成熟雄鰻精液取樣, 每尾取約0.5 mL精液, 混合置于15 mL無(wú)菌的離心管中。取l mL混合精液立即注入盛有10倍體積2.5%戊二醛的離心管中, 4 ℃冰箱保存, 備用。用0.1 mol/L的PBS緩沖液(pH 7.4, 4 ℃)漂洗, 再用l%的鋨酸進(jìn)行固定, 經(jīng)乙醇系列梯度脫水,后進(jìn)行乙酸異戊酯取代乙醇。EiKo公司XD-1型二氧化碳臨界點(diǎn)干燥器干燥, EiKo公司IB-3型離子鍍膜儀噴金鍍膜。采用日本日立公司SN-3500掃描電鏡觀察并拍照。

1.3 透射電鏡樣品準(zhǔn)備

將1.2所述固定精液以2 000 r/min離心10 min, 去除上清液, 經(jīng)0.1 mol/L pH值為7.4的PBS緩沖液洗滌, 用1%鋨酸4 ℃固定2 h。PBS緩沖液洗滌, 乙醇系列逐級(jí)脫水, Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋, ULTRACUTE超薄切片機(jī)切片, 樣品經(jīng)乙酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色, 采用JEOL-100cx II型透射電鏡觀察并拍照。

1.4 圖像與數(shù)據(jù)處理

選擇清晰的電鏡樣品圖像, 采用Adobe Photoshop CS3對(duì)圖像進(jìn)行編輯處理, 用Microsoft Excel 2010對(duì)精子各組成部分長(zhǎng)度進(jìn)行數(shù)據(jù)相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 掃描電鏡觀察

掃描電鏡結(jié)果顯示星康吉鰻精子由頭部(H, Head)、中段(MP, Middle piece)和鞭毛(F, Flagellum)3個(gè)部分組成, 總長(zhǎng)度為35.75±1.15 μm。頭部微微彎曲, 中段變窄, 中段除了與鞭毛鏈接外, 末端有1個(gè)突出的短棒狀結(jié)構(gòu)支根(R, Rootlet); 中段與尾部鞭毛相連, 部分精子鞭毛的末端卷曲略微呈扇形(圖1-1、1-2)。

星康吉鰻精子頭部長(zhǎng)為3.33±0.16 μm, 頭部寬為1.12±0.13 μm, 頭部外觀呈現(xiàn)為新月形, 無(wú)頂體結(jié)構(gòu); 精子頭部后方逐漸變錐形至細(xì)的中段(圖1-1、1-2)。在精子頭部的凸面上, 可以看到4條從中段到頭端的條紋(S, Striae)(圖1-3)。精子的中段收縮, 長(zhǎng)度為0.55±0.05 μm(圖1-2)。支根長(zhǎng)為1.38±0.08 μm, 支根直徑為90.48±6.06 nm, 從中段末端靠近鞭毛的起始處向外突出形成(圖1-2)。精子的鞭毛多數(shù)是延長(zhǎng)的線型, 鞭毛長(zhǎng)為31.16±1.51 μm, 鞭毛的直徑為0.17±0.01 μm; 部分鞭毛呈現(xiàn)卷曲狀, 在卷曲情況下鞭毛從中心到外圍緊緊地卷曲著大約5～8層(圖1-1、1-2)。星康吉鰻精子的頭長(zhǎng)、頭寬、鞭毛長(zhǎng)、支根長(zhǎng)的長(zhǎng)度與鰻鱺目其他魚(yú)類(lèi)精子相關(guān)指標(biāo)的長(zhǎng)度匯總見(jiàn)表1。

圖1 星康吉鰻精子的超微結(jié)構(gòu)

