王函,文輝,賴俊玉,蔣敏玲

糖尿病腎病(DN)是糖尿病患者死亡的主要原因之一[1],其發(fā)病機制與腎臟微炎癥、細胞外基質(zhì)擴張有關(guān)[2]。近年來,中國DN患病人數(shù)呈逐年增加趨勢。鈣通道阻滯劑治療DN雖有一定療效,但為了減輕這種共病的負擔,迫切需要新的策略。中藥常用于治療DN等慢性疾病,其中黃芪常用于營養(yǎng)調(diào)節(jié)和免疫調(diào)節(jié),既往研究將其作為DN的輔助治療,具有一定的遠期療效及安全性。鬼箭羽富含生物活性成分,具有降糖作用,推測鬼箭羽可能會在DN治療中發(fā)揮作用。黃芪—鬼箭羽方治療DN的療效能否進一步提高有待臨床驗證。黃芪—鬼箭羽方可用于治療DN及其他需活血解毒的證候,通過正向調(diào)節(jié)脾、腎功能以增強體內(nèi)正氣,但其具體分子機制有待進一步研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學在理論、方法和應(yīng)用上均可用于藥物發(fā)現(xiàn),是一種確定藥物靶點和分子機制的可行方法[3],利用網(wǎng)絡(luò)藥理學進行生物信息學分析可為中藥配方在臨床應(yīng)用提供新的策略。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)合體內(nèi)實驗揭示黃芪—鬼箭羽方治療DN的相關(guān)核心靶點及分子機制,以期為DN的中醫(yī)治療提供新途徑。

1 對象與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學分析方法

1.1.1 識別黃芪—鬼箭羽方的有效成分:利用PubMed、Google Scholar及中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫搜索和確定黃芪—鬼箭羽方的生物學和分子特征?；谀栰`感描述器分析,通過特定的算法和納入標準[4],對從黃芪—鬼箭羽方中提取的大分子和小分子進行篩選和鑒定。

1.1.2 黃芪—鬼箭羽方和DN的選擇目標:采用Swiss數(shù)據(jù)庫中的“Homo sapiens”發(fā)現(xiàn)黃芪—鬼箭羽方的有效成分。利用“糖尿病腎病”“DN”等關(guān)鍵詞預(yù)測人類基因,并通過GeneCards、Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)和Comparative Toxicogenomics Database(CTD)數(shù)據(jù)庫獲取簡明的基因組信息,并采用維恩圖在線平臺將黃芪—鬼箭羽方有效成分的映射靶點與DN相關(guān)聯(lián)[5]。

1.1.3 收集關(guān)鍵靶點,構(gòu)建交互網(wǎng)絡(luò):將黃芪—鬼箭羽方中對治療NE的有效成分的所有定位靶標輸入String數(shù)據(jù)庫,進行蛋白—蛋白相互作用(PPIs)的富集分析[5]。將黃芪—鬼箭羽方和DN中的相互靶標導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),隨物種調(diào)整參數(shù)為“Homo sapiens”,蛋白質(zhì)相互作用的最小閾值為中等置信度>0.5,校正P<0.05。采用Cytoscape軟件中的Network Analyzer工具識別關(guān)鍵靶點并描述其基本屬性,采用度值算法篩選靶點,將得分最高的靶點確定為黃芪—鬼箭羽方對抗DN的關(guān)鍵靶點[6]。

1.1.4 注釋和富集分析:使用Bioconductor軟件包“GOplot”和“ClusterProfiler”對黃芪—鬼箭羽方治療DN的總關(guān)鍵靶點的不同生物過程和分子途徑進行富集和注釋,該算法在導(dǎo)出數(shù)據(jù)前對P值(Cut-off為0.05)和Q值(Cut-off為0.05)進行標注和補充,以實現(xiàn)數(shù)據(jù)可視化[7]。

1.1.5 網(wǎng)絡(luò)可視化分析:采用Cytoscape軟件繪制表征和關(guān)聯(lián)黃芪—鬼箭羽方治療DN的有效成分中的關(guān)鍵靶點、生物過程和分子途徑,運用全面的圖表展示并可視化所有基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的發(fā)現(xiàn)。

1.2 實驗動物資料 選取雄性7周齡C57BL/6小鼠32只,由湖南STA實驗動物有限公司(中國長沙)購買。實驗程序得到桂林醫(yī)學院動物中心倫理委員會批準(批準號:GLMC202006001)。

1.3 實驗主要試劑 鏈脲佐菌素(上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn),批號S17049);黃芪—鬼箭羽方(廣東一方制藥有限公司生產(chǎn));牛血清白蛋白溶液(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn),批號AR0004),一抗Caspase-3(GASP3)/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn),批號33277M);二抗DyLight 488(碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn),批號A0423);DAPI試劑(碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn),批號C1002)。靈睿2型血糖儀和血糖試紙(杭州艾康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn),批號202102038)。尿蛋白定量測試盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn),批號20210411)。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)ELISA試劑盒(蘇州艾萊薩生物科技有限公司生產(chǎn),批號分別為E20210201A、E20211201A)。

