宋敏 胡陽 李凱 劉路 李金益

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,甘肅 蘭州 730000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)是臨床常見的慢性、退行性、骨代謝疾病,呈現(xiàn)出基數(shù)大、預(yù)后差、不可逆性等特點,多發(fā)生于絕經(jīng)后女性,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。OP前期無明顯癥狀,疾病發(fā)生發(fā)展常不易察覺,診斷率低;OP中后期會出現(xiàn)明顯的臨床表現(xiàn),如全身疼痛、乏力及肌肉痙攣,勞累后加重,嚴(yán)重者可造成脆性骨折[2]。臨床治療OP的常用藥物包括雙膦酸鹽、雌激素、甲狀旁腺素和降鈣素,然而上述藥物可能會引起許多副作用,如胃腸道不良反應(yīng)、關(guān)節(jié)疼痛和腿部痙攣,長期療效欠佳[3]。因此,尋找潛在的藥物治療OP,刺激骨形成,是一個亟待解決的問題。

傳統(tǒng)中藥及復(fù)方由于其多成分和多靶點的特性,在促進(jìn)骨形成方面具有獨特的優(yōu)勢[4]。本課題組基于理論基礎(chǔ)和多年臨床經(jīng)驗,認(rèn)為“脾腎虛弱、氣虛血瘀”是本病發(fā)生的關(guān)鍵病機,并擬定防治OP經(jīng)驗方固本增骨方,其具有補益脾腎、益氣活血的功效,臨床治療安全有效[5-6]。前期研究發(fā)現(xiàn),固本增骨方可通過調(diào)節(jié)腸道菌群,發(fā)揮類雌激素作用改善骨質(zhì)疏松,對OP模型大鼠的骨代謝指標(biāo)及骨密度有所提升[7-8]。固本增骨方也通過Wnt/β-catenin、Notch、BMP-Smads等通路調(diào)控成骨細(xì)胞的分化及增殖,但對于ERK/Smad通路的實驗研究還未涉及[9-11]。ERK和Smad信號傳導(dǎo)間的串?dāng)_聯(lián)系之前就有描述[12-13],最近的研究顯示,ERK活性增加可促進(jìn)Smad介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄,減少骨流失[14]。其他研究表明,ERK抑制劑可以下調(diào)Smad相關(guān)蛋白的表達(dá)并影響骨形成[15]。補腎固本方在預(yù)防SAMP6大鼠骨丟失,還增加了成骨特異性因子Runx2的表達(dá),改善骨小梁結(jié)構(gòu),與激活ERK/Smad信號通路調(diào)控骨代謝平衡有關(guān)[16]。

因此,本研究通過觀察固本增骨方對去卵巢OP模型大鼠干預(yù)效果,探討固本增骨方與ERK/Smad信號通路之間的聯(lián)系,揭示其防治骨質(zhì)疏松癥的藥理學(xué)效應(yīng),為固本增骨方的基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:SPF級Wister雌性大鼠60只,12周齡,體重(200±20)g,由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心[SCXK(甘)2020-0001]提供。在甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物管理中心SPF級實驗環(huán)境進(jìn)行飼養(yǎng)與實驗,溫度22 ℃～26 ℃,空氣濕度 50 %～60 %,每籠6只,光照時間:12 h為一循環(huán),自由進(jìn)食和飲水。實驗項目已通過甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理審查,文件批號:2021-061。

1.1.2實驗藥物與試劑:固本增骨方:當(dāng)歸12 g (批號:21047501)、炙黃芪30 g (批號:21037851)、熟地黃12 g (批號:21018581)、燙狗脊12 g (批號:21007931)、烏藥9 g (批號:22005371)、黨參12 g (批號:21037991)、鹿角膠 6 g (批號:21007721)、炙淫羊藿9 g (批號:22017911)、鹽補骨脂12 g (批號:21039252)、酒肉蓯蓉12 g (批號:21036901)、土鱉蟲6 g (批號:1090803),由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥物制劑中心提供;戊酸雌二醇(美國拜耳醫(yī)藥保健公司,693A);BALP的ELISA試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司,批號:MM-0619R)、TRACP-5b的ELISA試劑盒(江蘇酶免,批號:MM-0406R);ERK抗體(1∶5 000,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,11257-1-AP);p-ERK抗體(1∶1 000,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,28733-1-AP);p-ERK抗體(1∶1 000,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,10231-1-AP)。