注: 1. 掃描電鏡下精子全貌; 2. 掃描電鏡下精子全貌的放大; 3. 掃描電鏡下精子頭部; 4. 透射電鏡高倍下精子頭部縱切, 可見(jiàn)線粒體; 5. 透射電鏡下精子頭部縱切, 可見(jiàn)支根; 6. 透射電鏡高倍下精子頭部縱切, 可見(jiàn)核糖核蛋白體; 7. 透射電鏡高倍下精子頭部縱切, 可見(jiàn)遠(yuǎn)端中心粒和近端中心粒; 8. 透射電鏡下鞭毛縱切; 9. 透射電鏡下鞭毛橫切面; 10. 透射電鏡下鞭毛遠(yuǎn)端橫切面; H. 頭部; MP. 中段; F. 鞭毛; R. 支根; S.條紋; PM. 質(zhì)膜; N. 細(xì)胞核; NM. 核膜; NV. 核泡; M. 線粒體; MM. 線粒體膜; Cr. 嵴; Rib. 核糖核蛋白體; PC. 近端中心粒; DC. 近端中心粒; IDA. 內(nèi)動(dòng)力蛋白臂; Y. 放射狀的Y形電子致密體

表1 鰻鱺目魚(yú)類(lèi)精子形態(tài)特征比較

2.2 透射電鏡觀察

2.2.1 頭部微觀結(jié)構(gòu)

在透射電鏡下縱切可以觀察到星康吉鰻的精子頭部外被一層不平滑的波浪形質(zhì)膜(PM, Plasma membrane)包被, 質(zhì)膜與致密的核(N, Nuclear)之間有較大的空隙(圖1-4、1-5)。精子核很大, 幾乎占據(jù)了精子頭部整個(gè)空間, 精核由核膜(NM, Nuclear membrane)包裹, 核內(nèi)充滿(mǎn)電子致密物質(zhì), 含有形成細(xì)胞核的染色質(zhì)物質(zhì); 細(xì)胞核內(nèi)有核泡 (NV, Nuclear vacuole), 并且隨機(jī)分布在細(xì)胞核內(nèi), 核泡中含有細(xì)胞質(zhì)物質(zhì), 一些細(xì)胞核含有多個(gè)核泡(圖1-4、1-5)。精子頭部的質(zhì)膜內(nèi)包含一個(gè)球狀體呈晶體結(jié)構(gòu), 表明它是線粒體(M, Mitochondrion), 線粒體由線粒體外膜(MM, Mitochondrial membrane)包圍, 內(nèi)膜向內(nèi)延伸, 形成眾多的嵴(Cr, Cristae), 基質(zhì)和核糖核蛋白體(Rib, Ribonucleoprotein)分散在線粒體內(nèi)(圖1-4、1-6)。整個(gè)精子頭部包括線粒體在內(nèi)均覆蓋著一層質(zhì)膜(圖1-4、1-5)。

2.2.2 中段微觀結(jié)構(gòu)

星康吉鰻精子頭部靠近鞭毛側(cè)基部凹陷形成中段(圖1-5)。中段位于頭、尾結(jié)合處, 中段與尾部鞭毛鏈接, 并伸出一支根(圖1-5)。透射電鏡下可觀察到靠近精子頭部的近端中心粒(PC, Proximal centriole)和靠近鞭毛的遠(yuǎn)端中心粒(DC, Distal centriole)(圖1-5、1-7)。可以看到精子表面上的條紋(S)從近端中心粒延伸到精子頭部(圖1-5、1-6)。

2.2.3 尾部微觀結(jié)構(gòu)

星康吉鰻精子的鞭毛橫切面呈圓形(圖1-8), 無(wú)側(cè)鰭, 鞭毛外由一層質(zhì)膜包圍, 鞭毛的軸絲為“9+0”結(jié)構(gòu)(圖1-9、1-10)。在鞭毛的橫切面上, 每?jī)蓚€(gè)亞纖維上都有內(nèi)動(dòng)力蛋白臂(IDA, Inner dynein arm), 但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)外動(dòng)力蛋白臂(圖1-9)。在靠近遠(yuǎn)端中心粒的鞭毛中, 兩個(gè)亞纖維通過(guò)放射狀的Y形電子致密體(Y, Radial Y-shape electron dense body)與質(zhì)膜相連(圖1-9)。在鞭毛遠(yuǎn)端, 兩個(gè)亞纖維變得不清楚(圖1-10)。

