張浦燊 蘆泊帆 胡云鵬 連強強 侯曉麗 邢磊 王玉丹 張柳 田發(fā)明*

1.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,河北 唐山 063210 2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河北 石家莊 050011 3.國家礦山醫(yī)療救助中心應(yīng)急總醫(yī)院骨科,北京 100028

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種以骨密度(bone mineral density,BMD)降低、骨組織微結(jié)構(gòu)受損為特征的全身性骨代謝疾病,同時發(fā)生脆性骨折的概率增加[1-2]。目前已有動物實驗證實氯化鋰(lithium chloride,LiCl)對OP有一定的治療潛能,可以顯著促進小鼠骨形成,改善骨骼質(zhì)量[3-5]。

JAK/STAT3信號通路參與多種骨相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展[6]。Sun等[7]發(fā)現(xiàn)JAK/STAT信號通路與OP關(guān)系密切,在成骨細胞(osteoblast,OB)分化過程中都具有重要作用[8]。STAT3可能增強Treg介導(dǎo)的抑炎作用,從而促進骨折愈合[9];JAK2/STAT3通路的活化可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向OB分化,加速骨再生和骨缺損愈合[10]。此外,Davidson等[11]研究表明,STAT3基因敲除小鼠的BMD和骨形成率顯著下降。

基于以上筆者推測在相關(guān)因素刺激下OB的JAK/STAT3信號通路活性異常參與了OP的進展,而LiCl通過對該信號通路活性的調(diào)控最終延緩了OP的進程。本研究擬以O(shè)VX小鼠作為觀察對象,通過動物模型建立、OB培養(yǎng),結(jié)合LiCl干預(yù),初步探討LiCl對JAK/STAT3信號通路活性的調(diào)控作用以及防治OP的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物:8周齡C57BL6/J小鼠24只(購自華北理工大學(xué)實驗動物中心,實驗動物生產(chǎn)和使用許可NCSTALBS014)。隨機將小鼠分為3組:假手術(shù)組(Sham組)、骨質(zhì)疏松模型組(OVX組)、氯化鋰干預(yù)組(OVX+LiCl組)。Sham組僅開腹后即縫合腹膜,而OVX與OVX+LiCl組則行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)。OVX+LiCl組每日進行LiCl(100 mg/kg)腹腔注射,而Sham組與OVX組則給予等體積鹽水注射,8周后取材。

1.1.2實驗細胞:8周齡健康C57BL6/J小鼠,1對2只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后配籠繁殖,取新生3 d的乳鼠備用。采用DMEM培養(yǎng)基在體積分數(shù)為10%的無菌胎牛血清、1%的青-鏈霉素的培養(yǎng)液中以植塊法培養(yǎng)原代OB,傳代培養(yǎng)至第2代后,取對數(shù)生長期細胞進行實驗,將細胞分為空白對照組(Control組)和LiCl組兩組,實驗組給予5 mmol/L LiCl干預(yù)。

1.1.3主要試劑:0.9%氯化鈉注射液、PBS(北京索萊寶)、甲醛溶液、胰酶(北京索萊寶)、碘伏消毒液(500 mL)、NaOH顆粒、無水乙醇、二甲苯、低熔點石蠟(58℃～60℃)、高熔點石蠟(62℃～67℃)、一抗體稀釋液(上海博士德)、DAB顯色試劑盒(中杉金橋)、二抗 PV-6001試劑盒(中杉金橋)、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑(上海博士德)。

1.2 實驗方法

1.2.1樣本采集:將右側(cè)股骨和脛骨在4%的甲醛中固定;兩天后右側(cè)脛骨轉(zhuǎn)移至70%乙醇中4℃保存用以Micro-CT分析骨微結(jié)構(gòu);左側(cè)股骨迅速用0.9%氯化鈉溶液浸潤的無菌紗布包裹,在-80℃凍存,用于三點彎曲試驗。

1.2.2脛骨Micro-CT檢測:掃描Micro-CT采用8.99μm3的分辨率,采用Bruker公司(比利時)的Sky Scan1176型Micro-CT進行,松質(zhì)骨感興趣區(qū)域為小鼠右側(cè)脛骨生長板下50層,整個區(qū)域的厚度為0.5 mm;皮質(zhì)骨的感興趣區(qū)域從松質(zhì)骨所選區(qū)域后200層開始,繼續(xù)計數(shù)100層。分析時使用Bruker公司所兼容的軟件進行。