1.1.3實驗儀器:雙能X線骨密度儀(美國,GE Lunar,iDXA)、臺式電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器,WGL-30B)、化學(xué)發(fā)光成像儀(北京賽智科技,MiniChemi 610)、恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備,GNP9160)、酶標(biāo)儀(無錫華衛(wèi)德朗儀器,DR-200Bs)、實時定量PCR儀(美國,Life Technologies,QuantStudio 6 FlexSystem)、PCR儀(杭州博日科技,基因擴增儀TC-XP)、NanoDrop核酸濃度測量儀(美國塞默飛,L30000118)。

1.2 方法

1.2.1動物分組與處理:將60只SPF 級12周齡雌性Wister大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機分為假手術(shù)組、模型組、雌二醇組、固本增骨方低劑量組、固本增骨方中劑量組、固本增骨方高劑量組,每組10只。造模組、假手術(shù)組大鼠術(shù)前禁食、不禁水24 h后,向大鼠腹腔內(nèi)推注2 %戊巴比妥鈉溶液(0.2 mL/kg)進(jìn)行麻醉,除假手術(shù)組外,其余各組均摘除大鼠雙側(cè)卵巢建立骨質(zhì)疏松模型[17];術(shù)后傷口涂抹青霉素軟膏防止感染。采用雙能X射線骨密度儀檢測造模后8周的模型大鼠,骨密度(bone mineral density, BMD)峰值減少≥2.5 SD (標(biāo)準(zhǔn)差),提示造模成功。參考《中藥藥理研究方法學(xué)》,將固本增骨方按照成人劑量(體重為70 kg)換算為大鼠等效劑量[18],固本增骨方制成濃度為1.13 g/mL的混懸液,按照體表面積法換算(10 mL/kg藥液)后對固本增骨各組大鼠按2.26 g/kg進(jìn)行灌胃,假手術(shù)組和造模組用等體積生理鹽水灌胃,每日1次,每次2 mL,連續(xù)灌胃12周,最后一次給藥2 h后,用2%戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔注射麻醉,心臟穿刺采血,靜置30 min后,離心機3 000 r/m,37℃離心15 min,分離上層血清液,轉(zhuǎn)移至凍存管分組標(biāo)記,置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2骨質(zhì)量與骨密度檢測:分別于治療前后稱重,并采用雙能X線骨密度儀檢測大鼠股骨近端、L4～6腰椎骨密度,取平均值。

1.2.3骨代謝檢測:采用ELISA法檢測大鼠心臟動脈血血清中BALP和TARP-5b值。

1.2.4骨組織結(jié)構(gòu)變化檢測:大鼠采血完成后予頸椎脫臼法處死,取實驗大鼠股骨組織,常規(guī)固定、脫鈣、浸蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅分別染色,待不同梯度乙醇脫水后,固定封片后鏡檢。

1.2.5骨組織ERK1、ERK2、Smad4 mRNA檢測:將股骨組織加入液氮研磨,提取總RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及擴增,運用實時熒光定量PCR法檢測ERK1、ERK2、Smad4的 mRNA表達(dá)。引物詳見表1。DNA擴增條件:95 ℃預(yù)變性30 s后進(jìn)入PCR循環(huán),95 ℃變性15 s,58 ℃退火30 s, 延伸30 s,共40個循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后,數(shù)據(jù)利用 2-△△CT法計算結(jié)果,分析各組樣本mRNA的含量。

