許 靜，張 霞，劉志朋，王淑燕，李洪林，李小偉，王 配*，霍金龍*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2.呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西 呂梁 033001）

DAZL（Deleted in Azoospermia Like，類無(wú)精癥缺失）基因在雄性生殖細(xì)胞的增殖、發(fā)育、成熟以及精子發(fā)生中發(fā)揮重要功能[1]，它是DAZ基因家族的重要成員，該家族基因編碼具有RNA結(jié)合基序和DAZ重復(fù)序列的蛋白質(zhì)，且都在哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞中特異性表達(dá)[2-3]。DAZL的表達(dá)是脊椎動(dòng)物生殖細(xì)胞發(fā)育和分化的標(biāo)志[4]，且在兩性配子發(fā)生中都必須[5]。DAZL幾乎在雄性動(dòng)物精子發(fā)生整個(gè)過(guò)程均有表達(dá)[2]，在原始生殖細(xì)胞的發(fā)育和遷移、精原細(xì)胞分化以及減數(shù)分裂的開(kāi)始和進(jìn)行過(guò)程中都發(fā)揮重要作用[6]。DAZL 還是精子發(fā)生所必需的主要翻譯調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)調(diào)節(jié)對(duì)精子發(fā)生各階段重要靶轉(zhuǎn)錄物蛋白的表達(dá)來(lái)促進(jìn)精子發(fā)生[4]。DAZL的缺失或突變會(huì)使雄性動(dòng)物生殖細(xì)胞逐漸喪失、聯(lián)會(huì)失敗、減數(shù)分裂停滯等[4,7-8]，從而導(dǎo)致不育。另外，有研究表明DAZL基因啟動(dòng)子DNA甲基化模式的改變與雄性精子缺陷有關(guān)[9]。

版納微型豬近交系（Banna mini-pig inbred line,BMI）是具有高純合基因和明確遺傳背景的大型哺乳動(dòng)物近交系，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域[10-11]。我們先前已證明DAZL在BMI 成年豬的睪丸組織中特異性表達(dá)，并在豬睪丸細(xì)胞(ST)的細(xì)胞核中發(fā)揮重要功能[12]。本研究克隆獲得DAZL啟動(dòng)子序列，獲悉其CpG 島、核心啟動(dòng)子區(qū)域及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得DAZL在BMI 睪丸中的表達(dá)量，注釋DAZL基因并了解其重要功能，構(gòu)建DAZL的ceRNA 轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并分析其表達(dá)調(diào)控；分析各物種DAZL及其相鄰基因獲悉保守同源性，構(gòu)建DAZL 的互作蛋白網(wǎng)絡(luò)并分析各蛋白的作用。研究結(jié)果可為深入探索DAZL在精子發(fā)生過(guò)程中的重要功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用4頭來(lái)自版納微型豬近交系昆明原種豬場(chǎng)的12月齡成年BMI 公豬，活體去勢(shì)取睪丸組織樣品。

1.2 DAZL啟動(dòng)子克隆及分析

在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索豬DAZL基因5'端側(cè)翼區(qū)序列；使用Prime3 PLUS 篩選長(zhǎng)度17～25 bp、GC 含量40%～60%、Tm值60～65 ℃、ATCG 分布均勻的一對(duì)引物（F：CCTGAGTTTCCGCACATGACAC；R：CTCCACTCACCATTACTGCGACA），由昆明擎科生物科技有限公司合成。以提取的BMI 基因組DNA為模板，PCR 擴(kuò)增DAZL啟動(dòng)子序列。隨后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并使用TaKaRa 膠回收試劑盒回收片段并送昆明擎科生物科技有限公司測(cè)序。利用BDGP 的Neural Network Promoter Prediction（https://fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）工具查詢DAZL基因的核心啟動(dòng)子區(qū)，MethPrimer 工具（www.urogene.org/methprimer）查詢CpG 島，AliBaba2.1（generegulation.com/pub/programs/Alibaba2/index.html）工具查詢轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及DAZL基因表達(dá)量分析

