李紫薇，李洪超，王曉楠，趙越，曹焜，王盼，朱浩，肖湘

(黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶 163316)

工業(yè)大麻(CannabissativaL.)是大麻科、大麻屬(CannabisL.)一年生直立草本植物，其四氫大麻酚(Tetrahydrocannabinol，THC)含量小于0.3%，不具有毒品利用價值，可進(jìn)行種植加工及利用[1]。工業(yè)大麻作為最早種植的經(jīng)濟(jì)作物之一，在中國已有六千多年的栽種歷史[2]，根據(jù)其用途，可將大麻分為纖用、籽用、藥用、籽纖兼用和纖藥兼用等類型[3]。據(jù)統(tǒng)計，世界上由大麻衍生出的產(chǎn)品達(dá)2 萬多種，涉及紡織、造紙、食品、醫(yī)藥及復(fù)合材料等領(lǐng)域，如:麻皮可制成服裝、紙張、繩索等，其葉、花、根可以入藥，也可以用作土壤肥料；莖稈可制成密度板等新型復(fù)合材料，具有極高的經(jīng)濟(jì)價值[4]。

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA－Seq)，是指將高通量測序方法應(yīng)用到由mRNA 逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA上，能夠迅速準(zhǔn)確獲得特定物種組織或器官在特定生理狀態(tài)下幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息和表達(dá)信息[5]，該技術(shù)具有速度快、準(zhǔn)確度高、操作成本低等優(yōu)勢[6]。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在工業(yè)大麻的基因轉(zhuǎn)錄組、新基因挖掘、抗脅迫機(jī)制、分子育種及其纖維發(fā)育調(diào)控等研究領(lǐng)域獲得重大突破，在缺少參考基因組的條件下，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)不僅能獲得樣本中的序列信息，還能對序列的表達(dá)量進(jìn)行定量分析，研究差異基因的表達(dá)情況[7－8]。由于工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展以及創(chuàng)新性應(yīng)用如火如荼，當(dāng)下產(chǎn)業(yè)發(fā)展對種質(zhì)資源提出更高的要求，同時工業(yè)大麻種植也逐步由耕地向條件惡劣的非種植地擴(kuò)大轉(zhuǎn)移，這使培育多功能、抗逆性強(qiáng)工業(yè)大麻品種迫在眉睫[9]，因此精準(zhǔn)鑒定、深度發(fā)掘優(yōu)異基因和特色品種資源并解析其分子機(jī)理，對工業(yè)大麻品種遺傳改良及產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新發(fā)展至關(guān)重要。伴隨著轉(zhuǎn)錄組技術(shù)和生物信息的迅速發(fā)展以及測序成本的減少，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在工業(yè)大麻中廣泛應(yīng)用。因此，本文闡述了轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在工業(yè)大麻上的研究現(xiàn)狀，并展望了其在工業(yè)大麻中的應(yīng)用前景。

1 轉(zhuǎn)錄組測序分析相關(guān)概念

轉(zhuǎn)錄組的概念最早于1995年由Velculescu 提出，廣義上指特定生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，主要包括mRNA 和非編碼RNA，狹義上指所有編碼蛋白質(zhì)的mRNA 的總和[10]。轉(zhuǎn)錄組測序在有參考基因的條件下，可以進(jìn)行序列可變剪切的調(diào)控[11－13]、轉(zhuǎn)錄圖譜的繪制[14－15]、基因家族篩選及驗(yàn)證分析[16]；在沒有參考基因組的條件下，轉(zhuǎn)錄組測序也可以進(jìn)行新基因的深度挖掘[17－19]、代謝途徑的確定[20]和低豐度轉(zhuǎn)錄本的發(fā)掘[21－22]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究涉及的方法多樣，如雜交技術(shù)、cDNA 芯片、高通量測序等?，F(xiàn)階段轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究主要使用高通量測序技術(shù)，通過高通量測序技術(shù)反映某一物種的mRNA 特定情況和時間點(diǎn)下基因的表達(dá)情況[8]。

