陳濤余良昆陳瑤陳靜超周柵刁麗媛*

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,江西 南昌 330006 2.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,江西 南昌 330004 3.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院,江西 南昌 330006

糖尿病性骨質(zhì)疏松癥(diabetic osteoporosis,DOP)是糖尿病患者發(fā)生脆性骨折的主要原因,是一種嚴(yán)重的肌肉骨骼并發(fā)癥[1]。每年全世界有900多萬例骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生,其中大多數(shù)與DOP有關(guān)[2],這對(duì)人們健康構(gòu)成了重大威脅。在過去的10年中,隨著對(duì)糖尿病微環(huán)境和礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)的不斷深入研究,皮質(zhì)孔隙度增加、骨代謝不平衡和骨微結(jié)構(gòu)改變已被確定為DOP的3個(gè)主要特征[3]。盡管越來越多的臨床證據(jù)表明,糖尿病微環(huán)境對(duì)骨代謝具有毀滅性的影響,但DOP潛在的病理生理機(jī)制和有效的治療方法仍有待進(jìn)一步研究[4-5]。

鐵死亡是由鐵依賴性的脂質(zhì)過氧化引起的一種新的程序性細(xì)胞死亡[6]。與其他形式的細(xì)胞死亡不同,鐵死亡具有獨(dú)特的生物學(xué)特征,如鐵積累,脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生增加,谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)表達(dá)下調(diào)[7-8]。近年來,越來越多的證據(jù)證實(shí)了糖脂代謝與鐵死亡之間的密切關(guān)系[9-10]。DOP的進(jìn)展總是伴隨著糖脂穩(wěn)態(tài)受損和血漿糖脂代謝產(chǎn)物升高,因此,鐵死亡可能在DOP的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。然而,對(duì)于糖尿病微環(huán)境中成骨細(xì)胞與鐵死亡之間的關(guān)系知之甚少。

葛根(radix puerariae,RP)是中國古代廣泛使用的一種強(qiáng)效治療草藥[11]。據(jù)漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》記載,它有升陽解肌,透疹止瀉,除煩止渴、益陰清熱之功效。RP被報(bào)道用于治療糖尿病已有兩千年的歷史,如玉泉丸、消渴丸、七味白術(shù)散等在治療消渴中的記載也證明了這一點(diǎn)。總體而言,RP對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥有較好的療效。葛根素(Puerarin,PUE)是RP的有效成分,已被證明可以治療多種疾病,包括心血管病、骨質(zhì)疏松癥、炎癥、肝損傷、癌癥和糖尿病[12-14]。本研究旨在評(píng)估PUE在體外高糖環(huán)境下對(duì)成骨細(xì)胞的作用,并確定PUE是否通過SLC7A11/GPX4途徑抑制高糖誘導(dǎo)的鐵死亡來保護(hù)成骨細(xì)胞,為PUE在未來的DOP治療運(yùn)用中提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)藥物:葛根素(CAS NO.6381-99-0)購自成都德銳可生物科技有限公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑:α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素、葡萄糖購自賽默飛公司;CCK-8試劑盒、ALP活性試劑盒、ALP染色試劑盒、DHE染色試劑、GSH試劑盒、茜素紅染色試劑盒、MDA試劑盒、SOD試劑盒購自碧云天公司;RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TAKARA公司;GAPDH、SLC7A11、GPX4購自Cell Signaling Technolog公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)細(xì)胞:成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞系購自武漢尚恩生物公司。

1.1.4細(xì)胞培養(yǎng):使用α-MEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清,1%雙抗)培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞,置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中,每2 d更換一次培養(yǎng)基,當(dāng)細(xì)胞生長匯合至80%時(shí)進(jìn)行傳代和種板。

1.2 研究方法

1.2.1CCK-8檢測(cè)PUE對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞活性的影響:將細(xì)胞種于96孔板(每孔3×103個(gè)),過夜培養(yǎng)后,使用不同濃度的PUE(0、5、10、25、50、100、200μmol/L)在完全培養(yǎng)基或高糖(葡萄糖25.5 mmol/L)培養(yǎng)基中干預(yù)24 h。24 h后,每孔加入10μL CCK-8溶液,置于培養(yǎng)箱中孵育1 h,使用microplate reader在450 nm處檢測(cè)每孔細(xì)胞的OD值。

