孫璐,鄧仕任,夏林波,邊星,楊浩

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,遼寧 大連 116600)

九里香(MurrayaexoticaL.)為蕓香科九里香屬植物,廣泛分布于印尼、東南亞及中國(guó)南方各省。作為《中國(guó)藥典》2020年版九里香藥材的基源植物之一[1],九里香被廣泛應(yīng)用于治療牙痛、濕疹、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等癥[2]。目前對(duì)于九里香的化學(xué)成分研究大多集中于其枝、葉等部位,成分種類以香豆素和黃酮類為主[3-5],而對(duì)于其根部的化學(xué)成分則報(bào)道較少,尚未見(jiàn)對(duì)其根部化學(xué)成分的系統(tǒng)性研究。藥理研究表明,九里香根浸提物具有廣泛的藥理活性,如抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗真菌和抗炎等[6],因此有必要對(duì)九里香根的化學(xué)成分開(kāi)展系統(tǒng)性研究,以明確其藥理活性物質(zhì)。超高效液相串聯(lián)四極桿靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-Q-Orbitrap-MS)具有高分辨率、高掃描速率、精確的結(jié)構(gòu)表征等優(yōu)勢(shì),可實(shí)現(xiàn)多種成分同時(shí)快速地鑒定和指認(rèn),已被廣泛應(yīng)用于中藥化學(xué)成分的快速篩查和定性分析[7-9]。本研究旨在采用UPLC-Q-Orbitrap-MS技術(shù)對(duì)九里香根提取物的化學(xué)成分進(jìn)行全面深入的分析,闡明其化學(xué)成分組,以期揭示九里香根的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),為九里香藥材資源的開(kāi)發(fā)利用和臨床用藥提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Q Exactive Plus四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司);Ultimate 3000 超高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Dionex 公司);數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為Xcalibur 4.1工作站(美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司);ME204E十萬(wàn)分之一天平(梅特勒-托利多公司);KQ-3000E 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Direct-Q5型超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 試藥川陳皮素、木犀草素、阿魏酸、腺苷和補(bǔ)骨脂素等對(duì)照品均購(gòu)自四川維克奇生物科技有限公司,純度均大于98.5%。九里香根收集自廣東吉農(nóng)種植基地,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)張建奎教授鑒定為蕓香科植物九里香(MurrayaexoticaL.)的干燥根,標(biāo)本存放于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院。水為超純水,甲醇和乙腈為色譜純,甲酸為質(zhì)譜純(美國(guó)Tedia公司),其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);以含0.1%甲酸的水溶液為流動(dòng)相A,0.1%甲酸的乙腈溶液為流動(dòng)相B。梯度洗脫條件：0～1 min,1% B;1～20 min,1% B→99% B;20～22 min,99% B。柱溫：40 ℃,流速：0.2 mL·min-1,進(jìn)樣量：3 μL。

2.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源,正、負(fù)離子掃描模式,電離源電壓3 KV;毛細(xì)管溫度320 ℃;透鏡電壓100 V;鞘氣和輔助氣為高純氮?dú)?純度>99.99%),鞘氣流速40 arb,輔助氣流速10 arb;MS1為全掃描模式,掃描范圍：50～1 250 m/z,分辨率：60 000;MS2采用數(shù)據(jù)依賴性掃描(DDA),選擇MS1中最強(qiáng)10個(gè)離子進(jìn)行掃描;裂解方式：CID;裂解能量：35 eV。

2.3 供試品溶液的制備九里香根干燥后粉碎,過(guò)三號(hào)篩,稱取1.00 g粉末,置5 mL 80%甲醇中室溫浸泡1 h,再超聲提取(功率 250 W,頻率40 kHz)1 h。提取液4 000 r·min-1離心10 min,取上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜,即得。

2.4 混合對(duì)照品溶液的制備精密稱取上述對(duì)照品適量,分別加80%甲醇溶解,得對(duì)照品母液。分別吸取各對(duì)照品母液0.5 mL于10 mL容量瓶中,加80%甲醇溶液定容,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,即得。

3 結(jié)果

3.1 化合物鑒定采用UPLC-Q-Orbitrap-MS在“2.1”和“2.2”檢測(cè)條件下對(duì)供試品溶液進(jìn)行分析,得正、負(fù)離子模式下的基峰圖(見(jiàn)圖1),通過(guò)Xcalibur軟件得到九里香根中各化學(xué)成分的保留時(shí)間及一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息,通過(guò)與相關(guān)文獻(xiàn)、質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)和對(duì)照品進(jìn)行對(duì)比,最終鑒定出63個(gè)化合物,包括香豆素類20個(gè)、有機(jī)酸類7個(gè)、生物堿類6個(gè)、黃酮類7個(gè)、氨基酸類6個(gè)、酰胺類4個(gè)、核苷類4個(gè)、磷脂類3個(gè)、其他類6個(gè),具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 九里香根的UPLC-Q-Orbitrap-MS化學(xué)成分分析

圖1 九里香根的BPC圖(A為正離子模式,B為負(fù)離子模式)

其中,精氨酸、谷氨酰胺、L-天門冬酰胺、帕拉金糖、蔗糖、尿苷、腺苷、鳥(niǎo)苷、黃嘌呤、酒石酸、新綠原酸、茵芋苷、L-色氨酸、對(duì)香豆?；鼘幩帷?-O-阿魏?？鼘幩?、3-O-阿魏酰奎寧酸、7-甲氧基香豆素、N-乙酰-L-苯丙氨酸、N-乙酰色氨酸、N-反式阿魏酰酪胺、Muralatin J、LPE16∶0、LPE18∶1、芥酸酰胺、1-linoleoyl-GPI(18∶2)、15-keto-PGF1α等26種化合物為首次從九里香中鑒定得到。