高通量測序技術(shù)(High－throughput sequencing)又稱為“下一代測序技術(shù)”，指能夠一次同時對大量核酸分子進(jìn)行平行序列測定的技術(shù)[23]。自1953年沃森、克里克通過雙螺旋結(jié)構(gòu)認(rèn)識核酸的空間結(jié)構(gòu)后，人們開始探究其序列信息，測序技術(shù)發(fā)展也由此拉開序幕。1977年生物化學(xué)家Sanger 發(fā)明了鏈終止測序法，至今仍被人們認(rèn)為是第一代測序技術(shù)。隨著測序需求日益增多，第一代測序法費(fèi)時費(fèi)力、成本高，已不能滿足人們的需求，因此開發(fā)出第二代測序技術(shù)。第二代測序技術(shù)以更低的成本實(shí)現(xiàn)了高通量和自動化，同時還提升了測序的分辨率，優(yōu)化了RNA 剪切修飾功能[24]。目前，在二代測序平臺中，454 測序技術(shù)平臺最早實(shí)現(xiàn)商業(yè)化[25－26]。但存在的問題是，第二代測序技術(shù)需要從頭組裝并且拼接過程比較復(fù)雜，且只能對基因的局部結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測，具有一定的局限性[27]，因此，第三代代表性測序技術(shù)中的單分子實(shí)時測序技術(shù)，其通量高且測序讀數(shù)長，測序過程無須進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和打斷，能直接獲得完整的轉(zhuǎn)錄本，但正因?yàn)樵跍y序時沒有經(jīng)過模板擴(kuò)增，其測序信號的檢測與邊合成邊測序的二代測序技術(shù)相比較弱，易在堿基識別時產(chǎn)生隨機(jī)錯誤[28]，因此第三代測序準(zhǔn)確度比前兩代低，且測序成本較高，目前更多研究還是以二代測序技術(shù)為主[29]。

現(xiàn)如今，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已發(fā)展成為重要的分子生物學(xué)分析方法，被廣泛應(yīng)用于各研究領(lǐng)域。近年，工業(yè)大麻轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序是比較活躍的領(lǐng)域，了解其基因表達(dá)、分析其功能和調(diào)控機(jī)制、挖掘功能基因以及開展次生代謝產(chǎn)物途徑等研究，有助于在其遺傳育種理論與技術(shù)途徑領(lǐng)域獲得新突破，為育種研究提供有益指導(dǎo)。

2 工業(yè)大麻轉(zhuǎn)錄組測序研究進(jìn)展

2.1 工業(yè)大麻基因組及關(guān)鍵活性成分研究

從2011年工業(yè)大麻基因組草圖發(fā)表到2020年5月公安部物證鑒定中心發(fā)表了一個高質(zhì)量染色體水平的野生大麻參考基因組，標(biāo)志著工業(yè)大麻逐步進(jìn)入了基因組時代[30]。Van 等[31]利用轉(zhuǎn)錄組和基因測序技術(shù)對高含量四氫大麻酚酸(Tetrahydrocannabidiol acid THCA)的大麻品種Purple Kush(PK)及低含量THCA 品種“Finola”和“USO－31”進(jìn)行對比分析，得到一個534 Mb 的PK 基因組草圖，同時也發(fā)現(xiàn)THCA 合成酶(Tetrahydrocannabinol synthase THCAS)在大麻素合成通路顯著上調(diào)，且在PK 中表達(dá)遠(yuǎn)高于Finola 品種，該研究不僅進(jìn)一步明確了大麻轉(zhuǎn)錄組的特征，同時也為后續(xù)培育具有大麻素特征的品種及揭示工業(yè)大麻基因型和化學(xué)型的遺傳關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

