蘇 欣，朱 彤，許曉寒思，黃江建，蘇會嵐，李 娜

（成都醫(yī)學院 公共衛(wèi)生學院，四川 成都 610000）

0 引 言

外泌體（exosomes）是細胞膜向外釋放的杯狀脂雙層膜小泡（直徑30～150 nm）［1，2］。最早由Pan B T［3］和Johnston R M［4］在綿羊網(wǎng)織紅細胞中發(fā)現(xiàn)并命名。外泌體廣泛存在于各種體液及細胞培養(yǎng)液中，如尿液、血液、母乳、腦脊液、唾液、膽汁、腹水、眼淚、精液和羊水［5］。部分外泌體已被證明其性質類似于或反映了其母體來源［6］。因此，外泌體檢測對腫瘤早期診斷、治療及預后有著重要作用。

適配體（aptamer，Apt）是一種短的單鏈DNA或RNA分子，通過稱為配體指數(shù)級進化富集（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）過程獲得并濃縮［6，7］，能以高親和力和特異性識別靶標，被稱為“化學抗體”。適配體存在可快速、重復合成、易修飾、長期穩(wěn)定等特點，較易與基于核酸的檢測技術相結合。利用適配體作為傳感材料的生物傳感器，即適配體傳感器（aptasensor），在醫(yī)療和環(huán)境檢測等領域發(fā)揮著重要作用。

本文主要介紹現(xiàn)階段適配體篩選技術以及基于外泌體的適配體傳感器的構建及應用，并討論基于外泌體的適配體在目前臨床環(huán)境應用中的局限性。

1 適配體篩選技術

傳統(tǒng)SELEX是一種體外篩選核酸適配體的基本技術，1990年由Tuerk C和Gold L［7］以及Ellington A D和Szostak J W［8］的2個實驗室獨立開發(fā)。其原理是構建一個大容量的可包含多達60個隨機堿基的單鏈寡核苷酸文庫，其兩側是短恒定區(qū)，通常用于在聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）過程中退火延伸引物。反復進行多輪篩選，最后得到與靶標高特異性、高親和力結合的核酸適配體，對潛在適配體進行測序，并評估其結合動力學。使用SELEX技術，可以從核酸文庫中分離出對各種靶標具有高特異性和親和力的適配體。傳統(tǒng)SELEX 是一種成熟、有效的方法，但由于其耗時耗力，更新適配體的篩選技術是不可避免的。下面介紹幾種常用的適配體篩選技術。

1.1 磁珠-SELEX

1997年，Broun J G 等人［9］發(fā)表了一種利用磁珠（magnetic bead，MB）固定靶標的SELEX 方法。在此方法中，靶標被固定在磁珠上，與寡核苷酸文庫一起孵育，產生靶標-適配體復合物，通過磁性分離器與未結合的寡核苷酸分離?；诖判苑蛛x原理，Stoltenburg R等人［10］于2005 年發(fā)表了一種更方便、更容易的FluMag-SELEX 方法，以及通過固定DNA文庫而建立的捕獲-SELEX（Capture-SELEX）方法［11］。Song Z 等人［12］通過使用基于磁珠的競爭性SELEX（MBSELEX）和引入0.5 mol／L氯化鈉（NaCl）作為洗脫緩沖液，篩選出2種外泌體蛋白CD63高親和力和特異性的DNA適配體（CD63-1 和CD63-2）（Kd 分 別 為38.71 nmol／L 和78.43 nmol／L）。

1.2 氧化石墨烯-SELEX

將靶標結合的單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA）與非結合的ssDNA分離是成功篩選適配體的關鍵步驟。當涉及到小分子時，通常意味著對靶標進行化學修飾，然后固定在磁珠或瓊脂糖珠等基質上［13，14］。但這種化學修飾可能改變靶標的固有結構，導致所選適配體的親和力降低。

