李高峰 王藝昧 李光淳 張揚(yáng) 王博 杜彥輝 桑平*

1.吉林省人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨病二科,吉林 長(zhǎng)春 130021 2.吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)院病理科,吉林 長(zhǎng)春 130021

骨質(zhì)疏松癥是一種全身性骨代謝疾病,在絕經(jīng)后女性及老年人群中發(fā)病率較高[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2],骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率在我國(guó)50歲以上人群中為19.2%,且女性發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于男性,尤其是65歲以上女性人群中發(fā)病率高達(dá)51.6%。絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥常用的治療方法是補(bǔ)充雌激素,但會(huì)使子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等激素依賴性腫瘤及心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加[3]。降鈣素、雙膦酸鹽等藥物也用于絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥的防治,但長(zhǎng)期使用會(huì)出現(xiàn)胃腸道不適、乏力、頭暈及惡心、嘔吐等明顯的毒副作用,且遠(yuǎn)期療效難以讓人滿意[4]。近年來,中藥由于具有多靶點(diǎn)、多通路及多途徑的作用特點(diǎn),加之毒副作用較低,在防治絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥領(lǐng)域逐漸引起了眾多研究者的關(guān)注[5-6]。

人參為五加科人參屬植物,是我國(guó)名貴的中藥材,應(yīng)用歷史悠久。人參的主要活性物質(zhì)包括皂苷、揮發(fā)油、多糖及黃酮等,具有抑制腫瘤生長(zhǎng)、抗衰老、改善糖脂代謝紊亂、增加免疫力、保護(hù)心腦血管、興奮神經(jīng)中樞及抗疲勞等生物學(xué)功能[7]。人參防治骨質(zhì)疏松作用也多見報(bào)道[8]。馬偉鳳等[9]研究發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rg3能夠改善骨質(zhì)疏松老年大鼠骨微結(jié)構(gòu)、提高骨密度,其可能是通過調(diào)節(jié)自噬發(fā)揮骨保護(hù)作用。Kang等[10]研究證實(shí),去卵巢小鼠經(jīng)人參與甘藍(lán)聯(lián)合治療后,骨質(zhì)疏松癥得到明顯改善。人參多糖作為人參中的主要水溶性功效物質(zhì),其提升免疫能力、加快新陳代謝速度、降低氧化應(yīng)激水平及抑制炎癥反應(yīng)等活性已被證實(shí),但其是否具有改善絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥作用目前未見報(bào)道[11-12]。因此,本研究選擇去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型,探究人參多糖是否具有改善去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松作用及潛在機(jī)制,以期為人參多糖應(yīng)用于絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥的防治及人參多糖的綜合開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物:雌性SPF級(jí)SD大鼠50只,體質(zhì)量(200±20) g,購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(吉)2021-0001]。大鼠飼養(yǎng)于吉林大學(xué)藥學(xué)院[SYXK(吉)2022-0017],自由飲水進(jìn)食,環(huán)境濕度45%～50%,環(huán)境溫度21℃～25℃,每5 min換氣通風(fēng)1次,每12 h光暗交替。本研究經(jīng)吉林省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批,各項(xiàng)操作均符合3R原則。

1.1.2主要試劑:人參多糖(批號(hào)BNK062),含量≥80%,西安百年康生物科技有限公司;阿侖膦酸鈉維生素D3(國(guó)藥準(zhǔn)字H20110079),規(guī)格70 mg/片,石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司;蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(批號(hào):M027),上海歌凡生物科技有限公司;耐酒石酸酸性磷酸酶-5b(TRAP-5b)、骨堿性磷酸酶(BALP)、骨鈣素(OC)及骨保護(hù)素(OPG)檢測(cè)試劑盒(批號(hào):H415-1、H234、H152-1-2及H286),南京建成生物工程研究所;Wnt3、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)及β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)多克隆抗體(批號(hào):ab32249、ab32249、ab23981及ab8227),美國(guó)Abcam公司;IgG二抗(批號(hào):C86-SSA004),上海創(chuàng)賽科技有限公司。

1.1.3主要儀器:BT25S型分析天平,德國(guó)Sartorius公司;TGL-16M型高速冷凍臺(tái)式離心機(jī),上海盧湘儀離心機(jī)儀器公司;STM7-BSW型顯微鏡,日本Olympus公司;Xpert/parameter型小動(dòng)物高分辨率全自動(dòng)X光機(jī),美國(guó)KUBTEC公司;3510-AT型生物力學(xué)儀,美國(guó)BOSE公司;Mk3型酶標(biāo)儀,美國(guó)Thermo公司;BC-2800型小動(dòng)物全自動(dòng)生化分析儀,深圳邁瑞生物醫(yī)療公司;JY-ZY5型電泳儀及JY-SCZ2型轉(zhuǎn)膜儀,北京君意東方電泳儀器公司;HW08921型成像儀,上海勤翔科學(xué)設(shè)備公司。