大麻素類化合物作為工業(yè)大麻活性成分具有多種功效，目前已從大麻中分離鑒定150 余種，其中大麻酚(Cannabinol，CBN)、大麻二酚(Cannabidiol，CBD)和THC 在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[32]。CBD具有抗菌、消炎以及抗腫瘤等多種價值。為了探究通過栽培手段合成CBD 的環(huán)境影響機(jī)制，嚴(yán)江濤[33]利用RNA－Seq 對室外和室內(nèi)兩種培育環(huán)境下工業(yè)大麻品系C4 的CBD 合成分子機(jī)制進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在室外培育條件下，BDAS、CYP86B1和ALDH2C4這些基因表達(dá)量比室內(nèi)條件明顯增加，也發(fā)現(xiàn)苯丙酸生物合成途徑主要調(diào)控CBD 的合成，該研究明確了調(diào)控CBD 合成的主要代謝通路，并推測BDAS、CYP86B1和ALDH2C4這些基因參與CBD 的合成，同時除了培養(yǎng)環(huán)境對工業(yè)大麻CBD合成有影響，施加外源激素對CBD 合成機(jī)制也有一定作用。吳珊[34]利用20 mg/L 激動素(KT)對工業(yè)大麻材料DMG227 噴施處理30 d 并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，與無外源激素處理比較分析，發(fā)現(xiàn)KT 噴施處理可調(diào)控大麻植物體內(nèi)的次生代謝途徑，從而使植株的CBD 與THC 含量明顯升高，同時倍半萜和三萜生物合成次生代謝途徑富集到許多萜烯合酶基因家族，且這些萜烯合酶基因顯著表達(dá)。因此猜測，CBD 和THC 含量增加與KT 處理調(diào)控萜烯合酶的表達(dá)有關(guān)。為進(jìn)一步探究大麻素生物合成途徑中基因的表達(dá)水平，Braich 等[35]利用雌性工業(yè)大麻的根、莖、花等組織構(gòu)建和注釋了基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組圖譜，并與雄性工業(yè)大麻營養(yǎng)組織和生殖組織進(jìn)行基因差異比較分析，挖掘出大量與大麻素合成相關(guān)的候選基因CsTPS5FN、CsTPS9FN和CsTPS12PK。

在繼利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)挖掘工業(yè)大麻活性成分合成酶及關(guān)鍵基因后，Varaerg 等[36]基于來自不同譜系的69 個大麻品種的全基因組序列，通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝及從頭測序分析，發(fā)現(xiàn)大麻素合成途徑編碼CBDA/THCA 合成酶基因在基因拷貝數(shù)(CN)上存在差異，并獲得多個CBDA/THCA合成酶基因家族的同源基因，該研究驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果，并從基因組水平上解釋了大麻素含量變化的調(diào)控機(jī)理。同時，Zager 等[37]通過對9 個不同品種工業(yè)大麻的腺毛進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析，利用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析方法揭示了一個與大麻素和萜類化合物生物合成相關(guān)基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，鑒定出之前未曾報道過的基因:編碼橙花醇的TPS18VF、編碼芳樟醇合成酶的TPS19BL、編碼大根香葉烯B 合酶的TPS16CC和編碼四甲基環(huán)癸二烯甲醇合酶的TPS20CT(表2)[38]。這些研究為進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)挖掘工業(yè)大麻活性成分關(guān)鍵基因，提取次級代謝產(chǎn)物以及聯(lián)合多組學(xué)數(shù)據(jù)闡述大麻素合成機(jī)制提供了參考。

2.2 工業(yè)大麻纖維相關(guān)轉(zhuǎn)錄組研究

2.2.1 工業(yè)大麻纖維發(fā)育轉(zhuǎn)錄組研究

“國紡源頭，萬年衣祖”，工業(yè)大麻纖維強(qiáng)度高，耐磨性好，具有天然抑菌和防紫外線等特性，因此以工業(yè)大麻韌皮纖維為原材料的食藥、日化、紡織、新材料等產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，其產(chǎn)品廣受人們追捧[39]。

