劉慧雯 劉昊 尚奇 陳桂鋒 陳弘林 伍子賢 余富勇 顏先偉 秦威城 沈耿楊 任輝* 江曉兵*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心,廣東 廣州 510405 3.黔西南州中醫(yī)醫(yī)院,貴州 黔西南州 562499 4.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院,廣東 廣州 510260

骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是多功能祖細(xì)胞,可以自我更新并分化成不同的細(xì)胞譜系包括成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞發(fā)揮功能[1],關(guān)于BMSCs分化方向的調(diào)控一直以來(lái)都是骨修復(fù)研究的熱點(diǎn)。烷基化修復(fù)同系蛋白5(ALKBH5)是一種關(guān)鍵的RNA去甲基化酶,現(xiàn)有對(duì) ALKBH5影響成骨分化的機(jī)制研究結(jié)論不一[2-3],其作用仍存在爭(zhēng)議。左歸丸出自《景岳全書(shū)》,是滋陰補(bǔ)腎、益精填髓的代表方藥?，F(xiàn)有研究表明,左歸丸能夠改善年齡相關(guān)性骨質(zhì)流失,在參與骨形成、促進(jìn)骨修復(fù)方面具有一定的潛能[4-5],然其在細(xì)胞和分子水平上的作用機(jī)制尚未完全闡明。左歸丸對(duì)ALKBH5的影響尚不明確。因此,本研究擬從去甲基化酶ALKBH5探討左歸丸對(duì)小鼠BMSCs成骨分化的作用,以期為左歸丸應(yīng)用于臨床防治骨質(zhì)疏松癥提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2月齡C57BL/6小鼠22只,SPF級(jí),體重20～25 g,雌性,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(粵)2018-0092]。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

左歸丸(熟地黃24 g、山藥12 g、枸杞子12 g、山萸肉12 g、川牛膝9 g、菟絲子12 g、鹿角膠12 g、龜甲膠12 g,參考《藥典2020》標(biāo)準(zhǔn)),藥物均購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。

1.3 主要試劑及儀器

β-甘油磷酸鈉(BGP)(Merck公司,G9244-50G),維生素C(Solarbio公司,A8100),胎牛血清(Cyagen公司,FBSAD-01011-500),地塞米松(Aladdin公司,50-02-2D),α-MEM培養(yǎng)基(Servicebio公司,G4551-500),BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒(Beyotime公司,C3206),茜素紅染色液(Cyagen公司,ALIR-10001),RT-qPCR試劑盒(TAKARA公司,RR420 L),EvoM-mLV反轉(zhuǎn)錄試劑(艾科瑞公司,AG11706),RIPA裂解液(Solarbio公司,R0020),siRNA(銳博生物公司,siG2207050849395006)、riboFECTTMCP Transfection Kit(166T)(銳博生物公司,C10511-05)、ALKBH5抗體(Affinity公司,DF2585),BMP4抗體(Abcam公司,ab39973),RUNX2抗體(CST公司,12556),BMP2抗體(Abcam公司,ab14933),HRP羊抗兔IgG(Affinity公司,S0001)、HRP羊抗鼠IgG(Affinity公司,S0002),全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、超凈工作臺(tái)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Therom公司)、Western blot電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司,CFX96型)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1藥物制備:左歸丸:熟地、山藥、枸杞子、山萸肉、川牛膝、菟絲子煎煮、過(guò)濾、濃縮至5000 mL時(shí)加入鹿角膠和龜膠烊化,液氮冷凍、凍干機(jī)-50℃干燥、粉碎后低溫干燥保存凍干粉。將左歸丸凍干粉用PBS溶解,過(guò)濾備用。成骨誘導(dǎo)液:維生素C:88.6 mg+10 mL PBS;BGP:4.32 g+10 mL PBS;地塞米松:19.623 mg+10 mL無(wú)水乙醇。-20℃保存。過(guò)濾備用,使用時(shí)終濃度:維生素C:8.86 μg/mL,BGP:4.32μg/mL,地塞米松:0.196 μg/mL。

