魏媛媛,紅 梅,王海生
(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)
腸道不僅發(fā)揮對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收功能,還對(duì)維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)起重要調(diào)節(jié)作用。 腸道黏膜屏障能夠阻止腸道內(nèi)致病菌、 外來(lái)抗原和內(nèi)毒素等的移位,防止機(jī)體受到侵襲,同時(shí)吸收機(jī)體所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1-2]。 研究表明,缺血、缺氧、感染性疾病、缺血再灌注損傷、內(nèi)毒素水平增加、應(yīng)激反應(yīng)、膽汁、化學(xué)物質(zhì)、電離輻射、腸道微生態(tài)紊亂等均可引起腸道損傷[3-5]。
蒙藥紅花清肝13 味丸又名古日古木-13,由紅花、人工牛黃、麥冬、訶子、蓮子、銀朱、丁香、人工麝香、紫檀香、木香、川楝子、水牛角濃縮粉、梔子13 種藥材組成, 主要成分紅花具有活血化瘀、抗炎、抗氧化、止痛、鎮(zhèn)靜、清除氧自由基、調(diào)節(jié)血脂、保護(hù)腦組織、擴(kuò)張小動(dòng)脈、增加組織血流量、抗纖維化、保護(hù)神經(jīng)、改善機(jī)體微循環(huán)和提高免疫力等作用[6]。
筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn), 蒙藥紅花清肝13 味丸對(duì)肝損傷具有保護(hù)作用[7]。 炎癥、門(mén)靜脈高壓、 腸道微生物組成變化均可導(dǎo)致腸道通透性增加,致使內(nèi)毒素移位,引起肝臟中多種促炎基因和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄激活。由于腸道屏障受損,大量細(xì)菌及其代謝物如脂多糖(LPS)通過(guò)肝腸循環(huán)進(jìn)入肝臟。蒙藥紅花清肝13 味丸經(jīng)肝腸軸進(jìn)入體內(nèi),是否能夠?qū)δc道損傷起到保護(hù)作用?該研究通過(guò)建立小鼠四氯化碳(CCl4)腸道損傷模型,利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),篩選CCl4引起小鼠腸道損傷及蒙藥紅花清肝13 味丸治療過(guò)程中涉及的重要信號(hào)通路及基因,以期為揭示紅花清肝13 味丸預(yù)防及治療腸道疾病的分子機(jī)理提供參考。
6~8 周齡雄性C57BL/6 小鼠18 只,體重20~22 g,購(gòu)自北京維生河實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司。 蒙藥紅花清肝13 味丸,購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院。 根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]中的計(jì)算公式,小鼠給藥劑量根據(jù)該藥物的成人日劑量50 mg/(kg·BW)推算,確定為616.5 mg/(kg·BW)。 CCl4﹑橄欖油﹑PBS﹑生理鹽水購(gòu)自上海阿拉丁公司。
1.2.1 分組及處理
將18 只小鼠隨機(jī)分為3 組,每組6 只,分別為空白對(duì)照組、模型組和治療組??瞻讓?duì)照組與模型組每天灌胃1 次生理鹽水,劑量為10mL/(kg·BW),連續(xù)7 d; 治療組小鼠每天灌胃1 次紅花清肝13味丸,劑量為616.5 mg/(kg·BW),連續(xù)14 d;最后一次灌胃4 h 后,對(duì)照組腹腔注射橄欖油,模型組和治療組腹腔注射CCl4橄欖油混合物(CCl4∶橄欖油=1∶4,V/V),劑量均為10 mL/(kg·BW)。 腸道損傷處理后第2 天, 將3 組小鼠用乙醚麻醉后安樂(lè)死(頸椎脫臼法)。 記錄所有小鼠體重并取十二指腸組織。
1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析
將十二指腸組織用RNase-free 水沖洗后吸干表面水分,放入液氮中速凍一段時(shí)間后置于-80 ℃冰箱中保存。 將組織樣品送諾禾致源公司進(jìn)行全基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。 RNA 提取及質(zhì)量檢測(cè)合格后,進(jìn)行Illumina 測(cè)序。 對(duì)于有生物學(xué)重復(fù)的樣本,使用DESeq2 軟件(1.20.0)進(jìn)行2 個(gè)比較組合之間的差異表達(dá)分析。采用clusterprofile 軟件對(duì)差異基因集進(jìn)行KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。 KEGG 通路富集以padj小于0.05 作為顯著性富集的閾值。