提取BMI 睪丸組織RNA 進(jìn)行建庫(kù)，使用Illumina Hiseq 4000 和Illumina novaseq 6000 平臺(tái)分別進(jìn)行RNA-seq和small RNA測(cè)序。利用Fastp軟件對(duì)獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量分析，隨后采用bowtie2-2.1.0 軟件將處理后的RNA-seq 數(shù)據(jù)與豬核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)以及豬參考基因組（Sus scrofa 11.1）比對(duì)。使用featureCounts[13]和salmon[14]計(jì)算DAZL基因的原始表達(dá)量和矯正表達(dá)量。使用bowtie2[15]軟件去除質(zhì)控后small RNA 數(shù)據(jù)中的rRNA、tRNA、snRNA 和snoRNA，將剩余數(shù)據(jù)與miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中每一個(gè)物種的miRNA序列比對(duì)，從而得到miRNA的表達(dá)量。

1.4 DAZL轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)豬DAZL進(jìn)行功能注釋，使用所測(cè)RNA-seq數(shù)據(jù)分析miRNA和lncRNA的表達(dá)量，用miRanda（hhttp://www.mirbase.org）和RNAhybrid2.1.2（https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/submission.html）網(wǎng)站分析調(diào)控DAZL的miRNA 和lncRNA，使用Cytoscape 3.9.1[16]將高表達(dá)的miRNA和lncRNA可視化。

1.5 DAZL及其鄰近基因的保守同源性分析

利用MegAlign軟件對(duì)多物種DAZL氨基酸序列進(jìn)行相似度分析并用R中的ggplot2包進(jìn)行可視化，利用WebLoge網(wǎng)站分析DAZL結(jié)構(gòu)域在各物種中的保守性，利用Genomicus-99.01 網(wǎng)站分析DAZL鄰近基因組區(qū)域的保守性及同源性。

1.6 DAZL互作蛋白分析

利用String v11.0b 進(jìn)行互作蛋白分析，并用Cytoscape 3.9.1 可視化。利用R 中clusterProfiler 包將互作蛋白進(jìn)行GO和KEGG富集分析，并用ggplot2包可視化。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析DAZL與這些蛋白編碼基因之間的表達(dá)量相關(guān)性，并用R 中circlize 包進(jìn)行結(jié)果可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 DAZL啟動(dòng)子序列分析

以BMI 基因組DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增獲得DAZL基因5'側(cè)翼區(qū)長(zhǎng)度為2 378 bp 的啟動(dòng)子區(qū)域（圖1A）。利用MethPrimer 分析發(fā)現(xiàn)，在DAZL基因5'側(cè)翼區(qū)-1 932～-2 272 bp 區(qū)存在一個(gè)長(zhǎng)度為341 bp 的CpG 島（圖1B），其GC 百分比大于50%。核心啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)，序列中存在3 個(gè)核心啟動(dòng)子（圖1C 紅色部分），其可信度分別為97%、98%和99%；轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，啟動(dòng)子區(qū)序列上存在Oct-1、HSE-bind、Pit-1a、GCN4、c-Rel、NF-kappa、Sp1、IRF-1、YY1和Krox-20等10種轉(zhuǎn)錄因子的潛在結(jié)合位點(diǎn)，其中Sp1結(jié)合位點(diǎn)有5個(gè)（圖1C藍(lán)色部分）。

圖1 DAZL啟動(dòng)子序列克隆與分析Figure 1 Cloning and analysis of DAZL promoter sequence

2.2 DAZL基因表達(dá)

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明，DAZL基因在BMI睪丸組織樣品中的原始平均表達(dá)量為898.67，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步矯正后的平均表達(dá)量（TPM）為653.50，其轉(zhuǎn)錄本與Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中的DAZL轉(zhuǎn)錄本ENSSSCT00000078185相一致，定位在豬13 號(hào)染色體。DAZL基因在4 個(gè)BMI睪丸組織樣品中均具有較高的正表達(dá)（圖2）。

圖2 DAZL所處染色體位置，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的外顯子、內(nèi)含子豐度分析Figure 2 Chromosome location,abundance of exons and introns of DAZL based on transcriptome sequencing

