道勒瑪，郭麗麗，杜海波，張文廣，5，曾亞英

（1.阿拉善盟畜牧研究所，內(nèi)蒙古 阿拉善左旗 750306；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)業(yè)基因組大數(shù)據(jù)工程研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；4.內(nèi)蒙古阿拉善盟阿拉善孿井灘生態(tài)移民示范區(qū)綜合執(zhí)法局，內(nèi)蒙古 阿拉善左旗 750306；5.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；6.阿拉善盟農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古 阿拉善左旗 750306）

乳用經(jīng)濟(jì)家畜泌乳性能的評(píng)價(jià)指標(biāo)通常包括乳產(chǎn)量和乳成分。 乳蛋白率、乳脂肪率、乳糖率和乳干物質(zhì)含量是評(píng)價(jià)乳成分的主要指標(biāo)。 研究表明， 乳產(chǎn)量與乳蛋白率及乳脂肪率之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。 阿拉善雙峰駝兼乳用、 肉用和毛用于一體， 能夠?qū)⑵渌倚箅y以利用的含鹽量高的植物轉(zhuǎn)化為珍貴的畜產(chǎn)品， 成為荒漠和半荒漠地區(qū)人類(lèi)重要的蛋白質(zhì)來(lái)源［1］。 與牛乳相比，駝乳的營(yíng)養(yǎng)成分更接近母乳，雙峰駝乳中蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)和總干物質(zhì)含量均顯著高于單峰駝乳、 山羊乳和馬乳［2］。 此外，駝乳具有較低的膽固醇含量、較高的維生素含量以及高比例的無(wú)機(jī)鹽離子和生物活性物質(zhì)［3-4］，這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和活性成分，不僅有利于人類(lèi)健康，也在抗病毒、抗菌、抗腫瘤、抗真菌、抗氧化、降血糖和抗癌過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［5］，使得駝乳近年來(lái)的需求逐漸增長(zhǎng)。

血液不僅為乳腺上皮細(xì)胞提供前體物質(zhì)用于乳汁合成［6］，同時(shí)也是各類(lèi)調(diào)控因子的輸送媒介及調(diào)節(jié)生理狀態(tài)的生物傳感器庫(kù)［7］。 大部分激素在分泌細(xì)胞中合成后進(jìn)入血液， 隨血液轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞發(fā)揮作用。 血清激素水平的改變反映了機(jī)體的健康狀況，常用于監(jiān)測(cè)個(gè)體的生理狀態(tài)［8］。 隨著家畜泌乳期的開(kāi)始，血清激素水平發(fā)生顯著變化，包括雌激素、孕酮、卵泡刺激素、促黃體素、生長(zhǎng)激素、皮質(zhì)醇、催乳素、胰島素等在內(nèi)的幾十種激素共同作用，調(diào)控泌乳過(guò)程［9］。 例如，孕酮在分娩前1～2 d 開(kāi)始下降，同時(shí)皮質(zhì)醇和雌激素濃度迅速增加［10］。催乳素的產(chǎn)生依賴(lài)于雌激素、胰島素等［11］的調(diào)控， 臨近分娩時(shí)血液中高濃度的雌激素刺激腺垂體分泌催乳素進(jìn)入血液，啟動(dòng)泌乳［12］。雌激素還可以通過(guò)刺激神經(jīng)內(nèi)分泌生長(zhǎng)軸，使生長(zhǎng)激素含量升高，調(diào)節(jié)乳腺組織的生長(zhǎng)發(fā)育［13］。 此外，雌激素的分泌還受到卵泡刺激素和促黃體素的調(diào)節(jié)［14］。血清激素水平與泌乳生理緊密相關(guān)，在乳腺發(fā)育、啟動(dòng)泌乳和維持泌乳方面， 內(nèi)分泌系統(tǒng)可能比任何其他生理系統(tǒng)更能發(fā)揮核心作用［15］，然而目前泌乳相關(guān)激素研究主要集中于個(gè)別激素對(duì)生理和飼養(yǎng)條件改變后指示性指標(biāo)的測(cè)定，鮮見(jiàn)激素生物標(biāo)記輔助泌乳生產(chǎn)管理的相關(guān)研究。 激素生物標(biāo)記輔助生產(chǎn)管理的前提是要挖掘生產(chǎn)性能與血清激素之間的相關(guān)性。 典型相關(guān)分析是一種利用綜合變量研究?jī)山M指標(biāo)之間的相關(guān)關(guān)系， 以反映兩組指標(biāo)之間整體相關(guān)性的多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，能夠從總體上把握兩組指標(biāo)之間的內(nèi)在聯(lián)系［16］。