因此，出現(xiàn)不固定靶標的適配體篩選技術，Park J W等人［15］于2012年利用氧化石墨烯（graphene oxide，GO）與ss-DNA的π-π堆積作用，將GO作為結合ssDNA與分離的介質，利用SELEX建立了GO-SELEX。首次實現(xiàn)了最具成本效益、簡化、快速和無固定化的SELEX。GO-SELEX 只需少于5輪SELEX便可獲得具有高親和力和特異性的適配體。更重要的是，可減少靶標的數(shù)量。Nguyen V T等人［16］同樣利用GO 構建了multi-GO-SELEX。GO-SELEX 和multi-GO SELEX利用ssDNA吸附在GO上的特性將未結合的ssDNA從結合目標的ssDNA中分離出來。

1.3 毛細管電泳-SELEX

毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）-SELEX 是最常用的SELEX方法之一，首次發(fā)表于2004 年［17］。這種方法將適配體篩選的循環(huán)數(shù)從常規(guī)篩選的20 個循環(huán)減少到4個循環(huán)，保持適配體與靶標的高親和力。該方法是根據(jù)電泳遷移率將適配體-靶標復合物與未結合的寡核苷酸分離開來，與靶標結合的寡核苷酸比游離寡核苷酸具有更低的遷移率。這種方法篩選快速，只需要1～4輪篩選，且不需要固定靶標，減少了非特異性結合。但僅限于針對高分子量靶標的篩選，不適用于小分子的適配體篩選。

1.4 細胞-SELEX

與MB-SELEX 與CE-SELEX 方法不同的是，基于細胞的SELEX（Cell-SELEX）［18］的靶標是完整細胞。與傳統(tǒng)SELEX一樣，寡核苷酸文庫與靶標一起孵育。洗去未結合的寡核苷酸，從靶標中分離適配體，進行PCR 擴增。Cell-SELEX最常見的是8～10個循環(huán)，也可高達35 個循環(huán)，以獲得高親和力的適配體。這種方法適用于細胞表面靶標，需要高水平的專業(yè)技術知識，代價高且耗時。Jia W 等人［19］使用Cell-SELEX程序，成功篩選了區(qū)分鼻咽癌（nasopharynx cancer，NPC）細胞和正常鼻咽上皮細胞（nasopharyngeal epithelia，NP）之間差異的4種適配體（S3、S5、S12和S27）。

2 基于外泌體的適配體傳感器的構建

生物傳感器由傳感器和生物識別元件組成，可提供快速分析和實時檢測。適配體傳感器是一種特殊類型的生物傳感器，其中適配體作為生物識別元件可與特定目標結合。換能器將這種結合轉換成可檢測和可測量的信號。許多研究已證明適配體傳感器在外泌體檢測中的巨大潛力。

2.1 適配體傳感器分類

基于適配體的信號轉導方法，將適配體傳感器分為八大類（如表1）：熒光、電化學、比色、發(fā)光、側流層析試紙條（lateral flow strip，LFS）、表面 增強 拉 曼散 射（surfaceenhanced Raman scattering，SERS）法、表 面 等 離 子 體 共振（surface plasmon resonance，SPR）傳感器和巨磁電阻（giant magnetoresistance，GMR）傳感器。這些適配體傳感器具有快速、靈敏、高通量、無創(chuàng)或微創(chuàng)、液體活組織檢查和經濟高效的分析等諸多優(yōu)勢，并提供了小型化和便攜式傳感平臺。

表1 適配體傳感器分類及其應用策略分析

2.2 熒光適配體傳感器

熒光適配體傳感器具有操作簡便、靈敏度高、信號強等優(yōu)點，通常依賴于熒光基團、染料和熒光納米粒子的使用，是目前外泌體檢測中使用最為廣泛的技術。該適配體傳感器主要采用3種策略：熒光信號放大（fluorescence signal amplification，F(xiàn)SA）、熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）和熒光偏振（fluorescence polarization，F(xiàn)P）。