3 討論

魚(yú)類(lèi)的精子形態(tài)和功能密切相關(guān)[23-24]。在系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)水平上, 硬骨魚(yú)類(lèi)的精子結(jié)構(gòu)顯示出高度的多樣性。硬骨魚(yú)的精子結(jié)構(gòu)按照受精方式可分為兩類(lèi): 體內(nèi)受精魚(yú)類(lèi), 如杜父魚(yú)科(Cottidae)、海鯽科(Embiotocidae)、花鳉科(Poeciliidae)和體外受精魚(yú)類(lèi), 如鯉科(Cyprinidae)、狼鱸科(Moronidae)、鮭科(Salmonidae); 體內(nèi)受精和體外受精魚(yú)類(lèi)的精子結(jié)構(gòu)不同, 體外受精魚(yú)類(lèi)精子的結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單, 具有卵圓形或球形的核和僅包含少量線粒體的較小的中段, 而體內(nèi)受精的魚(yú)類(lèi)精子具有細(xì)長(zhǎng)的核和相對(duì)較大的中段[5]。精子形態(tài)學(xué)特征研究對(duì)于闡明不同精子結(jié)構(gòu)形式的適應(yīng)性進(jìn)化也具有重要的參考價(jià)值并可以將精子形態(tài)與系統(tǒng)分類(lèi)聯(lián)系起來(lái)[25-29]。

以往的研究結(jié)果揭示了鰻鱺目精子獨(dú)特的超微結(jié)構(gòu), 包括一個(gè)新月形的核、一個(gè)附著在中段的支根、“9+0”型模式的鞭毛, 以及從近端中心粒延伸的條紋(擬鞭毛)[17, 30]。星康吉鰻的精子形態(tài)特征與鰻鱺目其他魚(yú)類(lèi)的比較表明它們?cè)谡w結(jié)構(gòu)上非常相似,不同之處是形態(tài)大小和細(xì)胞器的位置。其他鰻鱺目魚(yú)類(lèi)精子的頭長(zhǎng)大約4～20 μm[31], 表明星康吉鰻精子頭長(zhǎng)(3.33±0.16 μm)相對(duì)較小。星康吉鰻精子頭寬(1.12± 0.13 μm)接近于日本鰻鱺精子頭寬(1.2±0.1 μm)[17],而且星康吉鰻的頭部形狀相比鰻鱺目其他魚(yú)類(lèi)更近似圓形[17, 30]。在哺乳動(dòng)物各分支類(lèi)群雄性動(dòng)物精子頭部、中段和鞭毛的尺寸存在正相關(guān)關(guān)系[29], 但在大西洋鮭()精子頭部長(zhǎng)度和鞭毛長(zhǎng)度是負(fù)相關(guān)關(guān)系[24]。分析已報(bào)到的鰻鱺目魚(yú)類(lèi)精子頭部和鞭毛長(zhǎng)度數(shù)據(jù)(表1), 發(fā)現(xiàn)只有本研究中星康吉鰻和日本鰻鱺[17]精子頭部長(zhǎng)度和鞭毛長(zhǎng)度存在類(lèi)似正相關(guān)關(guān)系。盡管采用切片電鏡觀察的方法很難準(zhǔn)確測(cè)量精子形態(tài)指標(biāo), 但通過(guò)形態(tài)的基本測(cè)量仍可看出鰻鱺目魚(yú)類(lèi)精子的形態(tài)差異。鰻鱺目魚(yú)類(lèi)精子頭部細(xì)長(zhǎng)的新月形與其他目魚(yú)類(lèi)精子頭部近似球形的形態(tài)學(xué)上差異的機(jī)制仍不清楚。通常延長(zhǎng)型的精子頭部是與營(yíng)體內(nèi)受精方式相適應(yīng)的[31]。但是鰻鱺目是營(yíng)體外受精的魚(yú)類(lèi), 所以鰻鱺目魚(yú)類(lèi)精子頭部的奇特形態(tài)的受精生物學(xué)意義無(wú)法用上述理論解釋。我們推測(cè)鰻鱺目精子特殊形狀可能是中性進(jìn)化如遺傳漂變而不是自然選擇產(chǎn)生的。精子頭部形狀對(duì)精子的運(yùn)動(dòng)能力和速率影響較大[22]。但精子頭部尺寸和生物自身基因組大小、染色體數(shù)目無(wú)關(guān), 其決定因素還不明確。章龍珍等[19]報(bào)道了日本鰻鱺正常、成熟精子頭部的形態(tài)為圓形或近似圓形, 不成熟的精子頭部為新月形。因此要進(jìn)一步揭示形態(tài)學(xué)差異的問(wèn)題仍需調(diào)查和研究。魚(yú)類(lèi)精子形態(tài)分析過(guò)程中采用的透射電鏡和掃描電鏡等分析技術(shù), 涉及到精液樣品稀釋溶液固定或涂片/干燥、染色等操作步驟, 盡管采用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)分析流程, 仍可能會(huì)得到一些改變精子形態(tài)的人工制品; 今后研究中需進(jìn)一步采用透射電鏡、掃描電鏡和近年來(lái)新發(fā)展的、在魚(yú)類(lèi)精子形態(tài)研究中可實(shí)際應(yīng)用的精子形態(tài)分析技術(shù)如TruMorph?技術(shù)結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助精子形態(tài)分析[32]對(duì)鰻鱺目魚(yú)類(lèi)精子準(zhǔn)確的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