表1 引物序列Table 1 Primer Sequences

1.2.6Westbern Blot檢測骨組織ERK、p-ERK、Smad4的蛋白表達(dá):將股骨組織加入液氮研磨,BCA法蛋白定量,電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,加入5 %脫脂奶粉中封閉,室溫條件下封閉60 min。加入Smad4(1∶1 000)、EKR(1∶5 000)、p-ERK(1∶1 000)蛋白一抗的稀釋液中,4 ℃環(huán)境下過夜。TBST緩沖液洗滌3次,加入二抗(1:10 000),室溫孵育30 min,漂洗。滴加新鮮ECL,暗室中曝光,顯影定影,AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠造模前后情況變化

摘除卵巢后,各組大鼠整體狀況穩(wěn)定,在飼養(yǎng)籠內(nèi)自由活動、攝食飲水,造模手術(shù)傷口在術(shù)后1周左右恢復(fù)。術(shù)后假手術(shù)組大鼠恢復(fù)良好,精神欠佳,活動量減少,飲食及水量減少,反應(yīng)靈敏,有抵觸應(yīng)激反應(yīng),適應(yīng)期過后可緩解。造模組大鼠傷口恢復(fù)良好,但精神狀態(tài)變差,活動能力減弱,飲食及水量減少,傷口愈合后出現(xiàn)體重增加,反應(yīng)遲鈍,皮膚毛發(fā)色澤暗淡,激怒及其他行為活動減少。經(jīng)固本增骨方及戊酸雌二醇灌胃后,大鼠精神狀態(tài)、活動情況改善,飲食及水量正常,反應(yīng)靈敏,皮膚毛發(fā)色澤光亮,無激怒及異常行為。

2.2 大鼠體重及骨密度檢測結(jié)果

與假手術(shù)組大鼠相比,模型組的骨密度顯著降低(P<0.01);與模型組比較,固本增骨各劑量組及雌二醇組的骨密度顯著增加(P<0.01),骨密度隨固本增骨劑量增加而明顯增加,以高劑量組最為顯著;與高劑量組相比,低劑量組和中劑量組骨密度明顯降低(P<0.01,P<0.05),雌二醇組與高劑量組之間無明顯差異(P>0.05),如表2所示。

表2 各組大鼠干預(yù)完成后BMD的變化Table 2 Changes in BMD of rats in each group after intervention completion

2.3 固本增骨方對骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝標(biāo)志物的影響

與假手術(shù)組相比,模型組中血清骨源性堿性磷酸酶(BALP)含量顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,固本增骨各劑量組及雌二醇組BLAP含量明顯上升 (P<0.01,P<0.05);與高劑量組相比,低劑量組、中劑量組中BALP水平降低(P<0.05),雌二醇組血清中BALP的水平無明顯差異(P>0.05) ,抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(TRACP-5b)與之相反,見表3。

表3 血清中BALP及TRACP-5b水平Table 3 Levels of BALP and TRACP-5b in serum ng/mL)

2.4 固本增骨方對骨質(zhì)疏松骨結(jié)構(gòu)的影響

假手術(shù)組股骨下骨小梁結(jié)構(gòu)良好,骨骺下骨小梁數(shù)目多,骨小梁寬度和排列性好,骨小梁之間互聯(lián)成網(wǎng)狀;模型組鏡下骨骺下骨小梁呈現(xiàn)排列結(jié)構(gòu)錯亂,骨小梁厚度變細(xì)、數(shù)目減少,且骨小梁之間小梁間隙擴大,出現(xiàn)斷裂及不規(guī)則斷端,周圍骨母細(xì)胞增生及破骨細(xì)胞增生,髓腔內(nèi)脂肪滴明顯增多,骨質(zhì)疏松改變的典型圖像。與模型組對比,低劑量組與中劑量組基本大致相同,骨小梁結(jié)構(gòu)厚度變寬,周圍骨細(xì)胞的數(shù)目變多,骨小梁之間連接不完整,排列趨于完善;高劑量組的骨小梁數(shù)目增多,厚度增加,骨小梁之間形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),髓腔內(nèi)脂肪滴減少;雌二醇組的骨小梁呈現(xiàn)排列結(jié)構(gòu)正常,數(shù)目明顯增加,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。見圖1。

圖1 HE染色股骨切片(×200)Fig.1 HE staining of femoral slices(×200)