2.2.1 FSA

適配體是核酸的基本類型，因此，它可與各種基于DNA的FSA反應結合，以提高檢測靈敏度。這些反應包括滾環(huán)擴增（rolling circle amplification，RCA）、雜交鏈式反應（hybridization chain reaction，HCR）、發(fā)夾DNA 級聯(lián)雜交反應（hair DNA cascade hybridization reation，HD-CHR）和 鏈 置換反應（strand displacement reaction，SDR）。其中，RCA 產生大量的核酸產物，實現(xiàn)信號放大。含有核仁素和RCA引物的DNA探針可以結合外泌體并引發(fā)RCA，產生增強的熒光信號［20］。

2.2.2 FRET

在3′-或5′-末端使用熒光基團或淬滅劑染料修飾適配體，不影響靶向結合，基于距離依賴性熒光淬滅的FRET適配體傳感器由此產生。在外泌體檢測中使用了兩種類型的FRET：熒光基團-淬滅劑和熒光基團-納米粒子。在“熒光基團-淬滅劑”適配體傳感器中，游離適配體是發(fā)夾結構，熒光基團（如四甲基羅丹明，TAMRA）和適配體兩端修飾的淬滅劑（Dabcyl）距離較近，對熒光有淬滅作用［36］。外泌體的存在打開了發(fā)夾結構，導致TAMRA 和Dabcyl 的分離，使TAMRA發(fā)出強烈的熒光。該方法為外泌體檢測提供了一種簡單快速的方法。Zhang Q 等人［21］基于適配體／Ti3C2MXenes納米復合體構建了一種獨特的標準開啟式FRET適配體傳感器，外泌體的檢測限為1.4 粒子／μL，比常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附法低1 000倍以上。

2.2.3 FP

FP是一種比率測量方法，對樣品的熒光波動和光漂白不敏感，不需要淬滅劑或供體受體對，簡化了探針設計。Zhang Z等人［22］構建了一種用于外泌體檢測的FP 適配體傳感器。當染料標記的適配體（平均10 kDa）（1 Da ＝1 g／mol）與外泌體（3.3 ×104kDa）結合時，適配體的FP 值由于外泌體／適配體復合物的巨大質量而顯著增加。這種無分離、無擴增的方法受環(huán)境干擾的影響較小，只需一個混合讀取步驟（約30 min），即可在人血漿（～1 μL）中實現(xiàn)靈敏定量。這種傳感器對小肺癌細胞系衍生的外泌體的最低檢測限為500粒子／μL。

2.3 電化學適配體傳感器

在電化學適配體傳感器中，適配體作為生物識別元件被結合并集成在電化學傳感器表面，當與靶標結合時產生電信號。這種適配體傳感器具有高靈敏度檢測、低成本、儀器簡單、自動設置等顯著特點，能夠出色應用到臨床環(huán)境中。在電化學適配體傳感器的構建中，主要采用4 種方法：直接固定法、夾心法、DNA步行機器人和免固定法。

2.3.1 直接固定法

在大多數(shù)情況下，適配體探針直接固定在電極表面，作為電化學方法中的親和傳感器。Wang S等人［23］提出了一種使用基于適配體的納米四面體結構來直接捕獲外泌體的增強型電化學適配體傳感器。根據(jù)硫醇和金（Au）電極之間的相互作用固定的底部金字塔結構中，每個適配體鏈以限定的納米（nm）級距離分布，可以降低阻礙效應、保持空間定向。

2.3.2 夾心法

適配體對外泌體的識別和結合效率在溶液-電極界面上普遍較低，限制了檢測靈敏度?；凇安东@探針-外泌體-檢測探針”格式的夾心式適配體傳感器通常用于提高識別率。為放大信號，An Y等人［2］基于CD63 適配體和外泌體的特異性識別、炔基-4-酮分子功能化脂質親電體的非特異性識別，結合點擊化學和放大，構建了一種新型三明治結構的“炔基-4-酮／外泌體／CD63適配體”適配體傳感器。由于點擊化學和HCR 技術的有效性，可達到低至96 粒子／μL的檢測限，在人血清中也實現(xiàn)了外泌體的定量。