工業(yè)大麻下胚軸韌皮纖維存在由伸長到增厚的過渡階段，因此工業(yè)大麻是研究二次生長過程的最佳模型[40]。在纖維發(fā)育方面，Guerriero 等[41]對雌雄同株工業(yè)大麻的3 個不同韌皮部位進(jìn)行RNA－Seq 分析，通過對不同纖維發(fā)育時期基因富集轉(zhuǎn)錄本的分析，發(fā)現(xiàn)每個莖區(qū)的纖維具有特定的轉(zhuǎn)錄組特征，細(xì)胞壁沉積等相關(guān)過程主要發(fā)生在莖折斷點(diǎn)的節(jié)間，還發(fā)現(xiàn)了調(diào)控細(xì)胞周期和光合反應(yīng)的相關(guān)基因如CAB1(葉綠素結(jié)合蛋白1)、LHCB4和LHCA5(光合復(fù)合物)，以及與次生代謝物即萜類化合物、類黃酮生物合成相關(guān)的基因，如CYP76C1(編碼細(xì)胞色素P450s)和C2(參與花芳樟醇代謝)，這些基因?qū)g皮纖維發(fā)育發(fā)揮重要作用，同時在較老的莖節(jié)部發(fā)現(xiàn)植物激素生物合成的相關(guān)基因(如GA20OX2和GA3OX1編碼赤霉素合成酶)、次級細(xì)胞壁沉積和與木質(zhì)素生物合成相關(guān)的基因(如PAL1、CesA8、EXPA8、EXPA10、EXPA11、EXPA12)表達(dá)量均較高。該研究應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)不僅確定了細(xì)胞壁沉積發(fā)生的部位，還挖掘出參與纖維發(fā)育和激素合成的基因，更深入地探究了工業(yè)大麻纖維發(fā)育分子機(jī)制。

植物激素作為重要的信號分子，對調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育和環(huán)境應(yīng)答具有十分重要的作用。通過對植物進(jìn)行外源激素處理，可調(diào)節(jié)植物的次生代謝物合成，不同濃度外源激素對工業(yè)大麻組織發(fā)育皆有一定程度的影響。Guerriero 等[42]對播種后16、17、18、20 d 的幼苗噴灑茉莉酸(JA)，利用RT－qPCR 對其下胚軸進(jìn)行基因表達(dá)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JA 對下胚軸的木質(zhì)素含量具有積極作用，可通過JA 對下胚軸直徑的影響程度來反映其對次生生長的影響，下胚軸直徑的增加會導(dǎo)致次生韌皮部纖維數(shù)量增多。同時，內(nèi)源激素的積累對植物的生長發(fā)育也發(fā)揮著重要作用，Marc 等[40]選擇工業(yè)大麻4 個具有代表性的發(fā)育階段進(jìn)行了植物激素的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和定量分析，結(jié)果顯示，次生生長開始有植物激素(生長素、JA 及細(xì)胞分裂素等)參與調(diào)控，尤其是JA，其含量在發(fā)育的15 d 達(dá)到峰值，而細(xì)胞分裂素則起到調(diào)節(jié)次生組織中木質(zhì)素沉積的作用，這些植物激素對細(xì)胞壁生物合成都至關(guān)重要。該研究結(jié)合生理與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果探究了大麻下胚軸從初級生長向次級生長過渡的分子機(jī)制，最終不僅證明了內(nèi)源激素密切參與次生生長和細(xì)胞壁沉積，也證明了JA 和生長素調(diào)節(jié)節(jié)間部分次級細(xì)胞壁相關(guān)基因表達(dá)。在此研究基礎(chǔ)上，Behr 等[43]通過對工業(yè)大麻莖節(jié)點(diǎn)3 個不同部位進(jìn)行RT－PCR 分析，發(fā)現(xiàn)工業(yè)大麻節(jié)點(diǎn)處存在從纖維伸長到纖維增厚的轉(zhuǎn)變，還發(fā)現(xiàn)了與細(xì)胞壁沉積相關(guān)的基因(如CesA6、FLA2和FLA6)，同時在節(jié)點(diǎn)內(nèi)、外部存在差異表達(dá)如:NST1 調(diào)節(jié)纖維分化因子，MYB46－1作為參與細(xì)胞壁生物合成和木聚糖生物合成的轉(zhuǎn)錄因子在節(jié)點(diǎn)內(nèi)部高表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞壁沉積的FLA3和WAT1在外部組織中高表達(dá)，因此，可推測工業(yè)大麻不同部位在纖維發(fā)育過程中存在生理和分子水平上的差異。同時，Van 等[44]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對兩個不同品種的工業(yè)大麻Chameleon 和Felina 34 在不同發(fā)育階段的不同組織進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)其差異基因木質(zhì)素生物合成基因(THF)和甲基化循環(huán)編碼酶(CCoAOMT、COMT)在稈芯組織中高表達(dá)，并調(diào)控木質(zhì)素的合成，同時在工業(yè)大麻伸長期的莖韌皮組織中，也發(fā)現(xiàn)了與苯丙素生物合成和次級細(xì)胞壁纖維素合成酶相關(guān)的基因顯著表達(dá)[39]。這些研究為逐步揭示工業(yè)大麻纖維發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組學(xué)機(jī)理、挖掘功能性基因以及生物合成代謝途徑提供了重要信息。