3.2 九里香根中主要化學(xué)成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律及鑒定過(guò)程

3.2.1 有機(jī)酸類化合物從九里香根提取物中共鑒定出7個(gè)有機(jī)酸成分,其中酒石酸、新綠原酸、對(duì)香豆?；鼘幩帷?-O-阿魏?？鼘幩帷?-O-阿魏?？鼘幩釣槭状螐木爬锵阒需b別得到。其中?；袡C(jī)酸類成分居多,此類成分的主要裂解過(guò)程為母離子脫去阿魏?；?feruloyl,176)、奎寧酸(quinic acid,174)等基團(tuán)產(chǎn)生碎片離子。以化合物22為例,負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)為367.102 4,推斷其分子式為C17H20O9,二級(jí)碎片離子主要為193.050 1,191.056 0,推測(cè)質(zhì)譜裂解規(guī)律為準(zhǔn)分子離子峰丟失一分子奎寧酸(quinic acid,174)和一分子阿魏?；?feruloyl,176)形成碎片離子。結(jié)合MassBank數(shù)據(jù)庫(kù)信息以及碎片離子的相對(duì)豐度,推測(cè)化合物22為5-O-阿魏?？鼘幩?其二級(jí)質(zhì)譜和可能裂解過(guò)程見(jiàn)圖2。

圖2 化合物22的二級(jí)質(zhì)譜(A)和可能的裂解過(guò)程(B)

3.2.2 香豆素類化合物從九里香根提取物中共鑒定出20個(gè)香豆素類成分,其中,茵芋苷、7-Methoxycoumarin、Muralatin J為首次從九里香中鑒別得到。下面以化合物50為例介紹鑒定過(guò)程。該化合物的[M+H]+為305.102 0,推斷分子式為C16H16O6。二級(jí)碎片離子主要為233.044 6、207.065 3,推測(cè)質(zhì)譜裂解規(guī)律為準(zhǔn)分子離子峰丟失一分子C4H8O,形成m/z 233.044 6的碎片離子,之后丟失一個(gè)C=O,形成m/z 207.065 3的碎片離子。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)記載[16],推測(cè)化合物50為Muralatin J,其二級(jí)質(zhì)譜和可能裂解過(guò)程見(jiàn)圖3。

圖3 化合物50的二級(jí)質(zhì)譜(A)和可能的裂解過(guò)程(B)

3.2.3 生物堿類化合物從九里香根提取物中共鑒定出6種生物堿,為九里香根莖部位的特征成分,以化合物62為例介紹其鑒定過(guò)程。一級(jí)質(zhì)譜中,該化合物的[M+H]+為367.217 4,推斷分子式為C26H26N2。二級(jí)質(zhì)譜中,碎片離子m/z 250.159 0為母離子(m/z 367.216 9)丟失一分子吲哚(C8H7N)形成;m/z 245.107 3為母離子中的五元環(huán)裂解所得的碎片峰,該碎片峰進(jìn)一步裂解可得到甲基吲哚的碎片離子(m/z 130.065 7);該母離子還可通過(guò)丟失一分子甲基吲哚(C9H7N)形成m/z 238.159 0,該碎片離子可進(jìn)一步通過(guò)RDA裂解得到m/z 184.112 6。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),推測(cè)化合物62為月橘烯堿(yuehchukene),一種雙吲哚生物堿,其可能裂解過(guò)程見(jiàn)圖4。

圖4 化合物62的二級(jí)質(zhì)譜(A)和可能的裂解過(guò)程(B)

4 討論

本研究采用UPLC-Q-Orbitrap-MS技術(shù)對(duì)九里香根的化學(xué)成分進(jìn)行了快速分析和鑒別。通過(guò)靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜提供的精確分子質(zhì)量信息以及數(shù)據(jù)依賴性(DDA)模式所獲得的二級(jí)質(zhì)譜碎片信息,共從九里香根中初步鑒定出63種化學(xué)成分,主要包括香豆素類、黃酮類、酚酸類、生物堿類等,其中新綠原酸、茵芋苷、5-O-阿魏?？鼘幩?、Muralatin J等26種成分在該植物中首次被發(fā)現(xiàn)。本文以5-O-阿魏酰奎寧酸、Muralatin J等新發(fā)現(xiàn)的化合物為例,詳細(xì)描述了化合物的質(zhì)譜鑒定過(guò)程。在生物堿類成分的鑒定中,我們首次解析了九里香中的特征雙吲哚生物堿-月橘烯堿的質(zhì)譜裂解規(guī)律。上述結(jié)果表明,UPLC-Q-Orbitrap-MS技術(shù)具有快速靈敏、準(zhǔn)確度高、簡(jiǎn)便高效的特點(diǎn),尤其適用于中藥等復(fù)雜體系中的化學(xué)成分分析,可望為九里香的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

在本試驗(yàn)的化合物鑒定過(guò)程中,我們也看到仍有一些成分在本試驗(yàn)的分析條件下無(wú)法給出明確的鑒定結(jié)果,如順式-去氫蛇床子素和反式-去氫蛇床子素,二者互為同分異構(gòu)體且具有幾乎相同的二級(jí)質(zhì)譜圖,因此無(wú)法區(qū)分。后續(xù)可嘗試借助軌道阱多級(jí)質(zhì)譜或離子淌度質(zhì)譜予以進(jìn)一步鑒定。