2.3 DAZL功能注釋及ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

功能注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DAZL共參與15 個(gè)GO：其中生物學(xué)過(guò)程（Biological process）主要包括翻譯啟動(dòng)的正向調(diào)控（GO:0045948-positive regulation of translational initiation）、3'-UTR 介導(dǎo)的mRNA 穩(wěn)定（GO:0070935-3'-UTR-mediated mRNA stabilization）、生殖細(xì)胞發(fā)育（GO:0007281-germ cell development）、細(xì)胞分化（GO:0030154-cell differentiation）、翻譯調(diào)控（GO:0006417-regulation of translation）和精子發(fā)生（GO:0007283-spermatogenesis）等6 個(gè)GO；細(xì)胞組分（Cellular component）主要包括細(xì)胞質(zhì)（GO:0005737-cytoplasm）、細(xì)胞核（GO:0005634-nucleus）和蛋白質(zhì)復(fù)合物（GO:0032991-protein-containing complex）等3 個(gè)GO；分子功能（Molecular function）主要包括翻譯激活活動(dòng)（GO:0008494-translation activator activity）、mRNA 3'-UTR 結(jié)合（GO:0003730-mRNA 3'-UTR binding）、核酸結(jié)合（GO:0003676-nucleic acid binding）、RNA 結(jié)合（GO:0003723-RNA binding）、mRNA 結(jié)合（GO:0003729-mRNA binding）、蛋白結(jié)合（GO:0005515-protein binding）等6 個(gè)GO（圖3）。

圖3 DAZL的功能注釋及ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Figure 3 Functional annotation and ceRNA regulatory network of DAZL

ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖顯示，BMIDAZL受ssc-miR-199a-5p、ssc-miR-199b-5p、ssc-miR-17-5p、sscmiR-103、ssc-miR-24-3p 和ssc-miR-107 等6 個(gè)miRNAs 靶向調(diào)控（圖3）。其中有多個(gè)lncRNA 與DAZL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合其對(duì)應(yīng)的miRNA。

2.4 DAZL 氨基酸序列相似度分析及DAZL 鄰近基因保守性分析

BMI DAZL 與其他9 個(gè)哺乳動(dòng)物的氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)它們的相似度均超過(guò)90%，其中與貓（XP_006936507）、狗（XP_025304761）、驢（XP_014697651）、馬（XP_005600968）的相似度高達(dá)到97%以上（圖4A），WebLoge 圖顯示結(jié)構(gòu)域RRM_DAZL 在各物種中較為保守（圖4B），說(shuō)明DAZL 在各物種中具有較高的保守性和序列同源性。對(duì)各物種基因組中的DAZL相鄰基因進(jìn)行同基因分析（圖4C），結(jié)果表明雖然不同物種的DAZL位于不同染色體，但是豬與其他哺乳動(dòng)物都具有較高保守的相鄰基因，尤其與偶蹄目動(dòng)物（山羊、綿羊、駱駝）的相鄰基因以高度保守的方式分布。

圖4 DAZL氨基酸及其鄰近基因的保守性分析Figure 4 Conservation analysis of DAZL and its neighboring genes

2.5 DAZL蛋白互作分析

蛋白互作分析顯示DAZL與多種蛋白相互作用（圖5A），互作緊密程度從高至低分別為PUM2、DAZAP2、SYCE1、SYCE2、PUM1、DDX4、NANOS3、DND1、STRA8 和PABPC1L 等。將這些蛋白進(jìn)行KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，主要參與細(xì)胞過(guò)程（cellular processes）、人類疾?。╤uman diseases）、有機(jī)系統(tǒng)（organismal systems）和環(huán)境信息處理（environmental information processing）等。其中包括調(diào)控干細(xì)胞多能性的信號(hào)通路（ssc04550：signaling pathways regulating pluripotency of stem cells）、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂（ssc04114：oocyte meiosis）、脊髓小腦的共濟(jì)失調(diào)（ssc05017：spinocerebellar ataxia)、癌癥蛋白聚糖（ssc05205：proteoglycans in cancer）、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體的相互作用（ssc04060：cytokine-cytokine receptor interaction）等通路（圖5B）；GO 富集分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要參與有性生殖（sexual reproduction）、精子發(fā)生（spermatogenesis）、卵子發(fā)生（oogenesis）、超分子復(fù)合物（supramolecular complex）、mRNA 結(jié)合（mRNA binding）和RNA 結(jié)合（RNA binding）等條目（圖5C）。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析DAZL與這些蛋白編碼基因之間的表達(dá)量相關(guān)性，結(jié)果顯示在BMI 睪丸組織中，DAZL的表達(dá)量與SOHLH1顯著相關(guān)（圖5D）。

