郭屹凡，熊林威，張苗爽，李競(jìng)一

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北武漢 430070）

家雞的快慢羽基因是一對(duì)位于Z 染色體上的等位基因，由于其伴性遺傳的特點(diǎn)，可以用于商品雞出雛時(shí)鑒別雌雄，避免通過翻肛的方式來進(jìn)行性別鑒定。翻肛不僅耗時(shí)費(fèi)力，還需要一定的技術(shù)要求和經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)還會(huì)對(duì)幼雛造成應(yīng)激[1]，而快慢羽鑒別雌雄技術(shù)難度較低，所以被廣泛使用。對(duì)于家禽育種工作來說，在慢羽純系的培育過程中，需要使用測(cè)交來區(qū)分慢羽純合子與雜合子公雞，因此，尋找合適的分子檢測(cè)手段來區(qū)分慢羽純合與雜合，不僅可以代替繁瑣的測(cè)交過程，也可以節(jié)約育種的時(shí)間與成本，對(duì)家禽行業(yè)具有重要意義。

2008 年，Elferink 等[2]研究表明，K*K 基因?yàn)閆 染色體上的一大段串聯(lián)重復(fù)，重復(fù)由PRLR 和SPEF2 基因之間的基因間區(qū)、兩個(gè)基因的部分重復(fù)以及其融合基因（dSPEF2-dPRLR）構(gòu)成，白少川等[3]也發(fā)現(xiàn)了PRLR 和dPRLR 分別與dSPEF2和SPEF2 的5’ 末端以“頭碰頭” 方式連接。

Elferink 等[2]最先設(shè)計(jì)了兩種引物用于判斷慢羽雜合與純合基因型，即通過定量檢測(cè)基因組上融合基因dSPEF2/dPRLR 拷貝數(shù)的差異，使用熒光定量PCR 的方法，根據(jù)拷貝數(shù)差異判斷純合型與雜合型。然而此方法雖然理論上能用來判斷慢羽的純合型與雜合型，但并不能保證定量檢測(cè)出來的拷貝數(shù)都為0 或1，往往會(huì)出現(xiàn)0.5 等數(shù)據(jù)難以判斷其基因型，即檢出率不高。羅成龍等[4]利用SNP 數(shù)據(jù)庫中的137 個(gè)SNP 在欣華雞的Z染色體上進(jìn)行了關(guān)聯(lián)研究，其中兩個(gè)SNP（Gal-Gal6，chrZ：10238838bp 和chrZ：11247500bp）與羽毛表型顯著相關(guān)，但并未在其他我國地方雞群體中驗(yàn)證其關(guān)聯(lián)性。2014 年，韓文朋等[5]發(fā)明了一種快慢羽基因型鑒別方法，對(duì)重復(fù)片段下游約390kb 處一個(gè)SNP 位點(diǎn)（GalGal6，chrZ：11139133bp）設(shè)計(jì)了一對(duì)引物進(jìn)行PCR，使用Taq Ⅰ內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，通過檢測(cè)酶切后的片段長度由此判斷基因型，但該方法也未在我國地方雞群體中驗(yàn)證其適用性?？偟膩碚f，現(xiàn)在的快慢羽檢測(cè)方法均有一些缺點(diǎn)，因此，本研究旨在利用公開數(shù)據(jù)庫中全基因組數(shù)據(jù)開發(fā)新的能在全球各品系中準(zhǔn)確區(qū)分快慢羽基因型的檢測(cè)方法。

在本研究中，筆者從全基因組數(shù)據(jù)中尋找出與K*K 或K*N 連鎖程度較高的分子遺傳標(biāo)記，對(duì)篩選出的關(guān)聯(lián)SNP 利用KASP 法在我國地方雞群體中檢測(cè)其基因型與快慢羽的關(guān)聯(lián)性，預(yù)期開發(fā)對(duì)快慢羽基因型進(jìn)行檢測(cè)的新方法，為快慢羽的標(biāo)記輔助選擇提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選擇湖北孝感安陸市欣華生態(tài)畜牧有限公司的496 只蘆花母雞和湖北荊門京山市神地農(nóng)業(yè)科貿(mào)有限公司的179 只黑羽公雞，根據(jù)這些公雞與黑羽母雞隨機(jī)交配的結(jié)果，通過后代雛雞的性別（翻肛鑒別）以及快慢羽表型對(duì)其快慢羽基因型進(jìn)行反推。