1.2 方法

1.2.1造模及分組:將已適應(yīng)環(huán)境1周的SD大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、人參多糖低、高劑量組(100、200 mg/kg)及阿侖膦酸鈉維生素D3組(6.25 mg/kg),每組10只,人參多糖的劑量參考文獻(xiàn)[13],阿侖膦酸鈉維生素D3的劑量參考文獻(xiàn)[14]。模型組、人參多糖低、高劑量組及阿侖膦酸鈉維生素D3組大鼠均切除雙側(cè)卵巢,假手術(shù)組大鼠僅切除卵巢周圍脂肪組織。術(shù)后注射青霉素預(yù)防感染,同時(shí)恢復(fù)性飼養(yǎng)1周后,開始灌胃給予人參多糖或阿侖膦酸鈉維生素D3,每天1次,連續(xù)12周。假手術(shù)組及模型組用相同體積的蒸餾水灌胃,每周記錄各組大鼠體質(zhì)量。

1.2.2樣本收集:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,腹腔注射1%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈采血。在冰上放置30 min后,低溫離心(2 000 r/min,20 min),吸取上清液,分裝后置于-80℃冰箱中保存。用手術(shù)剪刀分離脛骨及股骨,左側(cè)脛骨用4%甲醛溶液固定,右側(cè)脛骨及雙側(cè)股骨均在-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3指標(biāo)檢測(cè):(1)骨組織病理形態(tài)觀察。各組大鼠左側(cè)脛骨在4%甲醛溶液中固定2周,先后經(jīng)脫鈣、包埋、切片等操作,行HE染色,在顯微鏡下觀察人參多糖對(duì)骨組織病理形態(tài)的影響。(2)骨密度檢測(cè)。取各組大鼠左側(cè)股骨,通過小動(dòng)物高分辨率全自動(dòng)X光機(jī)對(duì)各組大鼠股骨骨密度進(jìn)行檢測(cè)。(3)骨生物力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。使用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組大鼠右側(cè)股骨長(zhǎng)度,在生物力學(xué)儀中將股骨標(biāo)本固定,壓頭以2 mm/min速度下降,直至股骨斷裂為止,記錄剛度、最大應(yīng)力及最大載荷等數(shù)據(jù)。(4)血清骨代謝指標(biāo)及生化指標(biāo)檢測(cè)。取-80℃冰箱中凍存的血清,按照試劑盒說明書的操作步驟,血清TRAP-5b、BALP、OC及OPG等骨代謝指標(biāo)的檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法;通過小動(dòng)物全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清P3+、Ca2+等生化指標(biāo)。(5)骨組織Wnt3、β-catenin及Runx2表達(dá)檢測(cè)。取各組大鼠右側(cè)脛骨100 mg,加入1 mL RIPA裂解液,提取總蛋白,并通過BCA法測(cè)總蛋白含量。取20 μg蛋白樣品行SDS-PAGE電泳,電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜,用5%脫脂奶粉封閉。TBST洗膜后,加入稀釋2 000倍的Wnt3、β-catenin、Runx2及β-actin多克隆抗體,在4℃環(huán)境下放置過夜。TBST洗膜后,再加入稀釋5 000倍的IgG二抗,在室溫環(huán)境下放置2 h。采用化學(xué)發(fā)光法顯色,并通過Image J軟件分析凝膠條帶灰度值,計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 人參多糖對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠體質(zhì)量的影響

造模前,各組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);造模后,假手術(shù)組大鼠體質(zhì)量緩慢穩(wěn)步增長(zhǎng),模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)迅速,與假手術(shù)組比較,從第4周開始模型組大鼠體質(zhì)量明顯升高(P<0.05,P<0.01)。人參多糖低、高劑量組及阿侖膦酸鈉維生素D3組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)速度慢于模型組,與模型組比較,人參多糖低、高劑量組大鼠體質(zhì)量從第8周開始、阿侖膦酸鈉維生素D3組從第4周開始均明顯降低(P<0.05,P<0.01),見表1。

表1 人參多糖對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of ginseng polysaccharide on the body mass in osteoporosis rats n=10)

2.2 人參多糖對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨組織病理形態(tài)的影響

假手術(shù)組大鼠骨組織形態(tài)正常;模型組大鼠骨小梁間隙變寬,骨小梁疏松變薄;人參多糖低、高劑量組及阿侖膦酸鈉維生素D3組大鼠骨小梁連接和數(shù)量增加明顯,其中人參多糖高劑量組及阿侖膦酸鈉維生素D3組大鼠骨小梁接近正常,見圖1。