在日本鰻鱺, 研究表明單一的線粒體位于精子頭部的前端[16, 33]。在本研究, 一個(gè)較大的線粒體位于星康吉鰻精子頭部前端, 這與日本鰻鱺精子線粒體位置的研究結(jié)果一致[16, 20, 33], 以及與鰻鱺目的新澳鰻鱺、大鰻鱺[34]和幾內(nèi)亞副康吉鰻()、小眼蟒鰻()[35]的研究結(jié)果一致。而且, 隸屬于海鰻科的海鰻精子頭部的線粒體位置也是類(lèi)似鰻鱺科[17]。因此, 眾多研究表明單個(gè)線粒體位于精子頭部前端是鰻鱺目精子的共同特征。星康吉鰻精子中段的支根長(zhǎng)約為1.38±0.08 μm, 與日本鰻鱺精子支根長(zhǎng)(1.3±0.1 μm)和歐洲鰻鱺精子支根長(zhǎng)(1.2±0.3 μm)較為相近[17, 30]; 星康吉鰻精子的支根長(zhǎng)度位于鰻鱺目魚(yú)類(lèi)精子支根長(zhǎng)度范圍內(nèi)(表1), 但當(dāng)前有關(guān)精子支根的生理功能仍不清楚。

迄今, 所有分析過(guò)的鰻鱺目魚(yú)類(lèi)精子都有“9+0”型鞭毛模式, 鞭毛缺少中間的一對(duì)中央微管。本研究中星康吉鰻精子的鞭毛也是“9+0”結(jié)構(gòu)。星康吉鰻精子鞭毛長(zhǎng)度(31.16±1.51 μm)與日本鰻鱺精子鞭毛長(zhǎng)度(29±6.9 μm)、大鰻鱺精子鞭毛長(zhǎng)度(28～44 μm)相近[17, 34](表1)。本研究中發(fā)現(xiàn)在星康吉鰻精子頭部有4條從近端中性粒向前方延伸的條紋(擬鞭毛)。有研究表明日本鰻鱺精子近端中心粒的這種延伸條紋(擬鞭毛)在中心粒-鞭毛復(fù)合體與精子頭部的連接中起著穩(wěn)定作用[16, 34, 36]。線粒體在是產(chǎn)生三磷酸腺苷ATP (Adenosine triphosphate, ATP)的主要細(xì)胞器, 而ATP是精子在有氧條件下運(yùn)動(dòng)的能量來(lái)源[37]。ATP通過(guò)精子鞭毛中的ATP酶(動(dòng)力蛋白)水解, 由此釋放出的能量用來(lái)移動(dòng)鞭毛[38]。這種ATP從線粒體到鞭毛的轉(zhuǎn)運(yùn)或是通過(guò)簡(jiǎn)單的擴(kuò)散或主要通過(guò)細(xì)胞生化途徑中的磷酰肌酸穿梭和代謝分室作用進(jìn)行的[39-40]。