1.2 樣品采集

試驗(yàn)使用1.5mL 含檸檬酸鈉抗凝劑的離心管進(jìn)行血樣收集，每只雞使用采血針在翅中采集血液200μL 與15μL 4%濃度的檸檬酸鈉充分混勻后放入冰盒中保存至實(shí)驗(yàn)室。使用DNeasy Blood and Tissue 試劑盒（QIAGEN）提取所需樣本的DNA。

1.3 PCR 基因分型

以提取的DNA 為模板，將配制好的反應(yīng)體系（表1）放入PCR 儀中進(jìn)行反應(yīng)，預(yù)變性94℃5min，第一輪循環(huán)14 次（變性94℃15s，退火68℃15s，且每次循環(huán)溫度降低1℃，延伸72℃30s），第二輪循環(huán)25 次（變性94℃15s，退 火55℃15s，延 伸72℃30s），終延伸72℃5min。體系所用引物見表2。每批次的檢測(cè)均附加慢羽對(duì)照和快羽對(duì)照以及陰性對(duì)照（空白對(duì)照）。反應(yīng)完成后使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察成像。

表1 10μL PCR 體系

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 生物信息學(xué)分析

對(duì)本實(shí)驗(yàn)室前期采集自保種場(chǎng)的20 只洪山雞和19 只鄖陽大雞血樣所提取的DNA 進(jìn)行基因組重測(cè)序，并從NCBI 的SRA 數(shù)據(jù)庫中下載了1136 個(gè)家雞個(gè)體的基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)，所有1175 個(gè)測(cè)序反應(yīng)均使用Illumina 平臺(tái)。對(duì)測(cè)序結(jié)果利用BWA[6]（比對(duì)至GalGal6 參考基因組）、SAMtools[7]、GATK[8]、Lumpy[9]、IGV、VCFtools等軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

使用vcftools 工具合并gatk（SNP）與lumpy（SV）的結(jié)果文件，分為W 染色體上的區(qū)間（4989932～5160560）和Z 染色體上的區(qū)間（10111794～11300060），其中分析的Z 染色體范圍為快慢羽基因上下游共1.2Mb 區(qū)間。

1.4.2 W 與Z 染色體測(cè)序深度比值及性別分析

通過gatk 結(jié)果文件判斷其在上述對(duì)應(yīng)區(qū)間的測(cè)序深度，公雞在W 上的區(qū)段理論測(cè)序深度為0，母雞W 和Z 測(cè)序深度比值理論為1∶1。根據(jù)測(cè)序深度結(jié)果，將W 染色體的測(cè)序深度與W 和Z 染色體測(cè)序深度之和的比值作為判定依據(jù)。如果值小于0.01，判定為公雞；值在0.4～0.6 判定為母雞，刪除比值位于上述區(qū)間外的個(gè)體。

1.4.3 快慢羽關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的篩選

將上一步得到的結(jié)果文件中的純合突變型賦值為1，雜合子賦值為0.5，純合野生型賦值為0，無法判斷的個(gè)體用 “.” 表示。然后使用以下公式計(jì)算得到每個(gè)SNP 的absAFdif（等位基因頻率差異的絕對(duì)值）值=（“快羽母雞+快羽公雞*2” 的基因頻率-“慢羽母雞+慢羽公雞*2” 的基因頻率）。上述公式中，“快羽母雞” “快羽公雞” “慢羽母雞” “慢羽公雞” 被代入對(duì)應(yīng)樣本賦值（1，0.5 或0）進(jìn)行求和作為分子；樣本總數(shù)（同樣是公雞乘以2）減去基因型無法判斷的個(gè)體數(shù)作為分母；兩者相除得到基因頻率；最后通過兩個(gè)基因頻率的相減并取絕對(duì)值得到absAFdif。之所以將公雞乘以2 是因?yàn)楣u的Z 染色體數(shù)量為母雞的2 倍。每個(gè)SNP 位點(diǎn)的absAFdif 為一個(gè)0～1 的值，值越接近1 則該分子標(biāo)記與K 基因關(guān)聯(lián)度越高。