1.2.3股骨三點彎曲試驗:將標本放在試驗機支撐物中心,跨距為8 mm。設(shè)定參數(shù)值2 N,2 mm/min的恒定位移速率,試驗機停止的終點為股骨斷裂。整個實驗操作采用SHIMDZU日本公司的萬能電子試驗機進行,主要指標包括最大載荷和最大應(yīng)力。

這第二種“正在形成或者繼續(xù)重建”的結(jié)構(gòu)與存在論中的建構(gòu)結(jié)構(gòu)似乎具有某些相通之處。前提是，如果我們以存在主義觀點而非生物主義觀點來給這第二種結(jié)構(gòu)定下基調(diào)——從人的活動即“此在”結(jié)構(gòu)出發(fā)，就可以將“民間故事活動”看成一個“開放的活的”結(jié)構(gòu)系統(tǒng)，始終處于未封閉的形成過程中，并通過不斷的交流進行調(diào)節(jié)達到暫時平衡。[注]此觀點詳見張瓊潔《當(dāng)代民間故事活動價值發(fā)生研究》，《民族文學(xué)研究》，2018年，第1期。

1.2.4免疫組織化學(xué)染色檢測P-STAT3、JAK2、STAT3蛋白表達情況:將Micro-CT檢測完的脛骨標本脫鈣完成后,脫蠟水化,抗原修復(fù),阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,一抗、二抗孵育,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,封固,顯微鏡下觀察染色結(jié)果。本實驗應(yīng)用圖像分析專業(yè)軟件Image Pro Plus(Med.Cybern,Inc,US)對圖片進行分析,免疫組化染色強度用平均光密度(IOD/mm2)表示。由3人組成的實驗小組自主獨立采集數(shù)據(jù),取3人平均值進行分析。

1.2.5CCK8法檢測原代OB的增殖活性:待第二代的OB生長密度為80%～85%時,消化后以每孔3×103cell/mm2的密度接種于96孔板中,分為4組,每組設(shè)置7個復(fù)孔,24 h之后將培養(yǎng)基分別更換為不含LiCl、含LiCl(2.5、5、10 mmol/L)的培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱保持37℃,5%CO2的環(huán)境,分別繼續(xù)培養(yǎng)1、3、5 d后,每孔加入10 μL的CCK8檢測試劑,避光孵育1 h,放置到酶標儀中在波長450 nm處檢測,測量吸光度(OD值)。

1.2.7茜素紅染色檢測OB分化能力:茜素紅染色步驟同ALP染色,確認染色良好后進行光鏡下觀察并照相。隨后進行半定量檢測,每孔加入1 mL 10%氯化十六烷基吡啶置在37℃溫箱下放30 min,然后吸掉上清,使用分光光度計,在波長560 nm處測樣本吸光值,用氯化十六烷基吡啶溶液調(diào)零。

1.2.8實時熒光定量PCR檢測OB中STAT3 和OCN mRNA水平:提取總RNA后進行純度以及濃度檢測,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,Real-time PCR反應(yīng),根據(jù)Takara說明書進行操作,檢測骨鈣素(osteocalcin,OCN)和STAT3 mRNA的表達。各基因的引物序列見表1,由吉瑪公司設(shè)計、合成。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real-time PCR

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié)果數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計計算,全部計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較用單因素方差分析,P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨形態(tài)學(xué)參數(shù)

Mirco-CT分析結(jié)果見表2,三維重建結(jié)構(gòu)見圖1。松質(zhì)骨結(jié)果顯示,OVX 組的BMD、骨體積(bone volume,BV)、骨小梁相對體積(bone volume/tissue volume,BV/TV)、骨小梁數(shù)量(trabecular number,Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)均顯著低于Sham組(P<0.05);OVX+LiCl組的BMD、BV、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均明顯低于Sham組(P<0.05);與OVX組相比,OVX+LiCl組的BMD和Tb.Sp顯著升高(P<0.05)。皮質(zhì)骨結(jié)果顯示,OVX+LiCl組和OVX組的皮質(zhì)骨面積(cortical bone area,Ct.Ar)較Sham組明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),OVX+LiCl組相較于OVX組和Sham組Ct.Po顯著升高(P<0.05)。

圖1 干預(yù)2個月后各組三維骨重建情況注:A:Sham組;B:OVX組;C:LiCl組。Fig.1 Three-dimensional bone reconstruction in each group after 2 months of interventionA: Sham group; B: OVX group; C: LiCl group.