在大多數(shù)硬骨魚(yú)精子中, 線粒體通常位于靠近鞭毛基部的中段[41-43], 因?yàn)榫嚯x相近, 使這兩種ATP能量傳遞系統(tǒng)都能發(fā)揮功能。但是大多數(shù)鰻鱺目魚(yú)類(lèi)精子線粒體位于精子頭部的前端, 距離鞭毛遠(yuǎn), 因此ATP的運(yùn)輸可能較難用這些運(yùn)輸系統(tǒng)來(lái)解釋。

我們觀察到的星康吉鰻精子條紋結(jié)構(gòu)可能在ATP運(yùn)輸中發(fā)揮作用, 從而為驅(qū)動(dòng)鞭毛運(yùn)動(dòng)提供能量, 與精子在運(yùn)動(dòng)過(guò)程對(duì)較多能量的需求相適應(yīng), 與精子的泳動(dòng)速率有關(guān)。有研究表明鞭毛軸絲動(dòng)力蛋白臂利用ATP能量輔助鞭毛軸絲自旋彎曲[44]。類(lèi)似的條紋在日本鰻鱺精子結(jié)構(gòu)中被認(rèn)為是“管狀結(jié)構(gòu)”, 參與運(yùn)輸ATP[17]。因此, 我們推測(cè)鰻鱺目魚(yú)類(lèi)精子通過(guò)這種管狀結(jié)構(gòu)條紋發(fā)生的ATP轉(zhuǎn)運(yùn)比通過(guò)細(xì)胞質(zhì)更有效。但國(guó)內(nèi)學(xué)者在日本鰻鱺精子結(jié)構(gòu)的研究中沒(méi)發(fā)現(xiàn)精子頭部的這種延伸條紋結(jié)構(gòu)[19-20]。魚(yú)類(lèi)精子線粒體的數(shù)目不一致, 從一個(gè)到幾十個(gè)不等, 如褐石斑魚(yú)()精子中有6～9個(gè)線粒體[45]、秦嶺細(xì)鱗鮭()精子中有1個(gè)線粒體[23]。線粒體作為精子能量的一個(gè)來(lái)源, 線粒體的數(shù)目可能是一個(gè)關(guān)鍵因素影響精子泳動(dòng)速度和時(shí)間, 并在魚(yú)類(lèi)受精過(guò)程起到重要作用[46]。在星康吉鰻繁育試驗(yàn)中, 發(fā)現(xiàn)存在精子活力弱, 受精率低的現(xiàn)象, 可能與精子中只有唯一的線粒體有關(guān)。