1.2.2ALP染色及活性檢測(cè):將細(xì)胞種于24孔板(每孔2×104個(gè)),過夜培養(yǎng)后,更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、0.1μmol/L地塞米松和50 mg/L VitC 4)進(jìn)行培養(yǎng)將細(xì)胞分為對(duì)照組(Control)、高糖模型組(HG)、高糖+PUE低濃度組(HG+PUE 50μmol/L)、高糖+PUE高濃度組(HG+PUE 100μmol/L),干預(yù)持續(xù)7 d,每2 d更換一次培養(yǎng)基。7 d后去培養(yǎng)基,PBS清洗,多聚甲醛固定細(xì)胞10 min,PBS清洗3次。根據(jù)試劑盒說明書配置ALP染色工作液,每孔加入500μL,避光孵育30 min后觀察拍照。ALP活性根據(jù)試劑盒說明書操作,收集細(xì)胞,使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,離心收集上清,配置標(biāo)準(zhǔn)品和樣品,加入96孔板中,加入50μL檢測(cè)緩沖液,37℃孵育10 min,加入100μL反應(yīng)終止液終止反應(yīng),使用microplate reader在405 nm處檢測(cè)OD值。

1.2.3茜素紅染色:將細(xì)胞種于24孔板(每孔2×104個(gè)),過夜培養(yǎng)后,更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、0.1μmol/L地塞米松和50 mg/L VitC 4)進(jìn)行培養(yǎng),將細(xì)胞分為對(duì)照組(Control)、高糖模型組(HG)、高糖+PUE低濃度組(HG+PUE 50μmol/L)、高糖+PUE高濃度組(HG+PUE 100μmol/L)。誘導(dǎo)28 d后,用茜素紅染色試劑對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞進(jìn)行成骨評(píng)估。為了定量評(píng)估礦化程度,用10%(wt/vol)十六烷基氯化吡啶洗脫茜素紅染色劑1 h,并通過microplate reader檢測(cè)570 nm處OD值。

1.2.4細(xì)胞內(nèi)ROS水平評(píng)估:將細(xì)胞種于24孔板(每孔2×104個(gè)),過夜培養(yǎng)后,將細(xì)胞分為對(duì)照組(Control)、高糖模型組(HG)、高糖+PUE低濃度組(HG+PUE 50μmol/L)、高糖+PUE高濃度組(HG+PUE 100μmol/L),干預(yù)24 h。24 h后用超氧化物陰離子熒光探針(Dihydroethidium,DHE)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。用無血清α-MEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞,用10μmol/L DHE在37℃避光條件下處理20 min。孵育后,用無血清α-MEM培養(yǎng)基沖洗MC3T3-E1細(xì)胞,使用熒光顯微鏡攝取圖像。

為了量化細(xì)胞內(nèi)ROS水平,收集細(xì)胞并用PBS沖洗,隨后在無血清α-MEM培養(yǎng)基中重懸,最后用10μmol/L DHE在黑暗中37℃處理20 min。孵育后,MC3T3-E1細(xì)胞用無血清α-MEM培養(yǎng)基沖洗,隨后用FACSCalibur流式細(xì)胞儀評(píng)估平均熒光強(qiáng)度。

1.2.5GSH、MDA、SOD水平檢測(cè):將細(xì)胞種于6孔板(每孔2×105個(gè)),過夜培養(yǎng)后,將細(xì)胞分為對(duì)照組(Control)、高糖模型組(HG)、高糖+PUE低濃度組(HG+PUE 50μmol/L)、高糖+PUE高濃度組(HG+PUE 100μmol/L),干預(yù)24 h。24 h后分別根據(jù)GSH試劑盒、MDA試劑盒和SOD試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中GSH、MDA、SOD水平。