1.4.4 lumpy 基因分型結(jié)果的校正

因?yàn)閘umpy 軟件無法準(zhǔn)確區(qū)分公雞的慢羽純合與雜合，因此，我們使用igv 查看了172 個(gè)個(gè)體的原始bam 文件，以獲得快慢羽重復(fù)片段上下游連接區(qū)域的read 數(shù)量，K*K 純合子個(gè)體的read比對(duì)到參考基因組上時(shí)，來自重復(fù)片段中間接頭的read 跟重復(fù)片段上游接頭和下游接頭的read 三者的理論比例是1∶1∶1，所以中間read 與上下游read 的比例應(yīng)為1∶2。對(duì)于雜合子來說這個(gè)比例為1∶4。當(dāng)比值在1∶2.5～1∶3.5 時(shí)無法準(zhǔn)確判斷其基因型，將其排除。

1.4.5 測(cè)序深度質(zhì)控

在上述lumpy 基因分型結(jié)果校正過程中，我們發(fā)現(xiàn)51 個(gè)lumpy 結(jié)果顯示為快羽公雞中有8個(gè)樣本含有重復(fù)片段，即lumpy 判斷的結(jié)果存在誤差，我們懷疑這些誤差可能與測(cè)序深度較低有關(guān)，于是我們?nèi)コ藴y(cè)序深度低于5 的個(gè)體。

1.5 KASP 基因分型

根據(jù)LGC Genomics 公司開發(fā)的KASP 基因分型技術(shù)[10]，按表3 配制好體系后置于CFX384實(shí)時(shí)定量PCR 儀中進(jìn)行反應(yīng)，預(yù)變性94℃15min，第一輪循環(huán)9 次（變性94℃20s，退火延伸61℃60s，且每次循環(huán)退火溫度降低1℃），第二輪循環(huán)25 次（變性94℃20s，退火延伸55℃60s），終延伸72℃60s，然后儀器記錄熒光量，每個(gè)樣本設(shè)置兩個(gè)重復(fù)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果篩選出來的KASP 引物見表4。

表4 針對(duì)兩個(gè)候選快慢羽關(guān)聯(lián)SNP 的KASP基因分型引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 基因分型結(jié)果

結(jié)合179 只公雞的血樣提取DNA 后進(jìn)行PCR 基因分型得到的凝膠電泳成像結(jié)果以及后代反推的基因型結(jié)果，得到互相吻合的慢羽純合32個(gè)，慢羽雜合89 個(gè)，快羽31 個(gè)，共142 個(gè)。496 只母雞的血樣提取DNA 后進(jìn)行PCR 基因分型得到凝膠電泳成像結(jié)果，其中慢羽189 個(gè)，快羽274 個(gè)，無結(jié)果33 個(gè)。

2.2 全基因組數(shù)據(jù)分析

共選用1175 個(gè)個(gè)體，排除216 個(gè)個(gè)體（9 個(gè)無法判斷性別的個(gè)體，185 個(gè)測(cè)序深度低于閾值的個(gè)體以及26 個(gè)無法判斷基因型的個(gè)體）后，剩余357 個(gè)快羽母雞個(gè)體，414 個(gè)慢羽母雞個(gè)體，80 個(gè)快羽公雞個(gè)體，107 個(gè)慢羽公雞個(gè)體，在重復(fù)片段上游500kb 到重復(fù)片段下游500kb 的區(qū)間內(nèi)篩選出的12079 個(gè)分子標(biāo)記。

在獲得基因分型結(jié)果后我們沒有對(duì)全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行filter，目的是保證關(guān)聯(lián)程度較高的突變不會(huì)因?yàn)橘|(zhì)控被篩除掉，但由圖1 可知，雖然排名前三個(gè)體（灰色部分）的absAFdif 值更高，但其錯(cuò)誤率高達(dá)98%以上，即幾乎所有樣本都無法獲得該位點(diǎn)的基因型，所以我們將它們排除掉，選擇了圖1 亮黃色部分absAFdif 值的8 個(gè)SNP 作為最初候選標(biāo)記。在本研究的地方雞群體中對(duì)這些候選標(biāo)記進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)后，最終確定了2 個(gè)SNP位點(diǎn)作為候選分子標(biāo)記（圖1 亮黃色部分中absAFdif 值排名第1 和第3，均位于K*K 重復(fù)片段的內(nèi)部，以下簡稱為SNP1 與SNP3）。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，由于這兩個(gè)SNP 在母雞群體中沒有多態(tài)性，所以后續(xù)研究僅針對(duì)公雞樣本。