1.4.2細(xì)胞提取與培養(yǎng):BMSCs分離、培養(yǎng)和傳代 2月齡C57BL/6小鼠2只,脫頸椎處死后置于75%乙醇中5 min,分離雙下肢股骨和脛骨,無(wú)菌條件下暴露骨髓腔,用完全培養(yǎng)基沖洗骨髓腔,隨后將沖洗液輕輕吹打混勻,無(wú)菌培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中,待生長(zhǎng)至80%融合度時(shí)進(jìn)行傳代。細(xì)胞傳至第3代時(shí)鋪板,進(jìn)行后續(xù)干預(yù)。

1.4.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染:采用設(shè)計(jì)合成的siRNA轉(zhuǎn)染小鼠BMSCs,以1.5×104個(gè)/cm2的密度將小鼠BMSCs接種于6孔板中,待6孔板內(nèi)的細(xì)胞融合度達(dá)30%～50%時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染。以riboFECTTMCP Reagent 轉(zhuǎn)染siRNA于6孔板。配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物,過(guò)程中輕輕混勻,室溫孵育0～15 min。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入適量無(wú)雙抗的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中輕輕混勻。細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后通過(guò)RT-qPCR法檢測(cè)其沉默效率。按相同操作構(gòu)建空載體轉(zhuǎn)染的對(duì)照組(si-NC),ALKBH5沉默成功后,應(yīng)用左歸丸混懸液(1000 μg/mL)干預(yù)。

1.4.4ALP與ARS染色:將小鼠BMSCs按6000個(gè)/mL種入48孔板中。①用配置好的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別干預(yù)0、3、7 d;②對(duì)照組用含10%FBS的α-MEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行干預(yù),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加入1000 μg/mL濃度的左歸丸混懸液進(jìn)行干預(yù),放置于恒溫培養(yǎng)箱中7 d。③細(xì)胞分組:對(duì)照組(si-NC)、左歸丸組(si-NC+ZGW)、沉默組(si-ALKBH5)、沉默+左歸丸組(si-ALKBH5+ZGW)。對(duì)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行siALKBH5轉(zhuǎn)染,構(gòu)建ALKBH5沉默的小鼠BMSCs,同時(shí)構(gòu)建空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組,左歸丸混懸液(1000 μg/mL)在轉(zhuǎn)染48 h后加入,放置于恒溫培養(yǎng)箱中3 d。準(zhǔn)備染色時(shí),PBS輕柔洗滌,4%多聚甲醛固定、PBS洗板,將孔板置于室溫中分別以ALP染色液和茜素紅染色液染色,PBS洗滌3次。染色后用掃描儀拍攝。

1.4.5RT-qPCR檢測(cè):①成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基干預(yù)小鼠BMSCs 0、3、7 d;②參照1.4.3分別用si-ALKBH5和si-NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h。上述樣本用Trizol法提取BMSCs的RNA。測(cè)量RNA濃度,-80℃保存。將提取的RNA樣品按1 μg/20μL體系配制反應(yīng)溶液,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板。12.5 μL/孔TB Green Premix Ex Taq(2×)及2 μL/孔cDNA,上、下游引物各0.5 μL,并參照25 μL體系配平后按SYBR法開(kāi)始RT-qPCR反應(yīng)程序。引物由生工生物工程股份有限公司合成,引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequence of RT-qPCR

1.4.6Western-blotting(WB)檢測(cè):①成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基干預(yù)小鼠BMSCs 0、3、7 d,檢測(cè)各組ALKBH5、BMP4蛋白表達(dá)。②空白組BMSCs不做處理,藥物組用左歸丸混懸液(1000 μg/mL)干預(yù)7 d,檢測(cè)兩組ALKBH5、Runx2蛋白表達(dá)。③將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組(si-NC)、左歸丸組(si-NC+ZGW)、沉默組(si-ALKBH5)、沉默+左歸丸組(si-ALKBH5+ZGW),參照1.4.3分別用si-ALKBH5和si-NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h,而后用左歸丸混懸液(1000 μg/mL)干預(yù)3 d,檢測(cè)各組ALKBH5、BMP2蛋白表達(dá)。裂解細(xì)胞提取蛋白,BCA法測(cè)定濃度。加入5×loading buffer,100℃變性10 min,上樣。電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜。一抗4℃孵育過(guò)夜,室溫下二抗孵育1 h,洗膜,最后顯影分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。本研究數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,各組間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠BMSCs成骨分化過(guò)程中ALKBH5的表達(dá)

