蘇家光,黃家燦,羅世斌,陳信津,鄭文軍

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530021)

斑禿是一種自身免疫疾病,其特征是慢性反復(fù)斑塊性脫發(fā),平均2.1%的人群受到斑禿的影響[1]。在病程不足1年的輕微斑禿患者中,34%～50%的患者會(huì)自行消退,14%～25%的患者最終頭皮的毛發(fā)全部脫落[2]。目前的研究證實(shí),約1/4的斑禿患者有家族病史,提示有遺傳易感性[3]。盡管斑禿被認(rèn)為是良性疾病,但會(huì)使患者產(chǎn)生心理問題,影響其整體生活質(zhì)量[4]。目前斑禿的主要治療方法為皮質(zhì)類固醇局部外用或病灶內(nèi)注射,但受限于治療效果欠佳和潛在的不良反應(yīng)[3]。近年研究發(fā)現(xiàn),1 565 nm非剝脫點(diǎn)陣激光治療斑禿顯示出較好療效[5],側(cè)柏葉酊也可有效改善斑禿[6],但二者治療斑禿的機(jī)制并不清楚。斑禿的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,存在干擾素-γ(IFN-γ)特異性Th1細(xì)胞因子特征,IFN-γ的高表達(dá)可能通過上調(diào)毛囊中組織相容性復(fù)合體I的表達(dá)而導(dǎo)致毛囊免疫機(jī)制發(fā)生崩潰[7-8],而自然殺傷細(xì)胞(NK)型NKG2D+CD8+T細(xì)胞是浸潤毛囊的主要免疫效應(yīng)因子[9]。因此,本研究觀察了1 565 nm非剝脫點(diǎn)陣激光和側(cè)柏葉酊單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對斑禿小鼠皮損毛囊組織中IFN-γ信號和血液中NKG2D+CD8+T細(xì)胞的調(diào)控作用,以為臨床治療斑禿提供有效方案及理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10周齡雄性C3H/HeJ小鼠50只,體重(21.78±2.92)g,由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號:SCXK(桂)2020-0003。在22 ℃晝夜交替的環(huán)境中,將小鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)的Micro-Isolator鼠籠中,每籠5只,自由攝入標(biāo)準(zhǔn)食物和自來水。本實(shí)驗(yàn)得到廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(202105009)。

1.2主要藥物、試劑與儀器 側(cè)柏葉酊(側(cè)柏葉15 g粉碎成粗粉,置密閉玻璃容器加70%乙醇300 mL 浸泡1周后,獲取上清液即為側(cè)柏葉酊);環(huán)磷酰胺,美國Selleck公司。磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)(#97166)一抗,美國Cell Signaling Technology公司;HRP偶聯(lián)的親和山羊抗小鼠IgG(H+L),美國Protein Tech Group公司;PVDF膜,美國MedChemExpress公司。IFN-γ一抗(554699),美國BD公司;IFN-γ受體1(IFNGR1)一抗(ab154400)和IFN-γ受體2(IFNGR2)一抗(ab171081),英國Abcam公司;CD8抗體(ab217344)和自然殺傷細(xì)胞活化受體2D(NKG2D)抗體(ab203353),英國Abcam公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、點(diǎn)陣激光組、側(cè)柏葉酊組及點(diǎn)陣激光聯(lián)合側(cè)柏葉酊組,每組10只。除正常組外,其余組小鼠均采用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)斑禿:采用融化的松香和石蠟涂背脫毛,每天給予150 mg/kg環(huán)磷酰胺腹腔注射1次,連續(xù)6 d。在造模期間,點(diǎn)陣激光組給予1 565 nm非剝脫點(diǎn)陣激光治療,1次/2 d;側(cè)柏葉酊組取適量5%側(cè)柏葉酊在脫毛部位輕微按摩2～3 min,1次/d;點(diǎn)陣激光聯(lián)合側(cè)柏葉酊組給予1 565 nm非剝脫點(diǎn)陣激光及5%側(cè)柏葉酊外用治療,方法同點(diǎn)陣激光組和側(cè)柏葉酊組。