2.2.2 工業(yè)大麻纖維產(chǎn)量品質(zhì)轉(zhuǎn)錄組研究

工業(yè)大麻纖維產(chǎn)量的差異是內(nèi)因(基因型、生理)和外因(環(huán)境、農(nóng)藝措施)共同作用的結(jié)果。品種的產(chǎn)量和品質(zhì)差異是不同環(huán)境和栽培手段的最終體現(xiàn)[45－46]。關(guān)于不同品種纖維產(chǎn)量和品質(zhì)差異，Musio 等[47]將傳統(tǒng)的綠莖品種與黃莖品種在兩個收獲時期(花期和工藝成熟期)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)黃莖品種的纖維提取效率均比綠莖品種的高，該研究為挑選高纖維工業(yè)大麻品種提供了思路。即使在相同生長環(huán)境下，品種間的產(chǎn)量也被證實(shí)存在明顯差異[48－49]。因此提高纖維產(chǎn)量，選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的品種，并探索和規(guī)范高效配套種植技術(shù)至關(guān)重要。

工業(yè)大麻纖維發(fā)育可分為3 個階段:發(fā)育起始階段、伸長階段、細(xì)胞壁增厚階段，經(jīng)過這3 個階段逐步過渡可實(shí)現(xiàn)工業(yè)大麻從產(chǎn)量到品質(zhì)的轉(zhuǎn)變[39]。Koziel 等[50]利用RNA－Seq 對工業(yè)大麻韌皮纖維木質(zhì)化及次生壁發(fā)育進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)大麻纖維轉(zhuǎn)變的最佳靶基因是咖啡酸甲基轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(COMT2)、阿魏酸5 羥基化酶(F5H)和β－D 半乳糖苷酶(BGAL)。也有研究者利用RNA－Seq 和全基因組關(guān)聯(lián)分析協(xié)同對123 份大麻材料的纖維品質(zhì)相關(guān)性狀進(jìn)行遺傳分析，對不同纖維品質(zhì)性狀的16 個QTL 進(jìn)行定位(葡萄糖、木質(zhì)素、韌皮纖維含量等)，推測這些物質(zhì)對纖維品質(zhì)起著重要作用[51]。上述研究挖掘出纖維產(chǎn)量及品質(zhì)相關(guān)基因及生物代謝途徑，除遺傳因素外，有研究表明，工業(yè)大麻性別可影響其纖維產(chǎn)量和品質(zhì)[52]，工業(yè)大麻多為雌雄異株，而雄麻纖維品質(zhì)優(yōu)于雌麻，因此，Prentout 等[53]采用概率性方法SEX－DETector 對工業(yè)大麻所有基因進(jìn)行分離和分析，鑒定出約500 多個與性別連鎖的基因，再通過RNA－Seq 技術(shù)將這些基因映射，組裝獲得了大麻性染色體，從而了解了工業(yè)大麻性染色體系統(tǒng)。作為迄今為止記載最為久遠(yuǎn)的植物性染色體系統(tǒng)，推測其具有很大及高度分散的非重組區(qū)域，該研究通過了解工業(yè)大麻性染色體系統(tǒng)，相當(dāng)于了解了其基因組信息。