在當(dāng)前研究中作者觀察到了星康吉鰻部分精子有盤(pán)繞的鞭毛形態(tài), 推測(cè)這些卷曲的鞭毛可能是不成熟的精子, 因?yàn)檫@種更緊湊的形狀使它們更容易容納在星康吉鰻精巢的有限空間中。有研究表明在部分日本鰻鱺精子鞭毛末端也存在形狀近似的環(huán)狀結(jié)構(gòu), 該結(jié)構(gòu)容易與其他物質(zhì)粘連, 便于完成受精[20]。但在本研究中我們無(wú)法明確這些卷曲鞭毛的發(fā)育機(jī)制及生理作用。在多種魚(yú)類(lèi)精子尾部鞭毛發(fā)現(xiàn)具有側(cè)鰭結(jié)構(gòu), 但星康吉鰻精子尾部無(wú)側(cè)鰭結(jié)構(gòu)。關(guān)于魚(yú)類(lèi)精子鞭毛側(cè)鰭結(jié)構(gòu)能否改善精子游泳速度和提高受精率尚無(wú)定論。通過(guò)上述的比較分析, 星康吉鰻精子結(jié)構(gòu)相對(duì)其他目魚(yú)類(lèi)的精子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單, 有可能作為研究魚(yú)類(lèi)精子超微結(jié)構(gòu)和形態(tài)的理想實(shí)驗(yàn)材料, 筆者認(rèn)為深入解析這些有差異的結(jié)構(gòu)有助于了解這些結(jié)構(gòu)的來(lái)源和進(jìn)化上的意義及其生理作用, 并為提高星康吉鰻精子活力和受精率提供參考。

學(xué)者們一直以來(lái)認(rèn)為鰻鱺目、海鰱目(Elopiformes)、背棘魚(yú)目(Notacanthiformes)屬于同一總目即海鰱總目(Elopomorpha)[47], 該分類(lèi)是界定在魚(yú)類(lèi)解剖學(xué)和骨骼學(xué)特征的基礎(chǔ)上, 并且另一最顯著的特征是都出現(xiàn)了柳葉狀幼體[48]。此外, 精子的主要特征即新月形頭部、一個(gè)支根、“9+0型”模式的鞭毛, 不僅在鰻鱺目中發(fā)現(xiàn), 而且在海鰱目[35]和背棘魚(yú)目[49]中也有發(fā)現(xiàn)。但是有例外, 鰻鱺目中的海鱔科(Muraenidae)的精子有一個(gè)圓形的細(xì)胞核, 細(xì)胞核后方有一些線粒體, 無(wú)支根[50]。MATTEI等[35]指出精子之間的形態(tài)學(xué)特征的相似性可能對(duì)研究海鰱總目魚(yú)類(lèi)的進(jìn)化具有重要意義。JAMIESON[31]隨后將精子的形態(tài)特征研究疊加到海鰱總目魚(yú)類(lèi)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上, 結(jié)果顯示出與之前的分類(lèi)情況有很好的一致性。這些研究發(fā)現(xiàn)表明, 除了傳統(tǒng)的魚(yú)類(lèi)解剖學(xué)和骨骼學(xué)特征指標(biāo)外, 精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征也越來(lái)越多地與海鰱總目魚(yú)類(lèi)的種間分化密切相關(guān)。我們當(dāng)前的分析總結(jié)了多個(gè)鰻鱺目魚(yú)類(lèi)的形態(tài)學(xué)特征研究文獻(xiàn)(包括表1),對(duì)進(jìn)一步研究鰻鱺科魚(yú)類(lèi)或者海鰱總目魚(yú)類(lèi)的進(jìn)化和分類(lèi)學(xué)也具有重要作用。

4 結(jié)論

本研究以黃海海域星康吉鰻精子為研究對(duì)象, 采用掃描電鏡和透射電鏡揭示了星康吉鰻精子超微結(jié)構(gòu)的詳細(xì)特征。星康吉鰻精子由頭部、中段和鞭毛3部分組成, 具有鰻鱺目精子獨(dú)特的超微結(jié)構(gòu)特征。星康吉鰻精子頭部為新月形, 主要由細(xì)胞核構(gòu)成, 無(wú)頂體結(jié)構(gòu); 精子中段伸出一支根, 支根位于精子的中段末端; 精子尾部鞭毛細(xì)長(zhǎng), 鞭毛橫切面呈圓形, 無(wú)側(cè)鰭, 鞭毛的軸絲結(jié)構(gòu)為“9+0”型。星康吉鰻精子超微結(jié)構(gòu)研究增加了我們對(duì)其繁殖生物學(xué)的理解, 并為突破星康吉鰻人工繁育技術(shù)提供了理論參考。