圖1 各組大鼠骨組織病理形態(tài)(HE,×200)Fig.1 Histopathologic morphology of the bone in each group (HE, ×200)

2.3 人參多糖對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠骨密度降低了20.39%(P<0.01);與模型組比較,人參多糖低、高劑量組及阿侖膦酸鈉維生素D3組大鼠骨密度分別增加了8.81%、11.28%及18.57%(P<0.01),見表2。

表2 人參多糖對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響Table 2 Effect of ginseng polysaccharide on bone mineral density in osteoporosis rats n=10)

2.4 人參多糖對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨生物力學(xué)指標(biāo)的影響

人參多糖對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨生物力學(xué)指標(biāo)剛度、最大應(yīng)力及最大載荷等的影響見表3。模型組大鼠剛度、最大應(yīng)力及最大載荷與假手術(shù)組比較均明顯下降(P<0.01);與模型組比較,人參多糖低、高劑量組及阿侖膦酸鈉維生素D3組大鼠剛度、最大應(yīng)力及最大載荷均明顯增加(P<0.05,P<0.01)。

表3 人參多糖對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨生物力學(xué)指標(biāo)的影響Table 3 Effect of ginseng polysaccharide on bone biomechanical indexes in osteoporosis rats n=10)

2.5 人參多糖對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠血清骨代謝指標(biāo)的影響

人參多糖對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠血清骨代謝指標(biāo)TRAP-5b、BALP、OC及OPG等的影響見表4。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清TRAP-5b含量明顯升高(P<0.01),而BALP、OC及OPG含量明顯降低(P<0.01);與模型組比較,人參多糖低、高劑量組及阿侖膦酸鈉維生素D3組大鼠血清TRAP-5b含量明顯降低(P<0.05,P<0.01),而BALP、OC及OPG含量明顯升高(P<0.01)。

表4 人參多糖對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠血清骨代謝指標(biāo)的影響Table 4 Effect of ginseng polysaccharide on the serum bone metabolism indexes in osteoporosis rats n=10)

2.6 人參多糖對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠血清生化指標(biāo)的影響

人參多糖對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠血清生化指標(biāo)P3+、Ca2+等含量的影響見表5。模型組大鼠血清P3+、Ca2+含量與假手術(shù)組比較均明顯下降(P<0.01);與模型組比較,人參多糖低、高劑量組及阿侖膦酸鈉維生素D3組大鼠血清P3+、Ca2+含量均明顯增加(P<0.05,P<0.01)。

表5 人參多糖對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠血清生化指標(biāo)的影響Table 5 Effect of ginseng polysaccharide on the serum biochemical indexes in osteoporosis rats n=10)

2.7 人參多糖對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨組織Wnt3、β-catenin及Runx2表達(dá)的影響

采用Western blot法檢測(cè)人參多糖對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨組織Wnt3、β-catenin及Runx2表達(dá)的影響,見圖2及表6。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠骨組織Wnt3、β-catenin及Runx2表達(dá)均明顯下降(P<0.01);與模型組比較,人參多糖低、高劑量組及阿侖膦酸鈉維生素D3組大鼠骨組織Wnt3、β-catenin及Runx2表達(dá)均明顯增加(P<0.05,P<0.01),提示人參多糖具有激活去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠Wnt3/β-catenin/Runx2信號(hào)通路的作用。

圖2 各組大鼠骨組織Wnt3、β-catenin及Runx2表達(dá)Fig.2 Expressions of Wnt3, β-catenin, and Runx2 in the bone tissue of rats in each group

表6 人參多糖對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨組織Wnt3、β-catenin及Runx2表達(dá)的影響Table 6 Effect of ginseng polysaccharide on the expressions of Wnt3, β-catenin, and Runx2 of the bone tissue in osteoporosis rats