通過上述轉(zhuǎn)錄組測序?qū)I(yè)大麻纖維發(fā)育及產(chǎn)量品質(zhì)進(jìn)行研究，挖掘出許多相關(guān)基因(表1)。在工業(yè)大麻下胚軸次生生長過程中，也有研究者利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了與韌皮纖維伸長相關(guān)的XTH基因(如XTH5 和XTH8)[54－58]和轉(zhuǎn)錄因子NST1、MYB46和WLIM1，參與纖維素生物合成的COBRA家族[7](COB和COBL4基因)，以及次生細(xì)胞壁纖維素合成酶基因(CesA4、CesA7和CesA8)[42－45]。

表1 轉(zhuǎn)錄組測序篩選出的部分已知工業(yè)大麻基因Table 1 Some Cannabis stiva L genes screened by transcriptome sequencing

3 工業(yè)大麻非生物脅迫轉(zhuǎn)錄組研究

3.1 鹽脅迫

鹽害是一種常見的非生物脅迫，土壤鹽分過多會破壞土壤溶液滲透壓平衡，抑制植株細(xì)胞呼吸等生命活動，從而影響植物的生長發(fā)育，嚴(yán)重時可導(dǎo)致植株死亡。我國鹽堿地逐年增長且分布范圍逐漸擴(kuò)大，隨著我國人口增加和耕地不足矛盾日益凸顯，篩選抗性品種、加強(qiáng)鹽堿地利用以及開展邊際土壤改良是今后農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要方向，開展工業(yè)大麻耐鹽堿性研究、培育耐鹽品種具有重要應(yīng)用價值。工業(yè)大麻不同品種和不同生育期對鹽的敏感程度不同，在重度鹽環(huán)境下不能生長[59]。蘇文君等[60]首次利用7 個工業(yè)大麻品種通過水培法對其萌發(fā)期和幼苗期進(jìn)行NaCl脅迫研究，篩選不同條件下大麻幼苗期耐鹽性評價指標(biāo)，綜合比較品種的耐鹽性發(fā)現(xiàn):皖麻1 號耐鹽性最強(qiáng)，巴馬火麻耐鹽性最弱，并且篩選出株高、莖粗、鮮重和干重等6 個衡量耐鹽性指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上，另有研究者[61]以不同濃度NaCl 水溶液模擬鹽脅迫，對上述7 個工業(yè)大麻品種在萌發(fā)期和苗期的耐鹽性進(jìn)行對比研究:140 mmol/L NaCl 是大麻品種進(jìn)行耐鹽性鑒定的適宜濃度，且不同大麻品種在不同發(fā)育時期的耐鹽性存在較大差異，如在萌發(fā)期，晉麻1 號是耐鹽品種，巴馬火麻是不耐鹽品種，而在苗期，晉麻1 號是不耐鹽品種，巴馬火麻是耐鹽品種，研究者推測可能是大麻品種在不同時期具有不同耐鹽機(jī)理，萌發(fā)階段更多是通過抵抗?jié)B透脅迫來維持生長發(fā)育，而苗期則是啟動抵抗離子毒害程序。為了解工業(yè)大麻不同品種耐鹽性相關(guān)基因，劉家佳等[62]利用500 mmol/L NaCl 對2 個工業(yè)大麻品種植株葉片分別處理0、2、4、6 d，結(jié)合生理指標(biāo)測定及轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)2 種大麻生理反應(yīng)在脅迫2 d 時最激烈，并在2 個大麻品種中鑒定出都顯著上調(diào)的與耐鹽相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(MYB、NAC、GATA和HSF)。目前，NAC 轉(zhuǎn)錄因子已被大量證實(shí)響應(yīng)植物鹽脅迫，胡華冉等[63]基于劉家佳的研究基礎(chǔ)，篩選出4 個鹽脅迫應(yīng)答基因(CsNAC1、CsNAC2、CsGDH2和CsNAC3)。植株根部會采取不同的耐鹽策略響應(yīng)鹽堿脅迫，Cao 等[64]以耐受型品種火麻一號根部組織為材料，利用RNA－Seq 開展了NaHCO3脅迫下根部基因表達(dá)機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)在NaHCO3脅迫下植物可能通過調(diào)控激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與合成、苯丙素生物合成、淀粉、蔗糖、氮、氨基酸等代謝途徑響應(yīng)脅迫，并發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵通路的樞紐基因與GTP 結(jié)合蛋白、谷氨酸合成酶、海藻糖磷酸、糖基轉(zhuǎn)移酶和木質(zhì)素合成相關(guān)。該研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)與共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析聯(lián)合闡明了工業(yè)大麻對NaHCO3脅迫的分子響應(yīng)機(jī)制。此外也有研究者從蛋白質(zhì)組學(xué)角度，利用相對和絕對定量同位素標(biāo)記技術(shù)(iTRAO)開展耐鹽性品種的鹽脅迫蛋白應(yīng)激機(jī)制研究，結(jié)果表明，耐鹽型工業(yè)大麻能夠通過提高能量代謝、調(diào)節(jié)光合代謝來促進(jìn)有機(jī)物的滲透及合成，并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞物質(zhì)的進(jìn)出穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)平衡來適應(yīng)脅迫[58，65]。上述研究，轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果相互呼應(yīng)，為下一步綜合解析組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行工業(yè)大麻鹽堿適應(yīng)機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)參考。