ALP染色結(jié)果顯示,隨著時(shí)間延長(zhǎng),ALP染色逐漸深染,成骨誘導(dǎo)液成功誘導(dǎo)mBMSCs成骨分化。見(jiàn)圖1。

圖1 成骨誘導(dǎo)條件下ALP染色結(jié)果的變化Fig.1 Changes of ALP staining after osteogenic stimulation

RT-qPCR結(jié)果顯示,與0 d相比,成骨誘導(dǎo)3 d的 BMSCs COL1A1 mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.001),成骨誘導(dǎo)7 d的 BMSCs ALKBH5、COL1A1、BMP4 mRNA表達(dá)均上調(diào)(P<0.01),說(shuō)明成骨分化過(guò)程中,ALKBH5 mRNA的表達(dá)上調(diào)。見(jiàn)圖2。

圖2 成骨誘導(dǎo)條件下成骨相關(guān)基因和ALKBH5 mRNA表達(dá)的變化Fig.2 The mRNA expression changes of osteogenesis-related genes and ALKBH5 after osteogenic stimulation注: **P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。

WB結(jié)果顯示,與0 d相比,成骨誘導(dǎo)3、7 d后ALKBH5、BMP4的蛋白表達(dá)水平均上調(diào),說(shuō)明成骨分化過(guò)程ALKBH5的蛋白表達(dá)水平逐漸上調(diào)。見(jiàn)圖3。

圖3 成骨誘導(dǎo)條件下成骨標(biāo)志物和ALKBH5的蛋白表達(dá)的變化Fig.3 The protein expression changes of osteogenic markers and ALKBH5 after osteogenic stimulation

2.2 左歸丸對(duì)小鼠BMSCs成骨分化及ALKBH5的調(diào)控作用

ALP染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,左歸丸組的ALP染色陽(yáng)性率顯著升高,顏色深染;ARS染色結(jié)果顯示,左歸丸組的ARS染色陽(yáng)性率明顯高于空白組,礦化結(jié)節(jié)明顯增多。說(shuō)明左歸丸能夠增加小鼠BMSCs成骨分化能力和礦化能力。見(jiàn)圖4。

圖4 ALP和ARS染色評(píng)估左歸丸干預(yù)對(duì)BMSCs成骨分化的影響Fig.4 Effects of ZGW on the osteoblast differentiation ability of BMSCs by ALP staining and ARS staining注:右為×100鏡下圖。

WB結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,左歸丸組的ALKBH5、Runx2的蛋白表達(dá)水平均上調(diào)(P<0.05),說(shuō)明左歸丸能夠上調(diào)ALKBH5的表達(dá),促進(jìn)成骨分化。見(jiàn)圖5。

圖5 左歸丸干預(yù)對(duì)成骨標(biāo)志物和ALKBH5的蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of ZGW on the protein expression of osteogenic markers and ALKBH5注:*P<0.05,**P<0.01。

2.3 小鼠BMSCs沉默ALKBH5后對(duì)成骨分化的影響及左歸丸的干預(yù)作用

2.3.1小鼠BMSCs沉默ALKBH5的鑒定及成骨相關(guān)因子的表達(dá)變化:RT-qPCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,沉默組ALKBH5表達(dá)下調(diào)(P<0.01),沉默效率約為50%,同時(shí)成骨分化相關(guān)因子Osx、Runx2均表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6 siALKBH5沉默效率及ALKBH5沉默后成骨相關(guān)因子的變化Fig.6 Efficacy of siALKBH5 knockdowm and the expression of osteogenesis-related genes changes after ALKBH5 knockdown注:*P<0.05,**P<0.01。