對(duì)小鼠十二指腸轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 差異表達(dá)基因聚類(lèi)熱圖顯示(見(jiàn)圖1),空白對(duì)照組﹑模型組和治療組腸道組織均能較好地聚在一起,其中,治療組與空白對(duì)照組距離較近,而模型組與空白對(duì)照組距離較遠(yuǎn)。差異表達(dá)基因柱狀圖及火山圖顯示,與空白對(duì)照組相比,模型組差異表達(dá)基因數(shù)量為1 419個(gè), 其中, 上調(diào)表達(dá)基因744 個(gè), 下調(diào)表達(dá)基因675 個(gè)(見(jiàn)圖2 及圖3A);與空白對(duì)照組相比,治療組差異表達(dá)基因?yàn)? 875 個(gè),其中,上調(diào)表達(dá)基因1 362 個(gè), 下調(diào)表達(dá)基因1 513 個(gè) (見(jiàn)圖2 及圖3B);與模型組相比,治療組獲得了2 288 個(gè)差異表達(dá)基因,其中,上調(diào)表達(dá)基因1 139 個(gè),下調(diào)表達(dá)基因1 149 個(gè)(見(jiàn)圖2 及圖3C)。
圖1 不同組別小鼠十二指腸組織差異表達(dá)基因聚類(lèi)熱圖
圖2 不同組別小鼠十二指腸組織差異表達(dá)基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)
圖3 差異表達(dá)基因火山圖
進(jìn)一步對(duì)模型組差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 富集分析,發(fā)現(xiàn)B 細(xì)胞信號(hào)通路﹑破骨細(xì)胞分化信號(hào)通路﹑炎癥性腸病信號(hào)通路﹑趨化因子信號(hào)通路及JAK-STAT 信號(hào)通路等被激活(見(jiàn)圖4)。對(duì)治療組差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 富集分析, 發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路﹑FOXO 信號(hào)通路及長(zhǎng)壽調(diào)節(jié)信號(hào)通路等被激活(見(jiàn)圖5);破骨細(xì)胞分化信號(hào)通路﹑細(xì)胞凋亡信號(hào)通路等被抑制(見(jiàn)圖6)。
圖4 CCl4 損傷腸道后被激活的信號(hào)通路
圖5 紅花清肝13 味丸治療后被激活的信號(hào)通路
圖6 紅花清肝13 味丸治療后被抑制的信號(hào)通路
為了尋找蒙藥紅花清肝13 味丸治療CCl4致腸道損傷中發(fā)揮重要作用的基因, 經(jīng)HERB 數(shù)據(jù)庫(kù)搜集紅花清肝13 味丸作用靶點(diǎn)基因,篩選出的靶點(diǎn)基因有143 個(gè)。對(duì)紅花清肝13 味丸治療后顯著差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析, 發(fā)現(xiàn)下調(diào)基因有155 個(gè)。 將分析得到的兩組基因群通過(guò)String 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)分析,結(jié)果如圖7、圖8 所示。 進(jìn)一步對(duì)兩組關(guān)鍵蛋白互交分析, 得到藥物靶點(diǎn)基因和轉(zhuǎn)錄組靶點(diǎn)基因的共靶點(diǎn)基因,從中篩選出在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中表達(dá)量存在顯著差異的JUN﹑STAT1﹑NFKBIA、FOS 基因, 結(jié)果如圖9 所示。
圖7 紅花清肝13 味丸作用靶點(diǎn)基因
圖8 RNA-Seq 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖
圖9 紅花清肝13 味丸作用靶點(diǎn)與轉(zhuǎn)錄組靶點(diǎn)互交分析結(jié)果