1.4檢測指標(biāo)及方法

1.4.1皮膚和毛發(fā)情況 觀察各組小鼠皮膚狀態(tài)和毛發(fā)生長情況。

1.4.2NKG2D+CD8+T細(xì)胞比例 實(shí)驗(yàn)第7天麻醉小鼠后,取外周血,分離單個(gè)核細(xì)胞,加入CD8-PE、NKG2D-APC抗體進(jìn)行染色后,收集細(xì)胞,并用PBS洗滌1次,然后加入MICA/B-PE或Fas-FITC抗體染色(美國BD公司),冰上孵育30 min,上FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)進(jìn)行檢測,使用FlowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4.3毛囊組織中IFN-γ及其受體IFNGR1和IFNGR2表達(dá)情況 采用Western blot 法檢測:取脫毛部位毛囊組織,根據(jù)蛋白裂解液說明書,用RIPA緩沖液勻漿,提取總蛋白。蛋白樣品用7.5% SDS-PAGE凝膠(30 μg蛋白質(zhì)/10 μL每孔)在電泳儀上進(jìn)行電泳分離,分離蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。分別加入IFN-γ一抗(1∶600)、IFNGR1一抗(1∶800)、IFNGR2一抗(1∶500)4 ℃孵育過夜,PBS清洗后,用HRP山羊抗兔IgG二抗室溫孵育2 h。PBST清洗后用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑顯色,以GAPDH為內(nèi)參,使用Image J軟件計(jì)算蛋白表達(dá)條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠皮膚和毛發(fā)情況 正常組小鼠毛發(fā)生長分布均正常,體毛濃密;各造模組小鼠均出現(xiàn)了脫毛和皮膚裸露的特征,其中模型組小鼠斑禿部位的毛發(fā)出現(xiàn)斷裂、變細(xì),裸露皮膚表面出現(xiàn)黑點(diǎn);各干預(yù)組斑禿情況均較模型組輕,其中點(diǎn)陣激光聯(lián)合側(cè)柏葉酊組最輕。見圖1及圖2。

圖1 正常組和斑禿各組小鼠肉眼觀察皮膚和毛發(fā)情況

2.2各組小鼠血液中NKG2D+CD8+T細(xì)胞比例比較 正常組NKG2D+CD8+T細(xì)胞比例為(0.67±0.05)%,模型組為(11.32±2.05)%,模型組明顯高于正常組(P<0.05);點(diǎn)陣激光組、側(cè)柏葉酊組、點(diǎn)陣激光聯(lián)合側(cè)柏葉酊組血液中NKG2D+CD8+T細(xì)胞比例分別為(11.03±1.38)%、(11.10±2.07)%、(1.64±0.21)%,點(diǎn)陣激光聯(lián)合側(cè)柏葉酊組血液中NKG2D+CD8+T細(xì)胞比例明顯低于模型組及點(diǎn)陣激光組、側(cè)柏葉酊組(P均<0.05),點(diǎn)陣激光組、側(cè)柏葉酊組與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖3。

圖3 正常組和斑禿各組小鼠血液單個(gè)核細(xì)胞中NKG2D+CD8+ T細(xì)胞的比例

2.3各組小鼠毛囊組織中IFN-γ及其受體IFNGR1和IFNGR2表達(dá)情況 模型組毛囊組織中IFN-γ、IFNGR1、IFNGR2蛋白相對表達(dá)量均明顯高于正常組(P均<0.05);點(diǎn)陣激光組、側(cè)柏葉酊組毛囊組織中IFN-γ 蛋白相對表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05),IFNGR1、IFNGR2蛋白相對表達(dá)量與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);點(diǎn)陣激光聯(lián)合側(cè)柏葉酊組毛囊組織中IFN-γ、IFNGR1、IFNGR2蛋白相對表達(dá)量均明顯低于模型組及點(diǎn)陣激光組、側(cè)柏葉酊組(P均<0.05)。見圖4和表1。