2.3.2小鼠BMSCs沉默ALKBH5后左歸丸的干預(yù)作用:WB結(jié)果顯示,與對(duì)照組(si-NC組)相比,左歸丸組(si-NC+ZGW組)上調(diào)ALKBH5(P<0.001)、成骨標(biāo)志物Runx2(P<0.01)、BMP2(P<0.01)的蛋白表達(dá);沉默組(si-ALKBH5)相較于對(duì)照組ALKBH5(P<0.01)蛋白表達(dá)下調(diào),Runx2(P<0.05)、BMP2(P<0.05)的蛋白表達(dá)相應(yīng)下調(diào),ALKBH5沉默+左歸丸組(si-ALKBH5+ZGW組)相較于沉默組則又上調(diào)了ALKBH5(P<0.001)的蛋白表達(dá),逆轉(zhuǎn)了沉默組Runx2(P<0.05)、BMP2(P<0.05)的蛋白表達(dá)下調(diào)。說(shuō)明左歸丸能夠促進(jìn)ALKBH5的蛋白表達(dá),促進(jìn)成骨分化相關(guān)蛋白R(shí)unx2和BMP2的表達(dá),將ALKBH5敲降后,成骨分化相關(guān)蛋白R(shí)unx2和BMP2表達(dá)減少,左歸丸干預(yù)能夠上調(diào)ALKBH5的表達(dá),逆轉(zhuǎn)ALKBH5敲降后Runx2和BMP2表達(dá)下調(diào)。見(jiàn)圖7。ALP染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,左歸丸組染色陽(yáng)性率顯著升高,顏色深染。沉默組染色陽(yáng)性率較對(duì)照組下降,染色變淺,左歸丸干預(yù)后染色陽(yáng)性率明顯升高。說(shuō)明左歸丸能夠促進(jìn)小鼠BMSCs成骨分化;將ALKBH5沉默后,小鼠BMSCs成骨分化能力下降,在此基礎(chǔ)上加入左歸丸能夠抑制小鼠BMSCs的成骨分化能力下降。見(jiàn)圖8。

圖7 ALKBH5敲降后左歸丸干預(yù)對(duì)成骨標(biāo)志物和ALKBH5蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effects of ZGW on the protein expression of osteogenic markers and ALKBH5 after ALKBH5 knockdown注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

圖8 ALP染色評(píng)估ALKBH5沉默后左歸丸干預(yù)對(duì)小鼠BMSCs成骨分化的影響Fig.8 Effects of ZGW on the osteoblast differentiation ability of mouse BMSCs after ALKBH5 knockdown with ALP staining注:“-”代表無(wú),“+”代表有。

3 討論

負(fù)責(zé)骨形成的成骨細(xì)胞長(zhǎng)期以來(lái)一直被認(rèn)為是治療骨質(zhì)疏松癥或者骨質(zhì)疏松骨折修復(fù)等骨病的重要媒介[6-7]。而B(niǎo)MSCs不僅能夠分化為成骨細(xì)胞,且能一定程度上維系其壽命,參與到骨組織的生長(zhǎng)和修復(fù)過(guò)程中來(lái),維持骨穩(wěn)態(tài)[8]。BMSCs的成骨分化過(guò)程包括一系列事件。祖細(xì)胞經(jīng)歷連續(xù)的分化階段,增殖潛力降低,從而產(chǎn)生前成骨細(xì)胞。隨后,成骨細(xì)胞前分化為成熟的成骨細(xì)胞,沉積形成骨基質(zhì)所需的成分,然后礦化。最終,成熟的礦化成骨細(xì)胞嵌入新分泌的骨基質(zhì)中,并進(jìn)行終末分化以形成骨細(xì)胞[9]。分化過(guò)程中伴隨著堿性磷酸酶(ALP)活性的增加[10]。其他成骨標(biāo)志物如Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)[11]、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osx[12]、α1-1型膠原基因(COL1A1)[13]、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4[14]、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2[15]也在成骨分化過(guò)程中逐漸表達(dá)上調(diào)。