本研究選取65 峰處于泌乳初期的阿拉善雙峰駝，測(cè)定了主要泌乳性能指標(biāo)和15 個(gè)與泌乳相關(guān)的血清激素水平， 并利用典型相關(guān)分析探究阿拉善雙峰駝泌乳性能與血清激素水平之間的相關(guān)性，挖掘與泌乳性能相關(guān)的血清激素生物標(biāo)志物，以期為泌乳雙峰駝提供更精準(zhǔn)的飼養(yǎng)方案， 同時(shí)為優(yōu)秀乳用個(gè)體的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

從內(nèi)蒙古阿拉善盟雙峰駝養(yǎng)殖基地選取65峰體型、體況相近的健康成年阿拉善雙峰駝，胎次為3～5 胎，均處于泌乳初期。所有阿拉善雙峰駝日糧及管理?xiàng)l件一致， 采用半舍飼半放牧的飼養(yǎng)方式，飲水充足。 乳汁的采集時(shí)間在4:00—5:00。 采集乳汁前，分別用酒精和RNAzap 噴霧擦拭乳頭，棄掉擠奶前2～3 次的乳汁， 然后將新鮮的乳汁存儲(chǔ)于50 mL 試管中置于-20 ℃冰柜保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。 同時(shí)，對(duì)試驗(yàn)雙峰駝進(jìn)行頸靜脈采血，用于血清激素水平的測(cè)定。

1.2 乳產(chǎn)量及乳成分測(cè)定

以3 d 平均產(chǎn)乳量作為該乳駝實(shí)際日產(chǎn)乳量。使用FOSS 多功能近紅外分析儀測(cè)定駝乳中乳蛋白率、乳脂肪率、乳糖率以及灰分含量。

1.3 血清激素水平測(cè)定

使用加有促凝劑的血清管采集乳駝靜脈血，冰上靜置分層，分層后立刻在4 ℃下以3 000 g 離心15 min 得到血清， 分裝并凍存于-80 ℃超低溫冰箱。 取500 μL 血清， 使用華衛(wèi)德朗DR-200BS型酶標(biāo)分析儀配合商品化血清激素檢測(cè)試劑盒在450 nm 處測(cè)定反應(yīng)液吸光度， 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算血清中的皮質(zhì)醇 （ng/mL）、 去甲腎上腺素（pg/mL）、5-羥色胺（ng/mL）、腎上腺素（pg/mL）、生長(zhǎng)激素（ng/mL）、催乳素（μIU/mL）、卵泡刺激素（mIU/mL）、促黃體素（mIU/mL）、雌二醇（pg/mL）、孕 酮（ng/mL）、胰 島 素（μIU/mL）、胰 高 血 糖 素（pg/mL）、瘦 素（ng/mL）、雌 三 醇（ng/mL）、雌 酮（pmol/L）的濃度。