2.5 固本增骨方對骨質(zhì)疏松大鼠骨組織ERK1、ERK2、Smad4表達(dá)情況

通過RT-PCR檢測股骨組織ERK1、ERK2、Smad4的表達(dá),假手術(shù)組中ERK1、ERK2、Smad4的mRNA的表達(dá),均高于各實驗組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組對比,雌二醇組、固本增骨各劑量組的ERK1、ERK2、Smad4的mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05);與高劑量組相比較,中劑量組、低劑量組ERK1、ERK2、Smad4的mRNA明顯下降(P<0.05);高劑量組與雌二醇組之間無明顯差異(P>0.05)。見圖2。

圖2 各組ERK1、ERK2、Smad4基因表達(dá)Fig.2 Expression of ERK1, ERK2, and Smad4 mRNA in each group注:與假手術(shù)組相比,##P<0.01;與模型組比較,**P<0.01;與高劑量組比較,&&P<0.01。

2.6 固本增骨方對骨質(zhì)疏松大鼠骨組織ERK、p-ERK、Smad4蛋白表達(dá)情況

與假手術(shù)組相比較,模型組、固本增骨方各劑量組及雌二醇組ERK、p-ERK、Smad4蛋白水平顯著降低(P<0.01);與模型組相比較,雌二醇組、固本增骨各劑量組ERK、p-ERK、Smad4表達(dá)顯著增加(P<0.05);與高劑量組相比較,中劑量組、低劑量組ERK、p-ERK、Smad4蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),濃度呈依賴性上升;高劑量組與雌二醇組之間無差異(P>0.05)。見圖3。

圖3 各組ERK、p-ERK、Smad4蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of ERK, p-ERK, and Smad4 proteins in each group注:與假手術(shù)組相比,##P<0.01;與模型組比較,**P<0.01;與高劑量組比較,&&P<0.01。

3 討論

根據(jù)古代醫(yī)籍記載和臨床表現(xiàn),OP被歸屬為“骨痿”“骨枯”等范疇,中醫(yī)認(rèn)為該病發(fā)生與腎密切相關(guān),腎、肝、脾三臟的虛損會導(dǎo)致OP發(fā)生,瘀血是發(fā)病的契機[19]。固本增骨方是以西北特色道地藥材為主藥相配伍,起著溫補脾腎,益氣活血通經(jīng)的功效[20]?；A(chǔ)研究證實,固本增骨方可抑制血清中破骨標(biāo)志物的表達(dá),增加成骨標(biāo)志物的表達(dá),改善因雌激素減少引起的骨質(zhì)疏松,對骨量丟失具有治療效果[21-22]。大量研究表明,ERK、Smad4都參與了OP的發(fā)生,它們的激活促進(jìn)了成骨分化[23-24]。細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2通路是MAPK通路中重要信號通路之一,通過各種生長因子、過氧化氫等因素影響磷酸化,與細(xì)胞增殖及分化,骨骼的成長密切相關(guān)[25]。在維甲酸培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞中誘導(dǎo)成骨分化,p-ERK和p-SMAD1的表達(dá)降低,成骨增殖減少;而加入褪黑素后可激活ERK途徑可促進(jìn)成骨細(xì)胞中的Runx2,BMP-2和OCN成骨相關(guān)基因及蛋白的表達(dá),促進(jìn)骨形成,防治骨質(zhì)疏松癥[26]。研究發(fā)現(xiàn),激活ERK信號通路可增加骨密度,上調(diào)成骨基因表達(dá)、促成骨細(xì)胞的增殖與分化;反之,抑制該途徑則引起成骨基因及蛋白下降,骨形成受到抑制,表明ERK/Smad通路的激活可正向調(diào)控成骨細(xì)胞[27]。SMAD蛋白是轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號通路的關(guān)鍵內(nèi)效應(yīng)物,起轉(zhuǎn)錄因子的作用[28]。Smad通過TGF-β / BMP途徑直接參與誘導(dǎo)OB和OC的形成和分化,其在骨代謝調(diào)節(jié)中起著不可或缺的作用[29]。據(jù)報道,Smad4已被證明是調(diào)節(jié)成骨形成的轉(zhuǎn)錄因子,Smad4與其他激活的Smad蛋白形成復(fù)合體,然后這些復(fù)合體移位到細(xì)胞核并調(diào)節(jié)其靶基因的轉(zhuǎn)錄[30]。BMP-2/Smad/Runx2/Osterix軸在骨代謝研究中上調(diào)Osterix、CollagenⅠ的表達(dá),進(jìn)一步增強成骨細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)骨再生的能力[31]。此外,Smad4是轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路中的關(guān)鍵基因,已被證明調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化和誘導(dǎo)異位骨形成[32]。研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)Smad4、Runx2的mRNA及蛋白表達(dá),可改善骨質(zhì)疏松,減少骨丟失[33]。