2.3.3 DNA步行機器人

為提高靈敏度，DNA 步行機器人的3D 折疊結構結合電化學方法用于檢測外泌體。這種步行機器人沿著由脫氧核酶或軟件無線電驅動的設計好的寡核苷酸軌道獨立移動，這種寡核苷酸軌道可以將外泌體捕獲轉換為ssDNA 檢測?；诖?，Dong H等人［24］開發(fā)了雙信號擴增DNA 步行機器人。適配體-MB 生物偶聯(lián)物用于捕獲外泌體，導致3個信使DNA釋放，然后與固定在Au電極上的探針P1 雜交形成雙鏈結構。最低檢測限可達70 粒子／μL。DNA 循環(huán)擴增技術和電化學檢測方法的優(yōu)勢被完全整合到DNA步行機器人中，這可能會推動液體活檢技術的廣泛發(fā)展。

2.3.4 免固定法

為避免將適配體固定到電極表面的這一耗時過程，Yin X等人［25］基于蒽環(huán)類藥物阿霉素和Exo Ⅲ輔助擴增，開發(fā)了一種免固定化電化學傳感平臺。在該傳感器中，CD63 適配體識別并與外泌體結合，并從雙鏈DNA探針中釋放出P2探針。隨后，將P2探針與另一種富含氣相色譜的幽門螺桿菌探針雜交，并引發(fā)Exo Ⅲ切割過程，最終導致溶液中殘留的幽門螺桿菌探針減少。阿霉素可以與雙鏈氣相色譜序列強結合，產生巨大的電流信號，最低檢測限為12粒子／μL。

2.4 比色傳感器

比色適配體傳感器能夠通過目視檢查“是／否”來讀取結果，無需復雜的傳感設備即可輕松完成，并且檢測成本低、速度快、簡單。主要采用3 種策略：NaCl 誘導的Au 納米顆粒（Au nanoparticles，AuNPs）聚集、H2O2氧化反應和AuNPs金屬化。

2.4.1 NaCl誘導的AuNPs聚集

在寡核苷酸適配體傳感器中，適配體可與寡核苷酸表面結合，在高鹽濃度下可以防止聚集。外泌體存在的情況下，適配體離開AuNPs 表面與外泌體蛋白結合，從而誘導AuNPs聚集，顏色從紅色變?yōu)樗{色。Jiang Y等人［26］采用這種策略構建可以在幾分鐘內肉眼區(qū)別外泌體表面蛋白的傳感器平臺，為外泌體檢測提供了潛在的參考。

2.4.2 H2O2氧化反應

在H2O2氧化反應中，納米酶因其固有的酶模擬活性而受到越來越多的關注。此外，一些納米酶能吸附適配體，納米酶-適配體復合物能顯著增強過氧化物酶樣活性。基于此，Wang Y M等人［27］設計了一種使用石墨氮化碳納米片的比色傳感器。適配體被非特異性吸附在納米片表面，提高了至少4倍的過氧化物酶活性，從而增強了H2O2對四甲基聯(lián)苯胺的氧化，并呈現(xiàn)出強烈的藍色。外泌體從納米片表面釋放適配體，顏色變?yōu)闊o色。

2.4.3 AuNPs金屬化

2019年，Zhang Y等人［28］開發(fā)了一種基于三明治結構的視覺傳感器，該傳感器集成擴增和酶誘導銀（Ag）沉積在Au納米棒（Au nanorods，AuNRs）上。首先，MB-CD63 適配體用于捕獲和富集外泌體，外泌體脂質膜非特異性插入膽固醇連接的DNA探針，然后觸發(fā)HCR過程。大量HCR產物導致堿性磷酸酶的負荷增加，堿性磷酸酶催化Ag離子的還原，并促進Ag殼在AuNRs 上的金屬化及裸眼分析的多色變化，紫外可見光譜檢測限低至1.6 ×102粒子／μL，肉眼檢測限低至9 ×103粒子／μL，低于其他比色分析。