1.4 相關(guān)分析

產(chǎn)乳性狀與血清激素水平內(nèi)部變量相關(guān)性分析使用R 語(yǔ)言ggcor 包計(jì)算并可視化。 典型相關(guān)分析使用在線(xiàn)網(wǎng)站SPSSPRO（https：//www.spsspro.com/）完成分析。 分別在兩組變量中提取有代表性的兩個(gè)綜合變量V1 和W1（分別為兩個(gè)變量組中各變量的線(xiàn)性組合），將兩組變量的關(guān)系轉(zhuǎn)換為兩個(gè)變量線(xiàn)性函數(shù)相關(guān)問(wèn)題進(jìn)行討論， 通過(guò)計(jì)算相關(guān)系數(shù)度量相關(guān)關(guān)系的強(qiáng)度。 本研究以泌乳性狀為X 組變量，對(duì)應(yīng)的綜合變量為V；以血清激素水平為Y 組變量，對(duì)應(yīng)的綜合變量為W，利用這兩個(gè)綜合變量之間的相關(guān)關(guān)系反映兩組指標(biāo)之間的整體相關(guān)性。Wilks 檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)兩組變量之間的典型相關(guān)性是否顯著，采用雙側(cè)假設(shè)檢驗(yàn)，顯著性水平ɑ 均取0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿拉善雙峰駝泌乳性能與血清激素兩組變量的內(nèi)部變異情況

65 峰泌乳初期阿拉善雙峰駝泌乳性能和血清激素水平的檢測(cè)指標(biāo)見(jiàn)表1 和表2。 阿拉善雙峰駝的泌乳性能X 組中有5 個(gè)相關(guān)變量， 即5 個(gè)泌乳性狀指標(biāo)，包括乳產(chǎn)量、乳蛋白率、乳脂肪率、乳糖率和灰分含量；血清激素水平Y(jié) 組有15 個(gè)相關(guān)變量，包括皮質(zhì)醇、去甲腎上腺素、5-羥色胺、腎上腺素、生長(zhǎng)激素、催乳素、卵泡刺激素、促黃體素、雌二醇、孕酮、胰島素、胰高血糖素、瘦素、雌三醇、雌酮。 在泌乳性能X 組中，乳產(chǎn)量的變異程度最大，其次是乳脂肪率，灰分含量、乳蛋白率、乳糖率的變異系數(shù)較小。在血清激素水平Y(jié) 組中，變異系數(shù)最大的是孕酮，其次是雌二醇，然后依次是促黃體素、去甲腎上腺素、卵泡刺激素、5-羥色胺、皮質(zhì)醇、雌酮、催乳素、腎上腺素、胰島素、雌三醇、生長(zhǎng)激素、瘦素、胰高血糖素。

表1 泌乳性能X 組5 個(gè)變量的統(tǒng)計(jì)分析

表2 血清激素水平Y(jié) 組15 個(gè)變量的統(tǒng)計(jì)分析

2.2 血清激素水平內(nèi)部變量間的相關(guān)性

對(duì)15 個(gè)血清激素指標(biāo)進(jìn)行兩兩之間相關(guān)性的分析（見(jiàn)圖1），發(fā)現(xiàn)E3 與E1 之間極顯著強(qiáng)相關(guān)（r=0.88，P<0.001）， 同時(shí)雌三醇也與促黃體素（r=0.70，P<0.001）、催乳素（r=0.59，P<0.001）、胰高血糖素（r=0.52，P<0.001）、卵泡刺激素（r=0.49，P<0.001）、孕酮（r=0.45，P<0.001）、胰島素（r=0.44，P<0.001）、雌二醇（r=0.42，P<0.001）、瘦素（r=0.35，P<0.01） 極顯著正相關(guān)； 與5-羥色胺 （r=-0.51，P<0.001）、腎上腺素（r=-0.38，P<0.01）極顯著負(fù)相關(guān)。 雌激素的另外兩種形式雌二醇和雌酮與雌三醇具有相似的相關(guān)模式。 此外，免疫激素5-羥色胺和胰高血糖素、雌酮、促黃體素、胰島素以及催乳素等激素均呈極顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.56，r=-0.55，r=-0.53，r=-0.48，r=-0.45，P<0.001）。 生長(zhǎng)激素與皮質(zhì)醇（r=-0.45，P<0.001）和去甲腎上腺素（r=-0.35，P<0.01）具有極顯著負(fù)相關(guān)。