1.2.6qRT-PCR:使用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取總RNA,并使用Primescript RT Master Mix進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用SYBR預(yù)混劑ex taq Ⅱ試劑盒在LightCycler 480實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行qRT-PCR。表1中列出了用于擴(kuò)增ALP、Runx2、COL1A1、OPN和β-actin的引物。擴(kuò)增條件如下:95℃持續(xù)30 s,95℃持續(xù)5 s,60℃持續(xù)20 s,循環(huán)40次。相對(duì)mRNA表達(dá)量通過比較周期閾值(Ct)進(jìn)行量化,β-actin作為內(nèi)對(duì)照,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法處理。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.2.7Western blot檢測(cè):干預(yù)結(jié)束后,去除孔內(nèi)培養(yǎng)基,加入PBS反復(fù)洗滌,然后加入RIPA裂解液提取總蛋白,在4℃下以12 000g離心15 min,獲得含總蛋白的上清液,蛋白變性后進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜、封閉,置于一抗(稀釋比例為1∶1 000)中,4℃過夜。然后將膜小心地移至二抗培養(yǎng)箱中,加入二抗,室溫孵育1 h。蛋白帶用Western ECL Substrate Kit進(jìn)行可視化。使用Bio-Rad掃描儀獲取圖像,并使用數(shù)字圖像分析軟件定量,GAPDH作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0和Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制,所有數(shù)值資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間數(shù)值數(shù)據(jù)的差異采用Student’st檢驗(yàn)。單向方差分析用于檢驗(yàn)多組間的差異,然后進(jìn)行Tukey檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PUE對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞活性的影響

與對(duì)照組相比,100μmol/L以下的PUE對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞無明顯毒性作用;200μmol/L 的PUE明顯抑制MC3T3-E1細(xì)胞增殖(P<0.05)。與對(duì)照組相比,HG明顯降低了MC3T3-E1細(xì)胞活性;然而,PUE處理后明顯提高了MC3T3-E1細(xì)胞生存率,其中濃度為50、100μmol/L PUE對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的保護(hù)作用最為明顯(P<0.05)。見圖1。因此,本研究選擇了50μmol/L和100μmol/L的PUE進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 PUE對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞活性的影響A:PUE化學(xué)結(jié)構(gòu)式;B:24 h PUE對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞活性的影響;C:24 h PUE對(duì)高糖誘導(dǎo)下MC3T3-E1細(xì)胞活性的影響。Fig.1 Effects of PUE on MC3T3-E1 cell activityA: chemical structural formula of PUE; B: effect of PUE on MC3T3-E1 cell activity at 24 h; C: effect of PUE on MC3T3-E1 cell activity induced by high glucose at 24 h.注:與對(duì)照組比,****P<0.000 1,###P<0.001;與HG組比,**P<0.01,****P<0.000 1;ns:P>0.05。

2.2 PUE對(duì)高糖環(huán)境下MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化能力的影響

MC3T3-E1細(xì)胞在進(jìn)行成骨誘導(dǎo)28 d后,與對(duì)照組相比,HG干預(yù)后明顯降低了ALP染色陽性率以及ALP活性;此外,茜素紅染色結(jié)果表明HG誘導(dǎo)后明顯降低了MC3T3-E1細(xì)胞ARS染色陽性率和礦化結(jié)節(jié)數(shù)量。然而,PUE處理后明顯提高了ALP和ARS染色陽性率以及ALP活性(P<0.05)。為了進(jìn)一步研究PUE對(duì)HG誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞成骨分化的影響,通過qRT-PCR方法檢測(cè)PUE對(duì)HG誘導(dǎo)的MC3T3-E1成骨細(xì)胞中ALP、Runx2、COL1A1和OPN的表達(dá)。結(jié)果表明,HG降低了ALP、Runx2、COL1A1和OPN的mRNA表達(dá)水平(P<0.05),而PUE則明顯增加了ALP、Runx2、COL1A1和OPN的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)。這些結(jié)果表明PUE對(duì)HG誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞成骨分化具有保護(hù)作用。見圖2。