圖1 959 個(gè)個(gè)體重測(cè)序數(shù)據(jù)的Z 染色體基因型分析結(jié)果與分析

2.3 KASP 基因分型結(jié)果

由圖2 結(jié)果可知，SNP1 位點(diǎn)（chrZ：10706144bp）的KASP 結(jié)果相較于SNP3 位點(diǎn)（chrZ：10706643bp），其區(qū)域分離更為明顯，檢出率更高，重復(fù)性更好，然后我們將其中部分樣本進(jìn)行校準(zhǔn)后得到結(jié)果見圖2b。

圖2 針對(duì)兩個(gè)候選快慢羽關(guān)聯(lián)SNP 的KASP基因分型結(jié)果

2.4 KASP 基因分型結(jié)果準(zhǔn)確性的驗(yàn)證

此次KASP 共檢測(cè)了142 個(gè)個(gè)體，篩除無法判定（undifined）個(gè)體和無結(jié)果（no call）個(gè)體，獲得了確定基因型結(jié)果的有129 個(gè)，檢出率為91%。其中結(jié)果與已知快慢羽基因型相匹配的個(gè)體有100 個(gè)（77.52%），即利用SNP1。根據(jù)測(cè)交結(jié)果把142 個(gè)公雞個(gè)體分為3 類，其中18 個(gè)快羽純合個(gè)體有15 個(gè)吻合，其余3 個(gè)的KASP 結(jié)果為雜合子，準(zhǔn)確率83.3%；其中30 個(gè)慢羽純合個(gè)體有21 個(gè)吻合，其余2 個(gè)的KASP 結(jié)果為快羽純合子、7 個(gè)為雜合子，準(zhǔn)確率為70%；其中81 個(gè)雜合子個(gè)體有64 個(gè)吻合，其余6 個(gè)的KASP 結(jié)果為快羽純合子、11 個(gè)為慢羽純合子，準(zhǔn)確率為79%。

3 討論

我們從1.19Mb 的區(qū)間中找到了12079 個(gè)突變，由于結(jié)合了gatk 和lumpy 軟件的結(jié)果，且沒有使用任何針對(duì)突變的質(zhì)控手段，所以理論上應(yīng)該包含該區(qū)間內(nèi)所有可能的突變（在一千多個(gè)世界主流的蛋雞、肉雞、地方雞、觀賞雞、紅原雞范圍內(nèi)）。而且為了提高結(jié)果的可信度，將性別判斷、快慢羽基因型判斷可靠度不高以及測(cè)序深度不高的個(gè)體盡量排除。但結(jié)果顯示，關(guān)聯(lián)度最高的突變僅為0.68（即SNP1，位于重復(fù)片段內(nèi)部），筆者嘗試從進(jìn)化的角度解釋慢羽突變與周圍突變關(guān)聯(lián)度不高的原因，上述所有突變可被分為兩類，一是位于重復(fù)片段外部，二是位于重復(fù)片段內(nèi)部。前者可能在K*K 突變形成之初與K*K緊密關(guān)聯(lián)，但由于K*K 在全球范圍內(nèi)的廣泛應(yīng)用，通過大量重組事件的積累，以至于我們檢測(cè)不到緊密關(guān)聯(lián)的突變。而重復(fù)片段內(nèi)部的突變可能也會(huì)受重組的影響，即K*K 其中某一個(gè)拷貝與K*N 之間的重組，從而使K*K 的兩個(gè)拷貝之間存在多態(tài)性，關(guān)聯(lián)程度降低，如ev21 插入僅存在于其中一個(gè)拷貝[11]；也可能在K*K 突變形成之初，這兩個(gè)拷貝就存在著多態(tài)性，即K*K 的串聯(lián)重復(fù)片段來自于非同源的片段插入而不是同一拷貝的重復(fù)，一個(gè)相關(guān)的線索來自于轉(zhuǎn)座子的插入可能引起基因組的重復(fù)[12]，這意味著可能是ev21 的插入引起的K*K 重復(fù)片段，而不是反過來。如果K*K 內(nèi)部發(fā)生過重組，則可以對(duì)兩個(gè)拷貝內(nèi)部的突變分別進(jìn)行分析，以找到重組發(fā)生的位置，有助于我們篩選可用的分子標(biāo)記。但在二代測(cè)序的數(shù)據(jù)中難以區(qū)分重復(fù)片段內(nèi)的突變來自于兩個(gè)拷貝的哪一個(gè)，長讀長測(cè)序技術(shù)可能解決該問題。還有一種可能，K*K 突變是多來源的，該突變并不一定只發(fā)生了一次，這樣所有K*K 等位基因之間一開始就充斥著多態(tài)性。