2.5 基于發(fā)光的適配體傳感器

發(fā)光是一種物質在不發(fā)熱的情況下發(fā)光的過程。因其具有高靈敏度、低成本和易于控制的特點，幾種基于發(fā)光的適配體傳感器被設計用于外泌體的檢測。根據(jù)發(fā)光能量來源分為2 個亞型：發(fā)光共振能量轉移（luminescence resonance energy transfer，LRET）和電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）。

2.5.1 LRET

基于LRET的傳感器與FRET 機制一樣，具有靈敏度高、分辨率高、可操作性好等優(yōu)點。Lyu Y等人［29］開發(fā)了繞過實時光激發(fā)用于多重區(qū)分癌癥外泌體的發(fā)光納米傳感器，該傳感器可以通過改變適配體序列來輕松檢測不同的外泌體蛋白，因為檢測發(fā)生在激發(fā)后，使背景信號最小化，提高了檢測限，比細胞培養(yǎng)基中的熒光檢測低近2 個數(shù)量級。能夠對多個外泌體樣品進行正交分析，從而有可能準確識別外泌體的細胞來源。

2.5.2 ECL

與電化學分析不同，ECL策略避免了背景電流的干擾，不依賴于電極表面粗糙程度、溫度、濕度、pH 等外部因素。Fang D D等人［30］構建了一種基于GCE／適配體-外泌體-抗體／MXenes三明治的ECL適配體傳感器，由黑磷量子點作為信號放大器和三（4，4-二羧基聯(lián)吡啶）氯化釕［Ru（Dcbpy）2＋3］作為共反應器，產生了一個較強的ECL 信號，37粒子／μL的強ECL信號。值得注意的是，該傳感器也可以開發(fā)為一種用于外泌體檢測的熱轉換裝置。

2.6 LFS

LFS通常在平裝便攜式設備上進行，操作簡單，通過顏色或信號變化很容易觀察到結果。根據(jù)測試線的不同交互作用，LFS通常分為兩種類型的夾層條或競爭條。Cheng N等人［31］設計了一種基于熱信號的夾心條帶用于外泌體檢測。簡而言之，Au＠Pb 納米與外泌體一起孵育形成Au＠Pb-外泌體復合物。用CD63 適配體納米花修飾測試線，能夠捕獲Au＠Pb-外泌體復合物，并且由于納米聚集體的積累以及通過激光激發(fā)的熱信號而形成黑色帶。外泌體未結合的納米探針將在控制線與生物素標記的探針相互作用，顯示另一條黑色條帶。該方法的檢測限可達1.4×104粒子／μL。

2.7 SERS

SERS具有用于篩選不同外泌體的獨特指紋特征，并且具有窄的光譜帶。Ning C F等人［32］報道了一種用于檢測癌細胞培養(yǎng)物中外泌體的適配體傳感器，該傳感器基于編碼在Au、Ag雙金屬納米環(huán)上的不同拉曼信號報告（2-Mpy、4-ATP或NTP）和適配體修飾的MBs作為捕獲底物。SERS方法能夠通過一個步驟區(qū)分各種外泌體，可作為癌癥診斷的潛在策略。

2.8 SPR傳感器

SPR是一種光學生物傳感方法，可用于實時跟蹤自然界中金屬表面上的生物分子相互作用。這種方法不會對生物分子造成任何損害，也不需要任何標記。Wang Q 等人［33］將SPR適配體傳感器用于雙AuNPs輔助信號放大的外泌體檢測。簡而言之，CD63 適配體被固定在Au 膜表面以捕獲一般的外泌體，包被在T30-AuNPs 上的CD63 適配體識別外泌體CD63 蛋白，從而形成“Au 膜／CD63 適配體-外泌體-CD63適配體／T30-AuNPs”的三明治復合物，導致局部折射率發(fā)生變化，出現(xiàn)第一個SP 單體。通過抗原-抗體相互作用加入A30包被的抗原，實現(xiàn)雙重信號放大。該方法靈敏度高，最低檢測限為5粒子／μL。