2.3 PUE通過抑制HG誘導(dǎo)的鐵死亡發(fā)揮保護(hù)作用

細(xì)胞鐵死亡的特征在于胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)耗盡,鐵依賴性脂質(zhì)過氧化不斷累積,ROS水平升高,從而引起細(xì)胞死亡[15]。DHE染色顯示,HG誘導(dǎo)24 h后,細(xì)胞內(nèi)紅色熒光亮度明顯更高,表明ROS生成增加,PUE處理后熒光亮度明顯降低,代表著較低的ROS水平。為了定量研究PUE對(duì)ROS產(chǎn)生的抑制作用,本研究采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示了相似的趨勢(shì)。PUE抑制HG誘導(dǎo)的ROS生成呈劑量依賴性,其中100μmol/L的PUE對(duì)ROS生成的抑制效果最顯著(P<0.05)。在脂質(zhì)過氧化方面,PUE顯著降低了HG誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化生成,包括GSH和MDA水平,并提高了SOD活性(P<0.05)。見圖3。總之,本研究結(jié)果表明,鐵死亡參與了HG誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程,PUE可能通過抑制HG誘導(dǎo)的鐵死亡發(fā)揮保護(hù)作用。

圖3 PUE通過抑制HG誘導(dǎo)的鐵死亡發(fā)揮保護(hù)作用A:DHE染色,紅色代表ROS陽性細(xì)胞;B～C:流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)PUE對(duì)高糖誘導(dǎo)下MC3T3-E1細(xì)胞ROS水平的影響;D～F:PUE對(duì)高糖誘導(dǎo)下MC3T3-E1細(xì)胞GSH、SOD、MDA水平的影響。Fig.3 PUE exerts a protective effect by inhibiting HG-induced ferroptosisA: DHE staining, red colour represents ROS-positive cells; B, C: Effect of PUE on ROS levels in MC3T3-E1 cells induced by high glucose as detected by flow cytometry; D-F: Effect of PUE on GSH, SOD and MDA levels in MC3T3-E1 cells induced by high glucose.注:與對(duì)照組比,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1;與HG組比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001,####P<0.000 1。

2.4 PUE通過SLC7A11/GPX4信號(hào)通路保護(hù)MC3T3-E1細(xì)胞抵抗鐵死亡

SLC7A11是胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)(cystine/glutamate transporter,Xc-系統(tǒng))的一個(gè)亞基,具有多種功能,包括導(dǎo)入用于合成谷胱甘肽的細(xì)胞外半胱氨酸、清除ROS和增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化活性[16]。SLC7A11/GPX4軸在防止脂質(zhì)過氧化介導(dǎo)的鐵死亡中起關(guān)鍵作用,抑制SLC7A11和GPX4會(huì)中斷細(xì)胞內(nèi)GSH代謝,促進(jìn)脂質(zhì)過氧化和隨后的鐵死亡[17]。通過Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HG處理后顯著降低了SLC7A11和GPX4的表達(dá)水平(P<0.05)。然而,在HG處理的成骨細(xì)胞中添加PUE可顯著提高SLC7A11和GPX4的表達(dá)水平(P<0.05)。見圖4。綜上所述,本研究證明PUE通過上調(diào)SLC7A11/GPX4通路抑制HG誘導(dǎo)成骨細(xì)胞鐵死亡。

圖4 PUE通過SLC7A11/GPX4信號(hào)通路保護(hù)MC3T3-E1細(xì)胞抵抗鐵死亡A:SLC7A11蛋白表達(dá)情況;B:GPX4蛋白表達(dá)情況。Fig.4 PUE protects MC3T3-E1 cells against ferroptosis through SLC7A11/GPX4 signaling pathwayA: Protein expression of SLC7A11; B: Protein expression of GPX4.注:與對(duì)照組比,***P<0.001;與HG組比,##P<0.01,###P<0.001。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥被認(rèn)為是糖尿病的重要并發(fā)癥之一,目前的治療方法不足以治療糖尿病引起的骨質(zhì)疏松癥[18-19]。糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步研究,并開發(fā)有效的藥物治療方法。本研究使用25.5 mmol/L葡萄糖來模擬體外糖尿病環(huán)境下的成骨細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下極大地降低了MC3T3-E1細(xì)胞的活性和成骨潛力[20-21]。此外,鐵死亡是一種新的細(xì)胞死亡模式,在糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病中起作用。本研究發(fā)現(xiàn)PUE通過上調(diào)SLC7A11/GPX4通路有效地減少高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞鐵死亡,從而減輕骨質(zhì)疏松癥。筆者認(rèn)為,PUE可能是治療糖尿病骨質(zhì)疏松癥的有效方法之一。