表2 各組松質(zhì)骨、皮質(zhì)骨參數(shù)Table 2 Cancellous and cortical bone parameters in each group n=6)

2.2 LiCl對骨骼力學(xué)的影響

OVX 組的最大載荷、最大應(yīng)力均明顯低于Sham組(P<0.05),OVX+LiCl組的最大載荷、最大應(yīng)力較OVX組明顯升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組LiCl對骨骼力學(xué)的影響Table 3 Effects of lithium chloride on the skeletal mechanics in each group n=6)

2.3 P-STAT3、JAK2、STAT3蛋白表達情況

P-STAT3、JAK2、STAT3的蛋白主要分布于骨小梁表面OB內(nèi)。免疫組織化學(xué)染色定量分析檢測P-STAT3的表達分析結(jié)果示OVX組的平均光密度均明顯低于Sham組(P<0.05),OVX+LiCl組的平均光密度較OVX組明顯升高(P<0.05)。JAK2、STAT3的表達分析結(jié)果示OVX+LiCl 組的平均光密度較OVX組明顯升高(P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 干預(yù)2個月后各組P-STAT3、JAK2、STAT3蛋白免疫組織化學(xué)染色情況(光鏡下400倍放大)Fig.2 Immunohistochemical staining of P-STAT3, JAK2, and STAT3 proteins in three groups after 2 months of intervention (scale bar: 400× magnification)

表4 干預(yù)2個月后各組P-STAT3、JAK2、STAT3蛋白表達情況Table 4 Protein levels of P-STAT3, JAK2, and STAT3 in three groups after 2 months of intervention IOD/mm2, n=3)

2.4 LiCl增強OB增殖能力

在第3、5天,2.5 mmol/L LiCl組的OB增殖顯著高于Control組(P<0.05)。而每個時間點5 mmol/L LiCl組的OB增殖顯著高于Control組(P<0.05),故后續(xù)實驗LiCl濃度均為5 mmol/L。見表5。

表5 各組LiCl增強OB增殖能力Table 5 Lithium chloride enhances the proliferation of osteoblasts in each group n=7)

2.5 LiCl增強OB分化能力

LiCl組的ALP活性顯著升高,與Control組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3、表6。LiCl組的茜素紅染色可見紅色礦化鈣結(jié)節(jié)形成,LiCl組的紅色礦化結(jié)節(jié)較多,而Control組只可見少量礦化結(jié)節(jié),見圖4、表6。

圖3 兩組OB細胞ALP染色情況(光鏡下100倍放大)注:A:Control組;B:LiCl組。Fig.3 Results of ALP staining of OB in two groups (scale bar: 100× magnification)A: Control group; B: LiCl group.

圖4 兩組OB茜素紅染色結(jié)果(光鏡下100倍放大)注:A:Control組;B:LiCl組。Fig.4 Results of Alizarin red staining of OB in two groups (Scale bar: 100× magnification)A: Control group; B: LiCl group.

表6 各組LiCl增強OB分化能力Table 6 Lithium chloride enhances the differentiation of osteoblasts in each group n=3)

2.6 STAT3和OCN mRNA水平檢測結(jié)果

用LiCl干預(yù)OB 7 d,與Control組相比,LiCl組的STAT3 mRNA和OCN mRNA表達顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表7。

表7 各組OB中STAT3 mRNA和OCN mRNA水平檢測結(jié)果Table 7 The results of STAT3 mRNA and OCN mRNA levels n=3)

3 討論

OP的重要危險因素包括抑郁癥,與健康者相比,絕經(jīng)后女性精神障礙患者BMD顯著降低[12-13]。研究表明,LiCl治療精神障礙患者的同時,其骨量增加,骨轉(zhuǎn)化率降低[14]。JAK/STAT3信號通路激活可以逆轉(zhuǎn)OVX小鼠的骨丟失[15]。初步探討LiCl對JAK/STAT3信號通路的作用,可以更深入地研究LiCl的作用機制,使其更好地應(yīng)用于臨床,在治療精神障礙疾病的同時亦可預(yù)防OP發(fā)生。

Micro-CT的指標能夠間接反映骨代謝狀況,是皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨骨量評價常用的指標[16-18]。本實驗Micro-CT的結(jié)果顯示,OVX+LiCl組相較于OVX組BV/TV增加,Tb.Sp降低,說明LiCl干預(yù)后BV/TV升高,Tb.Sp降低,OP程度有較明顯改善。但在Bai等[19]的研究中,LiCl對Tb.N、Tb.Sp、SMI等參數(shù)的改善作用更為顯著,這可能和本研究所選用的LiCl的劑量以及實驗動物的種屬有關(guān)。Zhang等[20]認為100 mg/kg的LiCl干預(yù)小鼠可以抑制GSK3β的表達,因此本研究選用了該劑量,根據(jù)上述結(jié)果,100 mg/kg的LiCl可能并非干預(yù)小鼠的最適劑量。