m6A是真核生物體內(nèi)一種動(dòng)態(tài)可逆的RNA修飾,主要受甲基化轉(zhuǎn)移酶“writer”、去甲基化酶“eraser”調(diào)控,結(jié)合蛋白“reader”識(shí)別其作用[16]。ALKBH5作為重要的去甲基化酶之一,可通過(guò)調(diào)控mRNA穩(wěn)定性影響成骨分化,但存在積極作用、消極作用兩種結(jié)果。Yu等[17]研究發(fā)現(xiàn),ALKBH5可以逆轉(zhuǎn)甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL3激活NF-κB通路產(chǎn)生的成骨抑制作用;Feng等[18]研究發(fā)現(xiàn),ALKBH5 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中上調(diào),并且ALKBH5沉默后成骨細(xì)胞分化收到抑制,礦化和成骨生物標(biāo)志物的表達(dá)。本文通過(guò)在成骨誘導(dǎo)條件下檢測(cè)ALKBH5和成骨標(biāo)志物的mRNA和蛋白表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)在第7天時(shí)成骨標(biāo)志物表達(dá)上調(diào),此時(shí)ALKBH5表達(dá)明顯上調(diào)。為進(jìn)一步明確ALKBH5在小鼠BMSCs成骨分化過(guò)程中的作用,作者應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將BMSCs中的ALKBH5敲降,發(fā)現(xiàn)ALKBH5敲降后成骨生物標(biāo)志物的表達(dá)下調(diào),成骨細(xì)胞分化能力下降,又一次證實(shí)ALKBH5在小鼠BMSCs成骨分化過(guò)程中起著正向調(diào)控作用。

左歸丸出自《景岳全書(shū)》卷五十一,為補(bǔ)益劑,具有壯水之主,培腎之元陰之功效。關(guān)于左歸丸促進(jìn)BMSCs的成骨分化治療骨質(zhì)疏松癥的作用雖已多次得到證實(shí)[19-20],其作用機(jī)制大部分是關(guān)于 Wnt/β-catenin、AMPK/mTOR等信號(hào)通路的研究,目前關(guān)于左歸丸通過(guò)調(diào)控RNA修飾影響小鼠BMSCs成骨分化的研究尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[21],左歸丸可以通過(guò)激活let-7f抑制自噬來(lái)促進(jìn)BMSC的成骨分化,從而改善糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的激素性骨質(zhì)疏松。其中,左歸丸的最佳干預(yù)濃度為1000 μg/mL。因此,本研究在此基礎(chǔ)上采用1000 μg/mL的左歸丸混懸液干預(yù)小鼠BMSCs,研究去甲基化酶ALKBH5在其成骨分化過(guò)程中的作用機(jī)制。研究表明左歸丸促進(jìn)成骨分化過(guò)程中,ALKBH5表達(dá)上調(diào),為進(jìn)一步證實(shí)左歸丸通過(guò)上調(diào)ALKBH5對(duì)小鼠BMSCs成骨分化產(chǎn)生影響,作者對(duì)ALKBH5沉默的小鼠BMSCs加入左歸丸干預(yù),結(jié)果表明左歸丸能夠逆轉(zhuǎn)ALKBH5沉默導(dǎo)致的小鼠BMSCs成骨分化能力下降。

綜上所述,本研究證實(shí)左歸丸能夠促進(jìn)小鼠BMSCs的成骨分化,并發(fā)現(xiàn)上調(diào)去甲基化酶ALKBH5的表達(dá)可能是其發(fā)揮作用的機(jī)制之一。然而,本研究尚存在不足,尚未明確左歸丸通過(guò)上調(diào)ALKBH5的去甲基化作用影響調(diào)控的mRNA,下一步將繼續(xù)進(jìn)行研究。