3.2 干旱脅迫

水分作為植物的生命之源，也會對植物造成脅迫，可分為兩種情況，第一種是干旱脅迫，是指植物在缺水的環(huán)境中生長，本質(zhì)是因缺水抑制植物光合作用等生長發(fā)育活動；第二種是淹水脅迫，則是由于水分過多從而抑制植物根部的細(xì)胞呼吸，降低光合速率，進(jìn)而干擾植物正常生長。工業(yè)大麻干旱脅迫的研究更多采用不同生理指標(biāo)參數(shù)進(jìn)行抗旱性評價，從而篩選抗旱能力強(qiáng)的品種[66－69]。另外也有研究者通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究外源物質(zhì)對干旱脅迫下工業(yè)大麻脅迫的應(yīng)答機(jī)制，如楊志晶等[70]采用盆栽稱重控水法模擬干旱脅迫(50%基質(zhì)含水量)對“云麻1 號”進(jìn)行不同濃度的維生素C、甜菜堿、CaCl2和赤霉素處理，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析其抗旱生理響應(yīng)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)外源物質(zhì)可通過調(diào)節(jié)大麻的葉綠素、脯氨酸和可溶性糖的含量來緩解干旱損傷。烯效唑(S3307)作為一種高效低毒的三唑類植物生長延緩劑，在植物抗逆和增產(chǎn)方面效果顯著，通過外源噴施S3307及干旱脅迫協(xié)同處理，姜穎等[67]通過對工業(yè)大麻品種漢麻2 號進(jìn)行RNA－Seq 分析發(fā)現(xiàn)，S3307通過調(diào)控植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、光合作用、卟啉與葉綠素代謝等代謝通路中DEGs的表達(dá)來緩解干旱脅迫對工業(yè)大麻生長發(fā)育的損害，同時鑒定出S3307誘導(dǎo)調(diào)控干旱脅迫的差異基因IINV、TREH、PYG(3)、GBE1(2)、TPS(7)和β－淀粉酶。此外，Gao 等[71]通過RNA－Seq 分析篩選出與工業(yè)大麻抗旱性有關(guān)的過氧化物酶、擴(kuò)展蛋白、肌醇加氧酶、NAC和B3的轉(zhuǎn)錄因子。上述研究通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)工業(yè)大麻外施S3307等外源生長調(diào)節(jié)劑可調(diào)控光合作用、葉綠素等代謝途徑，以此來提高工業(yè)大麻的干旱適應(yīng)能力。