皮質(zhì)骨的結(jié)構(gòu)和材料參數(shù)對于骨骼的力學(xué)性能更具有決定意義[21]。提高Ct.Po會降低骨強度,Ct.Po增加4%可導(dǎo)致骨裂隙提高84%[22]。而Ct.Po從4%升高到10%會使骨靜態(tài)壓縮載荷下降50%[23]。Ct.Po從4%升高到20%時,未產(chǎn)生裂隙前的骨應(yīng)力會降低3倍[24]。本實驗OVX+LiCl組同OVX組相比,Ct.Po顯著降低,而生物力學(xué)的最大載荷和最大應(yīng)力均明顯升高,說明Ct.Po降低時生物力學(xué)的最大載荷和最大應(yīng)力會顯著升高,這表明LiCl對OP的皮質(zhì)骨的骨重建是有一定療效的,而Sham組和OVX組相比,無顯著差異的原因可能和不同狀態(tài)下骨組織的結(jié)構(gòu)及代謝調(diào)節(jié)機制有關(guān)。

利拉魯肽通過活化STAT3對糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝產(chǎn)生正向作用[25]。也有研究認為JAK2/STAT3信號通路對OP的作用是負向的,JAK2/STAT3信號途徑可以降低BMD,抑制骨小梁形成從而促進OP的發(fā)生[26]。有文獻提出,LiCl降低了P-STAT3的表達,從而抑制了STAT3的活性[27]。在本研究中,免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn),OVX+LiCl組JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達較OVX組顯著升高,表明LiCl對OVX小鼠骨丟失的抑制作用可能與其對JAK2/STAT3信號通路的調(diào)控有關(guān),但該信號通路在此過程中是否發(fā)揮關(guān)鍵作用尚有待進一步實驗證實。

此外,觀察不同濃度LiCl干預(yù)相同時間后OB活性的變化,結(jié)果顯示LiCl在2.5、5 mmol/L濃度對OB的生長均有不同程度的促進作用,隨著干預(yù)濃度的增加,OB活性相較于空白組降低,10 mmol/L對OB生長的促進作用最弱,但仍然對OB存在促進增殖的效果。這一結(jié)果同Laiuppa等[28]發(fā)現(xiàn)在體外環(huán)境培養(yǎng)下,低濃度LiCl可以促進大鼠脂肪干細胞增殖類似,證實在一定劑量范圍內(nèi),LiCl以劑量依賴的方式促進OB增殖。

OB是骨形成的主要功能細胞,負責(zé)細胞外基質(zhì)的合成、分泌和礦化[29-30]。因此,本實驗通過ALP和茜素紅染色評估LiCl對OB 功能的影響,證明LiCl能增強ALP的活性和表達以及促進礦化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生。OCN mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白合成是OB分化成熟進入礦化期的主要指征之一[31]。本實驗LiCl處理OB培養(yǎng)7 d后,LiCl組OB中OCN mRNA表達升高,表明LiCl能促進OB中OCN的表達。此外,LiCl干預(yù)7 d后,OB中STAT3 mRNA表達顯著高于對照組,提示LiCl可以對OB中的STAT3基因起到促進作用,以上結(jié)果和Shi等[32]的研究LiCl能夠調(diào)節(jié)miR-337對STAT3的抑制效果類似。

本研究結(jié)果表明LiCl尚未達到最適劑量,然而LiCl治療量與中毒量很接近,當(dāng)血鋰濃度過高時可能誘發(fā)中毒反應(yīng),選擇恰當(dāng)劑量的LiCl既能達到治療效果又可避免中毒反應(yīng),對于公共衛(wèi)生預(yù)防和臨床應(yīng)用仍是需要進一步探討的話題。

綜上,LiCl通過調(diào)控OB改善OVX小鼠骨量和骨微結(jié)構(gòu),其機制可能與調(diào)節(jié)JAK/STAT3信號通路有關(guān),但該信號通路在其中是否發(fā)揮關(guān)鍵作用,LiCl對骨代謝尤其是OB功能的影響是否有其他信號通路的參與,仍有待進一步研究。