距離慢羽基因被第一次報(bào)道已經(jīng)超過了100年[13]，恐難以再對(duì)K*K 形成之初的情景進(jìn)行還原。但本研究結(jié)果至少說明了在K*K 重復(fù)片段的內(nèi)部和周圍，在全球各種快慢羽品系中都與之緊密關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記是不存在的，下一步需要在更小范圍的樣本中搜索可用的分子標(biāo)記，如我國的黃羽肉雞、優(yōu)質(zhì)蛋雞等。如本研究在2 個(gè)不同品種的我國地方雞群體（179 只公雞與496 只母雞）驗(yàn)證了數(shù)個(gè)SNP，其與快慢羽的關(guān)聯(lián)程度都不是太高。但不排除其實(shí)在各自群體中存在連鎖程度很高的突變，只能通過對(duì)該品種內(nèi)（而不是中外各個(gè)雞種）進(jìn)行基因組層面的篩選才能發(fā)現(xiàn)。本研究計(jì)算了羅成龍等[4]和韓文朋等[5]在各自實(shí)驗(yàn)群體中檢測(cè)出來快慢羽關(guān)聯(lián)SNP 在本研究中959 個(gè)全基因組測(cè)序樣本中的absAFdif 值，分別為0.086774（galGal6，chrZ：10238838bp），0.294473（galGal6，chrZ：11247500bp）和0.336827（gal-Gal6，chrZ：11139133bp），雖然這些SNP 的absAFdif 值不高，但這些研究利用上述SNP 在各自群體中檢測(cè)快慢羽基因型的結(jié)果都較為準(zhǔn)確，意味著需要在親緣關(guān)系較近的群體內(nèi)部搜索關(guān)聯(lián)程度高的突變。從進(jìn)化角度講可能性是很高的，因?yàn)橥粋€(gè)品種內(nèi)的所有K*K 等位基因的共同祖先可能并不是那么久遠(yuǎn)，也就是說重組事件發(fā)生的相對(duì)較少，如可能是數(shù)十年前由某個(gè)國外品種導(dǎo)入了慢羽基因，因?yàn)閲怆u種對(duì)我國本地雞種基因滲入的事件常有發(fā)生[14]。

本研究的KASP 結(jié)果顯示，利用SNP1 檢測(cè)公雞快慢羽基因型的準(zhǔn)確率為77.52%，而具體來看，對(duì)快羽純合個(gè)體檢測(cè)的準(zhǔn)確率較高，而對(duì)慢羽雜合和慢羽純合的檢測(cè)準(zhǔn)確率略低。后者正是實(shí)際育種工作中需要的準(zhǔn)確率，因此，該SNP 尚不能滿足實(shí)際生產(chǎn)需要。但本研究所采用的KASP 基因分型新方法確實(shí)具有耗時(shí)短、通量大、檢出率高等優(yōu)點(diǎn)。

總的來說，本研究通過前沿的基因組與生物信息技術(shù)，以及充分利用共享資源數(shù)據(jù)、新興檢測(cè)技術(shù)來服務(wù)育種實(shí)踐思路具有廣闊的前景，也響應(yīng)了習(xí)總書記對(duì) “解決農(nóng)業(yè) ‘卡脖子’ 問題”的號(hào)召，并加快實(shí)施農(nóng)業(yè)生物育種科技項(xiàng)目，早日實(shí)現(xiàn)重要農(nóng)產(chǎn)品的種源自主可控。

4 結(jié)論

本研究對(duì)1175 個(gè)樣本進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得超過1.2 萬個(gè)突變位點(diǎn)，并從中篩選出與重復(fù)片段關(guān)聯(lián)程度最高的8 個(gè)SNP 位點(diǎn)，進(jìn)一步通過預(yù)試驗(yàn)確定了2 個(gè)檢測(cè)效果最理想的SNP 位點(diǎn)后，通過142 羽公雞樣本得到1 個(gè)效果最好的分子標(biāo)記SNP 位點(diǎn)（位于Z 染色體10706144bp處）。與這些公雞的測(cè)交結(jié)果相比，基因型吻合的個(gè)體比率為77.5%。該準(zhǔn)確率距離實(shí)際育種工作中的要求還有一定差距，我們將繼續(xù)改進(jìn)分子標(biāo)記的篩選范圍，從而尋找到品種特異的更合適的分子標(biāo)記。