3 討論與結(jié)論

本研究以BMI基因組DNA為模板擴(kuò)增了DAZL基因5'側(cè)翼區(qū)長(zhǎng)2 378 bp 的啟動(dòng)子序列，包括3 個(gè)核心啟動(dòng)子以及10 種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。研究表明哺乳動(dòng)物中大約60%的啟動(dòng)子與CpG 島共定位[17]，而CpG 二核苷酸上的胞嘧啶甲基化是真核生物中必不可少的表觀遺傳修飾[18]。DAZL基因5'端上游-1 932～-2 272 bp 啟動(dòng)子序列存在一個(gè)CpG島，該CpG島可能參與了DAZL的表觀調(diào)控。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得睪丸中DAZL基因原始及矯正后的平均表達(dá)量，DAZL基因的轉(zhuǎn)錄本與Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中DAZL的ENSSSCT00000078185轉(zhuǎn)錄本一致，且DAZL在BMI睪丸組織樣品中高度表達(dá)。氨基酸序列相似性分析顯示豬DAZL 與其他9個(gè)物種的相似度均大于90%，保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)該RRM_DAZL結(jié)構(gòu)域在各物種間十分保守，說(shuō)明BMI DAZL在各物種世代演化的進(jìn)程中具有較高的保守性以及序列同源性。對(duì)各物種基因組中的DAZL相鄰基因分析表明，雖然不同物種的DAZL位于不同染色體，但是都具有較高保守的相鄰基因，尤其與山羊、綿羊及駱駝的相鄰基因以高度保守的方式分布。

功能注釋結(jié)果表明DAZL主要參與翻譯啟動(dòng)的正向調(diào)控、蛋白結(jié)合、RNA 結(jié)合、mRNA 結(jié)合、細(xì)胞分化、翻譯調(diào)控和精子發(fā)生等。靶基因預(yù)測(cè)表明DAZL被ssc-miR-103、ssc-miR-107、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-199a-5p、ssc-miR-199b-5p 和ssc-miR-24-3p靶向調(diào)控，這些miRNAs參與了豬精子發(fā)生、結(jié)構(gòu)完整性、運(yùn)動(dòng)性和代謝等過(guò)程[19]。其中ssc-miR-103參與豬的多種生物學(xué)過(guò)程，包括大腦發(fā)育、脂質(zhì)代謝、脂肪細(xì)胞分化、造血和免疫[20]。ssc-miR-107 參與有性生殖、雄性配子生成、精子發(fā)生及GnRH、Wnt和MAPK信號(hào)通路[21]。miR-17-5p在睪丸早期精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中表達(dá)最低，隨生殖細(xì)胞的成熟表達(dá)不斷增高，并在精子發(fā)生中起重要作用[22]。sscmiR-199a-5p 和ssc-miR-199b-5p 可影響豬的胚胎著床[23]。ssc-miR-24-3p 在豬精子和精漿中表達(dá)豐富，并在精子和精漿之間穿梭，與精子運(yùn)動(dòng)功能有關(guān)[24]。這6個(gè)重要的miRNAs可為深入研究DAZL在豬生殖方面的調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)和方向。

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析顯示DAZL與PUM2、DAZAP2、SYCE1、SYCE2、PUM1、DDX4、NANOS3、DND1、STRA8 和PABPC1L 等多個(gè)蛋白相互作用。這些蛋白幾乎都在與精子發(fā)生相關(guān)的細(xì)胞中表達(dá)，并在精子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用[25-34]。其中SYCE1 和SOHLH1 還與生育能力有關(guān)，其突變導(dǎo)致兩性或雄性不育[35-36]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)和蛋白編碼基因的表達(dá)量相關(guān)性分析表明，在BMI 睪丸組織中，DAZL的表達(dá)量與SOHLH1顯著相關(guān)，為SOHLH1和DAZL的進(jìn)一步互作研究指明了方向。上述互作蛋白的GO和KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白主要參與精子發(fā)生、卵子發(fā)生、有性生殖等重要生殖相關(guān)通路，為深入研究DAZL在BMI中的功能奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究克隆了豬DAZL基因的啟動(dòng)子序列并分析了其結(jié)構(gòu)特征；獲得DAZL在睪丸組織中的表達(dá)量；注釋基因功能，并構(gòu)建了ceRNA 轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；比對(duì)各物種DAZL氨基酸序列及DAZL鄰近基因，解釋了其保守同源性；分析蛋白功能，并構(gòu)建了蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。研究結(jié)果為后期深入研究DAZL在BMI 精子發(fā)生過(guò)程中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。