表1 正常組和斑禿各組小鼠毛囊組織中IFN-γ、IFNGR1、IFNGR2蛋白相對表達(dá)量比較

圖4 正常組和斑禿各組小鼠毛囊組織中IFN-γ、IFNGR1、IFNGR2蛋白表達(dá)電泳條帶

3 討 論

NKG2D+CD8+T細(xì)胞比例增加是斑禿疾病的一個(gè)重要特征。相關(guān)研究表明,在斑禿慢性期,淋巴和皮膚組織中的NKG2D+CD8+T細(xì)胞百分比增加,并且有助于攻擊毛囊使其受損導(dǎo)致持久脫發(fā)[8-9];在斑禿急性期,血液單個(gè)核細(xì)胞中NKG2D+CD8+T細(xì)胞比例增加,而且NKG2D+CD8+T細(xì)胞可以遷移到皮膚中并駐留,從而發(fā)揮作用[10]。表明血液單個(gè)核細(xì)胞中NKG2D+CD8+T細(xì)胞比例增加是急性斑禿的關(guān)鍵影響因素,而皮膚組織中NKG2D+CD8+T細(xì)胞的積累是斑禿慢性發(fā)展的關(guān)鍵影響因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組小鼠血液單個(gè)核細(xì)胞中NKG2D+CD8+T細(xì)胞比例較正常組明顯升高,點(diǎn)陣激光聯(lián)合側(cè)柏葉酊組血液中NKG2D+CD8+T細(xì)胞比例較模型組及點(diǎn)陣激光組、側(cè)柏葉酊組明顯降低,點(diǎn)陣激光組、側(cè)柏葉酊組NKG2D+CD8+T細(xì)胞比例與模型組比較變化不明顯。提示1 565 nm非剝脫點(diǎn)陣激光聯(lián)合側(cè)柏葉酊治療可明顯抑制斑禿小鼠血液單個(gè)核細(xì)胞中NKG2D+CD8+T細(xì)胞比例的增加,但是二者單獨(dú)治療對NKG2D+CD8+T細(xì)胞比例影響不明顯。

研究表明,IFN-γ水平與斑禿活性和疾病持續(xù)時(shí)間密切相關(guān)[11-12],IFN-γ可誘導(dǎo)主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ類分子和Ⅱ類分子的濾泡表達(dá),導(dǎo)致毛囊組織免疫豁免崩潰并誘導(dǎo)自身免疫性脫發(fā)[13],而阻斷IFN-γ的功能可以抑制C3H/HeJ小鼠脫發(fā)的發(fā)生[9,14]。另外IFN-γ可促進(jìn)損傷皮膚中的自反應(yīng)CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ,IFN-γ與其受體結(jié)合,從而激活Janus激酶信號換能器和轉(zhuǎn)錄途徑激活器,刺激IFN-γ誘導(dǎo)的趨化因子表達(dá)[15]。Tang等[16]研究報(bào)道,利用小干擾RNA局部注射可以明顯減少IFN-γ及其受體IFNGR1的表達(dá),從而改善自身免疫性皮膚病。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,1 565 nm非剝脫點(diǎn)陣激光、側(cè)柏葉酊單獨(dú)應(yīng)用及二者聯(lián)合應(yīng)用均能顯著抑制C3H/HeJ小鼠毛囊組織中IFN-γ的表達(dá),但是二者聯(lián)合應(yīng)用抑制IFN-γ表達(dá)的作用更強(qiáng),且能明顯抑制IFNGR1和IFNGR2的表達(dá)。這表明1 565 nm非剝脫點(diǎn)陣激光、側(cè)柏葉酊單獨(dú)應(yīng)用或者聯(lián)合應(yīng)用均有改善斑禿的潛力,但是1 565 nm非剝脫點(diǎn)陣激光與側(cè)柏葉酊聯(lián)合應(yīng)用抑制IFN-γ、IFNGR1和IFNGR2的表達(dá)作用更明顯。

綜上所述,環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的斑禿小鼠毛囊組織中IFN-γ信號通路被激活,血液單個(gè)核細(xì)胞中NKG2D+CD8+T細(xì)胞積累增加;1 565 nm非剝脫點(diǎn)陣激光聯(lián)合側(cè)柏葉酊干預(yù)可以抑制IFN-γ信號通路和血液單個(gè)核細(xì)胞中NKG2D+CD8+T細(xì)胞的積累。本研究為1 565 nm非剝脫點(diǎn)陣激光聯(lián)合側(cè)柏葉酊治療斑禿提供了新的理論依據(jù)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。