本研究結(jié)果顯示,骨質(zhì)疏松模型組大鼠股骨的骨密度降低、骨小梁數(shù)目減少、相對骨體積變小、骨小梁平均厚度降低、骨小梁分離度上升,而經(jīng)治療后可以改善這一現(xiàn)象。這說明固本增骨方可改善大鼠股骨的骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)破壞,對骨質(zhì)疏松具有治療作用。骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物作為骨重塑過程中產(chǎn)生的代謝物,可在尿液或血清中檢測出,并提示骨轉(zhuǎn)換率的變化,是疾病發(fā)生早期及時、明顯的指標(biāo)[34]。骨特異性堿性磷酸酶 (BALP)在成骨細(xì)胞中分泌,是骨形成的特異性標(biāo)志物。TRACP-5b來源于破骨細(xì)胞,當(dāng)TRACP-5b釋放到骨吸收間隙時,有利于破骨細(xì)胞遷移,并且在降解I型骨基質(zhì)膠原方面起作用,是骨吸收的特異性標(biāo)志物[35-36]。結(jié)果表明,固本增骨方呈劑量依賴性調(diào)控血清中骨重塑標(biāo)志物BALP的表達(dá),抑制骨吸收標(biāo)志物TRACP-5b表達(dá),尤其以固本增骨高劑量治療效果最好,促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖,有效修復(fù)骨小梁結(jié)構(gòu),改善骨質(zhì)量。Liu等[37]研究證實未羧基化骨鈣素通過上調(diào)成骨特異性基因Osx、Runx 2、ALP和COLI的表達(dá)以及增加ALP活性、COLI產(chǎn)生和鈣化結(jié)節(jié)形成來促進(jìn)BMSCs的成骨分化。未羧基化骨鈣素防治骨丟失機制:一方面,可激活ERK通路,ERK抑制GSK-3β活性,然后上調(diào)β-catenin,最終促進(jìn)成骨分化;另一方面,其可激活ERK,上調(diào)Smad活性,最終促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。孫凱等[38]實驗發(fā)現(xiàn)補骨生髓方上調(diào)ERK及Smad4的基因及蛋白表達(dá),從而促進(jìn)去卵巢大鼠骨形成,補骨生髓方促進(jìn)骨代謝機制可能與ERK和Smad4信號通路密切相關(guān),通過增加ERK蛋白磷酸化而促進(jìn)ERK/Smad通路激活而防治骨丟失。本實驗結(jié)果得出,固本增骨方可通過對ERK-1、ERK-2及Smad4 基因及ERK、p-ERK及Smad4蛋白表達(dá)影響而促進(jìn)成骨增殖,改善骨質(zhì)疏松,其中以固本增骨方高劑量干預(yù)去勢大鼠最為明顯。

綜上所述,固本增骨方可促進(jìn)成骨細(xì)胞形成,提升骨質(zhì)量,上調(diào)ERK及Smad4基因表達(dá),增加ERK、p-ERK及Smad4蛋白表達(dá),調(diào)節(jié)骨吸收與骨形成的動態(tài)平衡從而防治OP,其作用機制可能與干預(yù)ERK/Smad系統(tǒng)密切相關(guān)。