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A study on sperm ultrastructure in the whitespotted conger,

SHI Bao1, WANG Cheng-gang2, TANG Xiao-hua2, ZHAO Xin-yu1, YAN Ke-wen1, MA Xiao-dong1

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071, China; 2. Haiyang Yellow Sea Aquatic Product Co., Ltd., Yantai 265100, China)

Whitespotted conger,, is one of the most valuable fishery resources in the seas around China, Korea, and Japan. Thus, it has become important to protect this species, as the annual commercial catch is decreasing. Despite being an important resource for East Asian countries, little is known about the reproductive biologyof. Therefore, only very limited information is available regarding the reproductive characteristics of male. Teleost sperm is very morphologically diverse, particularly the sperm head shape; the shape, location, and number of mitochondria, and the structure and length of the flagellum. This study investigated the ultrastructure and morphology ofsperm by scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM). The SEM and TEM images revealed that the sperm were composed of a head, a middle piece, and a flagellum..sperm hada unique structure except for the common sperm characteristics of teleost. The total mean length was 35.75±1.15 μm. The head of the spermatozoon was electron-dense and contained chromatin material forming the nucleus. The nucleus was asymmetrically shaped along the longitudinal axis. We observed nuclear vacuoles in the nucleus, which were not fixed in size or position. The head had no acrosomal structure. A single spherical mitochondrion was located along the longitudinal center line of the nucleus but was offset slightly to one side. The mitochondrion was surrounded by an outer mitochondrial membrane. The inner mitochondrial membrane extended inward, forming rich cristae. Ribonucleoprotein and matrix were scattered in the mitochondrion. The mean head length was 3.33±0.16 μm, and the mean head width was 1.12±0.13 μm. Four striae ran from the caudal portion to the cephalad on the convex surface of the head. Additionally, four striae arose from the proximal centriole. The middle piece was constricted and projected a short rootlet located at the end of the middle piece. The mean middle piece length was 0.55±0.05 μm. The mean length of the rootlet was 1.38±0.08 μm, and the mean diameter was 90.48±6.06 nm. The proximal centriole in the middle piece was located near the caudal portion of the sperm head. The distal centriole was located near the flagellum. A cross-section oftheflagellum was thin and appeared round with no side fin. Inner dynein arms were seen on the two subfibrils of each filament on a cross-section of the flagellum, but no outer dynein arms were seen. The two subfibrils of the flagellum near the distal centriole were linked to the plasma membrane by radial Y-shape electron-dense bodies. The flagellum was arranged in a 9+0 axonemal pattern. Some flagella were coiled, but the developmental mechanism was unclear. These flagella were coiled tightly, with about five strata counted from the center to the periphery. The mean flagellum length was 31.16±1.51 μm, and the mean flagellum diameter was 0.17±0.01 μm. These features were seen inand are also evident in other species of Anguilliformes. These findings suggest that these features are common to Anguilliformes. This study revealed the morphological structure of.sperm to improve our understanding of the reproductive biology of.and provide a theoretical basis for developing methods to artificially reproduce..

; sperm; ultrastructure; spermic shape

Dec. 15, 2022

[The Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, YSFRI, CAFS, No. 20603022021004, 20603022023023; Key Research and Development Program of Shandong Province, No. 2021LZGC028; National Key Research and Development Program of China, No. 2019YFD0900503; China Agriculture Research System of MOF and MARA, No. CARS-47]

S962

A

1000-3096(2023)10-0112-09

10.11759/hykx20221215001

2022-12-15;

2023-03-30

中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(20603022021004, 20603022023023); 山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2021LZGC028); 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2019YFD0900503); 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項(xiàng)目(CARS-47)

史寶(1979—), 男, 副研究員, 主要從事海水魚(yú)類(lèi)繁育理論與增養(yǎng)殖技術(shù)研究, E-mail: shibao@ysfri.ac.cn

(本文編輯: 譚雪靜)