3 討論

雌激素水平下降,機(jī)體的骨形成弱于骨吸收,進(jìn)而使骨穩(wěn)態(tài)失衡是導(dǎo)致絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的首要原因[15]。去卵巢大鼠常用于模擬絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥,該方法具有操作簡(jiǎn)便易行、重復(fù)性好、周期較短及成功率高等優(yōu)點(diǎn),是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局和世界衛(wèi)生組織推薦的經(jīng)典模型[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),去卵巢模型組大鼠骨小梁間隙變寬、骨小梁疏松變薄,骨密度及剛度、最大應(yīng)力、最大載荷等骨生物力學(xué)指標(biāo)下降,較好地模擬了絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥的病理特征,提示模型復(fù)制成功。既往研究發(fā)現(xiàn),去卵巢后機(jī)體雌激素水平驟減,反饋性導(dǎo)致腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn),引起激素分泌紊亂,使糖脂代謝能力下降,進(jìn)而造成體質(zhì)量增加[17];本研究中的去卵巢模型組大鼠體質(zhì)量明顯增加,進(jìn)一步表明成功建立了大鼠骨質(zhì)疏松癥模型。骨密度是診斷骨質(zhì)疏松癥的重要指標(biāo),其含量下降預(yù)示骨折及患骨質(zhì)疏松癥風(fēng)險(xiǎn)增加;剛度、最大應(yīng)力、最大載荷等骨生物力學(xué)指標(biāo)可以反映骨骼抵抗彎曲變形能力及抵抗外力的最大力量,相關(guān)指標(biāo)降低說明骨折出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)增加[18]。去卵巢大鼠經(jīng)低、高劑量的人參多糖連續(xù)干預(yù)12周后發(fā)現(xiàn),人參多糖低、高劑量組大鼠體質(zhì)量下降,骨小梁連接和數(shù)量增加,骨密度及剛度、最大應(yīng)力、最大載荷等增加,表明人參多糖具有改善去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的作用。

TRAP是評(píng)價(jià)骨吸收速率的生物標(biāo)志物,主要由破骨細(xì)胞分泌;BALP、OC為反映骨形成的重要指標(biāo),主要由成骨細(xì)胞分泌;OPG的主要作用是增加骨強(qiáng)度、骨密度及抑制骨吸收[19]。既往研究發(fā)現(xiàn),升高BALP、OC含量,促進(jìn)OPG表達(dá),抑制TRAP活性,是多種藥物治療骨質(zhì)疏松癥的重要策略[20]。血清P3+、Ca2+等是骨轉(zhuǎn)換的常見指標(biāo),當(dāng)血清P3+、Ca2+含量降低時(shí)預(yù)測(cè)可能存在骨丟失,其可作為間接反映骨質(zhì)疏松嚴(yán)重程度的指標(biāo),而增加血清P3+、Ca2+含量是緩解骨質(zhì)疏松癥的有效途徑[21]。人參中的皂苷成分可以通過增加BALP、OC、OPG含量及減少TRAP含量等改善骨質(zhì)疏松癥狀[8-9,22];人參根飲液對(duì)模型大鼠骨質(zhì)疏松的改善作用與調(diào)節(jié)P3+及Ca2+含量有關(guān)[23]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),人參多糖各劑量組大鼠血清TRAP-5b含量減少,而BALP、OC、OPG及P3+、Ca2+含量升高,表明人參多糖可以調(diào)節(jié)骨代謝及增加骨礦鹽含量,進(jìn)一步提示其具有改善去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的作用。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生中具有關(guān)鍵性作用,其與骨重建和骨形成均密切相關(guān),因此調(diào)控該信號(hào)通路對(duì)于改善骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和進(jìn)展有著積極意義[24-26]。Wnt活化后可促進(jìn)β-catenin與淋巴增強(qiáng)因子/T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而形成復(fù)合體,從而進(jìn)一步上調(diào)下游靶基因Runx2的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄[27]。Runx2可使各種礦化相關(guān)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)增加,促進(jìn)成骨向分化[28]。研究發(fā)現(xiàn),破骨細(xì)胞中的β-catenin被條件敲除時(shí),可導(dǎo)致骨吸收程度顯著增加;刺激β-catenin過量表達(dá),則能夠使骨量升高,提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路可抑制骨吸收,進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化和分化[29]。周哲人等[30]研究發(fā)現(xiàn),木犀草素和柚皮苷均可以上調(diào)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中β-catenin和Runx2 mRNA的表達(dá),誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。白堅(jiān)木醇也能夠促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞中β-catenin和Runx2 mRNA及蛋白的表達(dá),其促進(jìn)成骨細(xì)胞形成的機(jī)制與Wnt/β-catenin/Runx2信號(hào)通路有關(guān)[31]。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn),人參多糖低、高劑量組大鼠骨組織Wnt3、β-catenin及Runx2表達(dá)均明顯增加,表明其可能通過激活Wnt3/β-catenin/Runx2信號(hào)通路發(fā)揮改善去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松作用。

綜上所述,人參多糖可以減輕去卵巢大鼠骨組織病理形態(tài),增加骨密度及骨生物力學(xué)指標(biāo),調(diào)節(jié)骨代謝,升高骨礦鹽含量,具有改善骨質(zhì)疏松作用。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),人參多糖改善去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松作用可能與激活Wnt3/β-catenin/Runx2信號(hào)通路有關(guān)。本研究的相關(guān)結(jié)果將為骨質(zhì)疏松癥的防治提供新的手段和方法,也將有利于人參多糖的綜合開發(fā)應(yīng)用。