圖1 血清激素的相關(guān)系數(shù)矩陣熱圖

2.3 泌乳性能指標(biāo)與血清激素水平的典型相關(guān)分析

因血清激素水平指標(biāo)有15 個(gè)相關(guān)變量，泌乳性狀有5 個(gè)相關(guān)變量， 所以結(jié)果共抽取5 對(duì)典型相關(guān)變量來(lái)代替原始變量研究泌乳性能與血清激素水平之間的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果如表3 所示，兩組變量的第1 對(duì)典型變量與第2 對(duì)典型變量相關(guān)分析認(rèn)為泌乳性狀與血清激素水平之間分別具有極顯著（r=0.904，P<0.01）、顯著（r=0.701，0.01

表3 阿拉善雙峰駝泌乳性能與血清激素典型相關(guān)性

V1=X1+21.661×X2-30.192×X3+0.685×X4-11.36×X5；

W1=0.01×Y1+0.003×Y2-0.006×Y3-0.016×Y4+0.055×Y5+0.002×Y6+0.154×Y7+0.02×Y8-0.002×Y9+0.027×Y10+0.109×Y11-0.018×Y12-0.088×Y13+0.257×Y14-0.019×Y15。

第2 對(duì)典型變量（V2、W2）的構(gòu)成如下：

V2=X1-1.683×X2-7.383×X3-0.944×X4+45.074×X5；

W2=0.005×Y1-0.001×Y2+0.002×Y3+0.01×Y4+0.459×Y5+0.004×Y6-0.01×Y7-0.022×Y8+0.011×Y9-0.282×Y10+0.296×Y11-0.021×Y12+0.3×Y13-0.157×Y14+0.014×Y15。

在泌乳性狀與血清激素的第1 對(duì)典型變量中，V1（泌乳性能）以X3（乳蛋白率）的系數(shù)絕對(duì)值最大，代表X3 對(duì)V1 的貢獻(xiàn)最大；W1（血清激素水平）以Y14（雌三醇）的系數(shù)絕對(duì)值最大，代表Y14對(duì)W1 的貢獻(xiàn)最大， 說(shuō)明在泌乳初期乳蛋白率與雌三醇的血清水平具有較大的相關(guān)性。

在泌乳性狀與血清激素的第2 對(duì)典型變量中，V2（泌乳性能）以X5（灰分含量）的系數(shù)絕對(duì)值最大，代表X5 對(duì)V2 的貢獻(xiàn)最大。W2（血清激素水平）以Y5（生長(zhǎng)激素）的系數(shù)絕對(duì)值最大，代表Y5對(duì)W2 的貢獻(xiàn)最大，說(shuō)明在泌乳初期，乳中灰分含量與血清中生長(zhǎng)激素的水平具有較大的相關(guān)性。

3 討論

乳產(chǎn)量和乳成分中的乳蛋白、乳糖、乳脂和灰分含量是評(píng)價(jià)乳用家畜生產(chǎn)性能的主要指標(biāo)。 本研究泌乳初期阿拉善雙峰駝泌乳性能指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果顯示，阿拉善雙峰駝乳產(chǎn)量指標(biāo)變異較大，這與其泌乳易受刺激影響有關(guān)， 我國(guó)雙峰駝養(yǎng)殖標(biāo)準(zhǔn)化程度低，且雙峰駝對(duì)幼駝的吸吮刺激敏感，易受外界影響而停止泌乳， 導(dǎo)致駝乳產(chǎn)量非常不穩(wěn)定。 乳成分含量的變異系數(shù)均小于0.2。 血清激素水平指標(biāo)中，變異系數(shù)最大的是孕酮，其次是雌二醇，其余激素變異水平均小于0.4。 孕酮是維持妊娠的重要激素，但其對(duì)α-乳清蛋白和乳的形成具有一定的抑制作用，分娩后孕酮含量進(jìn)一步降低［17］。黃兆春等研究發(fā)現(xiàn)［18］，孕酮濃度在小尾寒羊乳腺發(fā)育時(shí)期呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)， 在妊娠末期緩慢下降。本研究中孕酮的變異程度較大，可能是因?yàn)樗x乳駝雖然均處于泌乳初期，但非同一天產(chǎn)犢，由此引起血清孕酮水平下降程度不一。