腸道是機(jī)體重要的免疫系統(tǒng)之一, 人體免疫力與腸道密切相關(guān)。 腸道組織受損可引起多種疾病, 若不及時(shí)治療可能會(huì)引起機(jī)體多器官功能障礙[9]。 研究表明,蒙藥在腸道黏膜屏障損傷后的修復(fù)中有重要作用[10]。 目前蒙藥在臨床中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛,許多蒙藥能夠改善腸道菌群失調(diào),增強(qiáng)腸道黏膜免疫屏障功能,減輕腸道炎癥反應(yīng),促進(jìn)腸道黏膜損傷的修復(fù)[11]。 為了尋找更多的治療靶點(diǎn),近年來(lái)腸道組學(xué)測(cè)序研究越來(lái)越受到關(guān)注。在一項(xiàng)黃水多糖對(duì)Caco-2 細(xì)胞腸道屏障損傷的保護(hù)作用機(jī)制研究中,經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn),表達(dá)差異顯著的基因主要富集于MAPK﹑Toll 樣受體和NFκB 等信號(hào)通路[12]。在C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素致小鼠腸道損傷的轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn), 表達(dá)差異顯著的基因主要富集在TNF、IL-17、p53、FOXO、Toll樣受體和NF-κB 等信號(hào)通路[13]。
JAK-STAT 信號(hào)通路是真核細(xì)胞中重要的信號(hào)通路,當(dāng)宿主發(fā)生細(xì)菌感染時(shí),機(jī)體中IFN-γ 激活JAK,進(jìn)一步磷酸化STAT1,活化的STAT1 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中,促進(jìn)多種靶基因的轉(zhuǎn)錄。 JAK-STAT信號(hào)通路參與抗炎作用, 阻止致病菌或內(nèi)毒素的入侵;同時(shí)也可以促進(jìn)或加重機(jī)體炎癥反應(yīng)[14-15]。
mTOR 信號(hào)通路受多種細(xì)胞信號(hào)的調(diào)控。 研究發(fā)現(xiàn),雙歧桿菌可改善UC 小鼠的結(jié)腸損傷,增加腸道菌群的多樣性, 這可能與激活VIP/cAMP/PKA 信號(hào)通路、抑制mTOR 信號(hào)通路有關(guān)[16]。 研究表明, 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88 能夠激活mTOR信號(hào)通路, 而丁酸梭菌能夠通過(guò)介導(dǎo)mTOR 信號(hào)通路緩解產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88 感染IPEC-J2 細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng), 并提高緊密連接蛋白的表達(dá)量,從而減輕細(xì)胞損傷[17]。
FOXO 信號(hào)通路的激活對(duì)腫瘤發(fā)生、 壽命調(diào)節(jié)、代謝調(diào)節(jié)等具有重要作用。 Cheng 等[18]利用黏膜蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和糞便微生物群移植方法研究了外源性微生物對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88 感染仔豬模型腸道功能的影響, 發(fā)現(xiàn)FOXO 信號(hào)通路顯著上調(diào)。 Zhang 等[19]研究表明,F(xiàn)OXO 信號(hào)通路主要參與模擬運(yùn)輸應(yīng)激誘導(dǎo)的鴨腸道損傷機(jī)制。
NF-κB 抑制因子α(NFKBIA)參與調(diào)節(jié)NFκB 信號(hào)通路, 靜息狀態(tài)下NFKBIA 位于細(xì)胞質(zhì)中, 當(dāng)機(jī)體受到刺激時(shí),NFKBIA 發(fā)生磷酸化,繼而使NF-κB 從三聚體中釋放出來(lái)并進(jìn)入細(xì)胞核,調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄及炎癥因子的分泌。 改善腸道菌群的豐富度和組成比例, 可有效降低LPS 在腸道黏膜中的滲透, 使腸道組織中NF-κB 的表達(dá)水平下調(diào),改善糖、脂代謝及炎性因子關(guān)鍵調(diào)控基因和調(diào)控蛋白的表達(dá), 從而降低炎癥反應(yīng)程度,同時(shí)可改善胰島素抵抗水平,最終調(diào)節(jié)機(jī)體物質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)[20]。研究表明,CCl4可通過(guò)誘導(dǎo)MAPK/NF-κB 信號(hào)通路中相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)炎癥發(fā)生發(fā)展[21]。 同時(shí),CCl4可誘導(dǎo)JUN 表達(dá)上調(diào)[22]。
篩選出了參與小鼠CCl4腸道損傷及蒙藥紅花清肝13 味丸治療過(guò)程的FOXO﹑mTOR﹑JAKSTAT 等重點(diǎn)信號(hào)通路和JUN﹑STAT1﹑NFKBIA、FOS 重點(diǎn)基因,為明晰紅花清肝13 味丸預(yù)防及治療腸道損傷的分子機(jī)制提供了參考。