葛根素是從中藥葛根中提取的主要異黃酮苷。它在降低血壓[22]、血糖、血脂[23]和癌癥[24]方面的治療作用已被廣泛研究。Shan等[25]的研究發(fā)現(xiàn)PUE能夠抑制NF-κB信號(hào)通路減少骨質(zhì)丟失。一些研究還表明PUE抑制破骨細(xì)胞的生成和骨吸收[26]。例如,最近的一項(xiàng)研究表明,PUE通過抑制自噬反應(yīng)來抑制破骨細(xì)胞的形成[27]。然而,葛根素在糖尿病骨質(zhì)疏松的作用及機(jī)制尚不清楚。因此,本研究利用體外細(xì)胞模型研究了葛根素對(duì)高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制。CCK-8結(jié)果表明PUE提高了HG環(huán)境下MC3T3-E1細(xì)胞生存率,PUE對(duì)高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞的保護(hù)作用是劑量依賴性的,在濃度為100μmol/L時(shí)觀察到的保護(hù)作用最大(P<0.05)。HG在成骨細(xì)胞分化功能障礙中發(fā)揮重要作用。Runx2引導(dǎo)成骨前體細(xì)胞分化成未成熟成骨細(xì)胞,然后引發(fā)啟動(dòng)子激活和骨表型蛋白基因的表達(dá),包括COL1A1、ALP和OPN[28]。本研究結(jié)果表明,HG明顯降低了成骨細(xì)胞ALP、ARS染色陽性率以及ALP活性。此外,用HG處理24 h可顯著抑制成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá),而PUE以劑量依賴的方式上調(diào)Runx2、COL1A1、ALP和OPN的表達(dá)(P<0.05)。之前的研究發(fā)現(xiàn)鐵超載和氧化應(yīng)激是DOP發(fā)病的重要因素[29-30]。鐵死亡自2012年首次報(bào)道以來,引起了科學(xué)家的極大興趣[31]。本研究發(fā)現(xiàn)HG增加了成骨細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA水平,降低了細(xì)胞內(nèi)GSH和SOD的水平,促進(jìn)了脂質(zhì)氧化物的積累?？傊?這些結(jié)果表明,HG可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞鐵死亡。然而,PUE顯著減少ROS、MDA水平和脂質(zhì)過氧化生成,并恢復(fù)GSH水平以及SOD活性(P<0.05)。

SLC7A11/GPX4通路通過協(xié)助細(xì)胞內(nèi)GSH合成和緩解脂質(zhì)過氧化作用,發(fā)揮抵抗鐵死亡的防御作用。SLC7A11能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)谷氨酸的輸出和細(xì)胞外胱氨酸的輸入[32]。在細(xì)胞內(nèi)吸收后,胱氨酸被還原為半胱氨酸,作為GSH合成的限速前體[33]。在GSH存在的情況下,GPX4介導(dǎo)有毒脂質(zhì)過氧化物轉(zhuǎn)化為無毒脂質(zhì)醇,SLC7A11抑制導(dǎo)致GSH耗損,GSH耗損進(jìn)而下調(diào)GPX4,導(dǎo)致鐵依賴性脂質(zhì)過氧化物積累引起細(xì)胞損傷[34]。SLC7A11/GPX4軸作為鐵死亡的關(guān)鍵抑制通路受到了廣泛的關(guān)注,被認(rèn)為是鐵死亡相關(guān)疾病的潛在治療靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)HG處理后顯著降低了SLC7A11和GPX4的蛋白表達(dá)。然而,PUE可顯著提高SLC7A11和GPX4的表達(dá)水平(P<0.05)。綜上所述,本研究證明PUE可能通過上調(diào)SLC7A11/GPX4通路抑制HG誘導(dǎo)成骨細(xì)胞鐵死亡。

本研究發(fā)現(xiàn)葛根素通過調(diào)節(jié)SLC7A11/GPX4軸來改善高糖誘導(dǎo)成骨細(xì)胞鐵死亡,結(jié)果表明,葛根素可能是治療糖尿病骨質(zhì)疏松癥的潛在藥物。在后續(xù)研究中將借助動(dòng)物構(gòu)建體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及相關(guān)通路抑制劑對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)一步研究。