2.9 GMR

GMR 因其與集成電路技術的兼容性以及與超順磁性納米粒子技術的高靈敏度在生物傳感器應用獲得極大關注。在此，Zhu F等人［34］基于MoS2-Fe3O4納米結構的磁信號響應開發(fā)了一種用于外泌體檢測的GMR 適配體傳感器（MOFE）。CD63適配體被修飾到GMR 傳感器表面，用于捕獲一般的外泌體。該傳感器的檢出限為10 粒子／μL，具有良好的重現(xiàn)性和選擇性。這種GMR 為外泌體檢測提供了一種新方法，顯示出在臨床癌癥鑒定方面的巨大潛力。

3 基于外泌體的適配體的應用

3.1 在腫瘤早期檢測中的應用

外泌體因其特殊性質可以作為生物標志物來對腫瘤進行檢測。因此，在人體體液內尋找和檢測腫瘤細胞分泌的外泌體會是一種新穎、無創(chuàng)、高度可靠的診斷方式。這里介紹基于外泌體的適配體在幾種常見腫瘤中的應用。

為高靈敏度檢測乳腺癌外泌體，Wang Y 等人［35］提出的基于稀土摻雜上轉換納米粒子（UCNPs）供體和四甲基羅丹明（TAMRA）受體之間的LRET 的免洗適配體傳感器，檢測限低至80 粒子／μL，為LRET 傳感器應用于臨床提供了很好的數(shù)據(jù)支持。Huang R等人［37］介紹了一種用于胃癌外泌體特異性檢測的無標記電化學適配體傳感器。該適配體傳感器對胃癌外泌體具有高選擇性和敏感性，有望為早期胃癌檢測提供有用的診斷工具。

3.2 在靶向治療中的應用

外泌體是用于運輸生物分子以促進細胞間通信的納米級天然載體，表明它們在提供治療具有很高的潛力。為提高外泌體的遞送能力，人們發(fā)現(xiàn)一種簡單、無創(chuàng)且有效的策略，用有效的靶向適配體功能化外泌體，外泌體可以保護體內的藥物，使藥物不易釋放，減少對正常細胞的不良影響；適配體可以增加藥物傳遞系統(tǒng)的靶向性，尤其是個體化治療中的多重靶向適配體。Zou J 等人［38］利用二?；|-適配體綴合物作為靶向適配體來開發(fā)適配體功能化的外泌體（Apt-Exos）納米平臺，用于分子治療的細胞類型特異性遞送。詳細研究了Apt-Exos 的細胞攝取機制，與游離外泌體相比，觀察到了不同的行為。Apt-Exos 結合適配體優(yōu)異的分子識別能力和外泌體作為天然載體的優(yōu)勢，可以有效地將分子藥物／熒光基團靶向遞送至癌細胞，為癌癥治療提供了一個有前景的遞送平臺。

4 討論與展望

綜上所述，本文綜述了常用的適配體篩選方法，以及近年來適配體傳感器在檢測腫瘤外泌體及靶向藥物傳遞的研究進展。適配體的獨特性質使其成為適配體傳感器制造、生物識別和信號轉導的理想材料。結合電化學、發(fā)光及比色等靈活的技術，提高了檢測外泌體的靈敏度。

近年來，關于外泌體及其適配體的研究報道越來越多，適配體傳感器用于外泌體檢測的研究表明適配體傳感器的適用性，雖然目前沒有以Apt-Exos為基礎的應用，但不可否認這將為腫瘤的早期檢測以及藥物治療提供新的發(fā)展方向。

盡管適配體已經在許多傳感平臺中得到應用，但仍有一些關鍵的技術問題和挑戰(zhàn)需要改進或解決，比如基于外泌體的適配體傳感器在臨床實際樣本中的利用、基于外泌體的適配體的篩選技術的改進與創(chuàng)新等。這一進步需要材料科學、分子和細胞生物學、化學、藥學和臨床醫(yī)學等眾多領域的研究人員共同不懈的努力。