本研究表明，在雙峰駝泌乳初期，乳蛋白率與雌三醇存在密切關(guān)系。 目前發(fā)現(xiàn)的雌激素主要包括雌酮、雌二醇和雌三醇［19］，循環(huán)系統(tǒng)中含量最多的是雌三醇，效力最強(qiáng)的是雌二醇。雌激素主要由卵巢的卵泡分泌， 其對(duì)乳成分合成的調(diào)控主要通過(guò)刺激雌激素受體進(jìn)而調(diào)控泌乳相關(guān)基因表達(dá)和促進(jìn)蛋白激酶激活［20］。 當(dāng)雌激素結(jié)合到其受體上時(shí)，會(huì)形成一個(gè)激活的雌激素-受體復(fù)合物，該復(fù)合物隨后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并與特定的DNA 序列結(jié)合，促進(jìn)或抑制乳蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)。 Delbecchi 等［21］研究表明，給泌乳期奶牛注射雌二醇后，α-乳白蛋白分泌能力顯著提高。楊建英等［22］和艾曉杰等［23］研究表明，給荷斯坦奶牛飼喂大豆黃酮（植物類(lèi)雌激素）能顯著提高牛奶中的乳蛋白含量。金亞亞等［24］研究表明，組合添加雌激素和催乳素可顯著增加奶牛乳腺上皮細(xì)胞中α-酪蛋白和β-酪蛋白的表達(dá)量。 給泌乳不足的小鼠注射雌激素類(lèi)似物后， 小鼠乳腺發(fā)育得到促進(jìn)， 泌乳量增加，這是由于雌激素類(lèi)似物通過(guò)體外激活A(yù)KT 信號(hào)通路促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖， 刺激催乳素的表達(dá)和釋放， 誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞中催乳素受體的表達(dá)， 在轉(zhuǎn)錄水平上提高乳腺組織中α-酪蛋白和β-酪蛋白的表達(dá)［25］。然而，泌乳期雙峰駝體內(nèi)雌激素對(duì)泌乳功能的調(diào)控作用機(jī)制暫未有相關(guān)研究。本研究初步探究了雙峰駝血清激素水平與泌乳性能的相關(guān)性， 在團(tuán)隊(duì)的后續(xù)研究中將繼續(xù)利用組學(xué)技術(shù)探索其影響乳蛋白合成的分子機(jī)制。

在雙峰駝泌乳初期駝乳中灰分含量與生長(zhǎng)激素水平存在密切關(guān)系。乳灰分主要是無(wú)機(jī)物，包括鉀、鈉、鎂、磷、銅、鐵、鋅等礦物質(zhì)。 生長(zhǎng)激素對(duì)乳腺組織的生長(zhǎng)和分化起到關(guān)鍵作用。此外，生長(zhǎng)激素可以直接影響乳腺上皮細(xì)胞的代謝， 生長(zhǎng)激素會(huì)刺激肝臟產(chǎn)生胰島素樣生長(zhǎng)因子-1， 與乳腺上皮細(xì)胞的胰島素樣生長(zhǎng)因子受體結(jié)合影響鈣、磷和鎂的代謝［26］。

4 結(jié)論

首次將典型相關(guān)分析應(yīng)用于阿拉善雙峰駝血清激素水平與泌乳性能的相關(guān)性研究中。 阿拉善雙峰駝泌乳初期的乳蛋白率與雌三醇、雌酮、促黃體素和催乳素的血清水平具有相關(guān)性。