3.3 重金屬脅迫

重金屬主要指汞、鎘、鉛、鉻、銅和鋅類金屬砷等，重金屬對作物的影響從種子萌發(fā)階段開始，而種子能否萌發(fā)和是否正常萌發(fā)是決定作物產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵[72]。李增強(qiáng)等[73]研究發(fā)現(xiàn)，紅麻幼苗通過調(diào)節(jié)自身生命活動過程及代謝物來應(yīng)對鉛脅迫，該結(jié)果為研究分析麻類作物應(yīng)對重金屬脅迫提供了重要參考信息。為了明確工業(yè)大麻在重金屬脅迫下的研究機(jī)理，黃玉敏[74]對鎘脅迫處理12 h 下的工業(yè)大麻“Yuma 1”(Ym)和“Neimengguxiaoli”(Nx)的根部組織進(jìn)行RNA－Seq 分析，發(fā)現(xiàn)在鎘脅迫處理下，Ym 品種比Nx 品種耐鎘能力強(qiáng)，還發(fā)現(xiàn)在鎘脅迫時，工業(yè)大麻會啟動光合作用系統(tǒng)，并通過加快谷胱甘肽代謝等生物合成途徑來抵抗鎘毒害。在該研究基礎(chǔ)上，研究者在鎘處理?xiàng)l件下對兩個鎘耐受性不同的工業(yè)大麻進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)Ym 耐受品種比Nx 敏感品種具有更強(qiáng)的運(yùn)輸和累積能力，Ym 顯示了更強(qiáng)的解毒能力，同時通過RNA－Seq 分析也在兩個品種間鑒定出調(diào)控重金屬運(yùn)輸和氧化還原過程的且與鎘耐受相關(guān)的基因(WRKY、Myb和NAC轉(zhuǎn)錄因子)[75]。通過上述兩個研究可知，Ym 品種抗鎘性強(qiáng)，從基因水平揭示分子機(jī)制，挖掘抗鎘相關(guān)基因。同時，在探討緩解鎘脅迫對工業(yè)大麻影響技術(shù)方法方面，尹明[76]在有無原花青素的不同處理下協(xié)同鎘脅迫進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)外源原花青素與鎘離子會同時作用于EDS1 基因。因此推測該基因具有降低大部分植物激素相關(guān)基因表達(dá)量的功能，從而使植株利用原花青素與水楊酸，并通過光合作用、次級代謝物合成和抗氧化物質(zhì)合成等相關(guān)途徑來緩解鎘脅迫帶來的影響。

4 問題與展望

工業(yè)大麻用途廣泛，而國內(nèi)工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)主要圍繞纖維和籽實(shí)開展相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)，且采用的原料幾乎不含有THC，醫(yī)藥用途目前也僅利用CBD 成分[77]。隨著轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展，研究者通過工業(yè)大麻的基因組序列和表達(dá)信息開展調(diào)控關(guān)鍵性狀基因位點(diǎn)及代謝物合成途徑挖掘研究，將為解析調(diào)控優(yōu)異性狀分子機(jī)理奠定重要基礎(chǔ)[7]。然而相對其他麻類作物，工業(yè)大麻轉(zhuǎn)錄組研究大多集中于纖維發(fā)育基因表達(dá)調(diào)控及活性成分合成途徑，對于影響纖維和籽實(shí)等產(chǎn)量性狀關(guān)鍵調(diào)控因子、抗逆作用機(jī)制的研究還有很大的空間，同時，隨著工業(yè)大麻藥用價值日益提升，圍繞CBN和大麻萜酚(Cannabigerol，CBG)等稀有成分的生物合成途徑研究也將成為重點(diǎn)。近兩年，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)發(fā)展快速[78]，并已開始應(yīng)用到不同作物的研究中，接下來可以結(jié)合上述技術(shù)，彌補(bǔ)常規(guī)轉(zhuǎn)錄組技術(shù)方法研究的不足，并通過多組學(xué)聯(lián)合、生物工程等不同分子生物學(xué)方法共同闡明工業(yè)大麻重要性狀的表達(dá)調(diào)控策略，挖掘功能基因及揭示其遺傳多樣性。