1.4 實驗動物建模及治療方法 將實驗小鼠飼養(yǎng)1周,取8只正常小鼠設(shè)為空白對照組,每天僅采用水提取液(10 ml/kg、20 ml/kg)進行灌胃。取24只小鼠制作DN模型(血糖>11.5 mmol/L)[8],將其中8只納入DN組,每天僅采用水提取液(10 ml/kg、20 ml/kg)進行灌胃;16只每天予黃芪—鬼箭羽方(黃芪∶鬼箭羽為2∶1)進行灌胃,其中8只給藥劑量為10 ml/kg,為小劑量組,8只給藥劑量為20 ml/kg,為大劑量組。各組均灌胃4周。

1.5 觀察指標與方法 比較4組小鼠腎臟指數(shù)、血糖、體質(zhì)量、尿蛋白及血清TNF-α、IL-6水平及GASP3、RAC-α絲氨酸/AKT1陽性細胞。灌胃4周后,小鼠禁食,用血糖監(jiān)測儀測定血糖水平;通過生化試劑盒收集小鼠尿液樣本測定蛋白尿,并通過冷凍離心分離血液樣品并制備血清,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定血清TNF-α和IL-6水平。此外,將小鼠處死,分離小鼠腎臟樣品并儲存在-80 ℃下進行免疫熒光染色,測量腎臟重量,計算腎臟指數(shù)。

免疫熒光染色:用5～6 μm石蠟切片制備蠟包埋的腎組織,將這些切片在用5%新鮮制備的牛血清白蛋白溶液封閉前,先進行脫蠟和再水合。洗滌后,切片與一抗GASP3/AKT1(1∶200,細胞信號傳導(dǎo),美國;1∶100,波斯特,中國)在4 ℃下孵育過夜。洗滌后,切片再次與二抗DyLight 488孵育。細胞核用DAPI試劑染色。如前所述,在不同的顯微鏡視圖下篩選并確定腎臟切片中的綠色熒光陽性細胞,進行細胞計數(shù)。在陽性細胞計數(shù)前,至少使用4個非重疊點進行成像以篩選陽性細胞。

2 結(jié) 果

2.1 候選靶標和蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 通過現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)2 962個DN敏感靶點,還確定了247個黃芪和172個鬼箭羽有療效的靶點,進一步分析確定了黃芪—鬼箭羽方和DN的113個相互關(guān)聯(lián)靶點,見圖1。使用SPRING數(shù)據(jù)庫收集了這113個相互關(guān)聯(lián)靶點與功能相關(guān)的PPIs數(shù)據(jù),構(gòu)建黃芪—鬼箭羽方與DN相關(guān)的靶功能相互作用網(wǎng)絡(luò),見圖2。

圖1 黃芪—鬼箭羽方與DN的靶點及共同靶點維恩圖

圖2 黃芪—鬼箭羽方中所有共享靶點與DN相關(guān)性的網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 拓撲參數(shù)和核心靶點的發(fā)現(xiàn) 對黃芪—鬼箭羽方與DN進行拓撲分析后,目標點的中位數(shù)自由度為36.839,最大自由度為88。隨后,確定核心靶點的標準范圍為74～88。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪—鬼箭羽方對抗DN的詳細核心靶點包括AKT1、IL-6、細胞腫瘤抗原p53(TP53)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、腫瘤壞死因子(TNF)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、CASP3,見圖3。

圖3 確定黃芪—鬼箭羽方對抗DN的所有核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 基因本體論(GO)相關(guān)過程和信號通路 對美沙拉嗪抗結(jié)腸炎的7個核心靶點進行了基于氧化石墨烯和京都基因和基因組百科全書(KEGG)的富集分析,GO分析的生物過程包括葡萄糖輸入調(diào)節(jié)、葡萄糖輸入、葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)、葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運、胰高血糖素分泌、白細胞激活參與炎性反應(yīng)、神經(jīng)炎性反應(yīng),積極調(diào)節(jié)神經(jīng)炎性反應(yīng)及急性炎性反應(yīng),調(diào)控IL-6水平,參與免疫反應(yīng)細胞因子產(chǎn)生的調(diào)控、免疫系統(tǒng)過程的負調(diào)控、參與免疫反應(yīng)的細胞因子的產(chǎn)生及淋巴細胞介導(dǎo)的免疫的正調(diào)控,見圖4。

圖4 基于GO的頂級計數(shù)篩選核心靶點

KEGG相關(guān)分子通路包含糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、胰島素抵抗、細胞因子—細胞因子受體相互作用、TNF信號通路、白介素-17(IL-17)信號通路、T細胞受體信號通路、B細胞受體信號通路、Th17細胞分化、自然殺傷細胞介導(dǎo)的細胞毒性、MAPK信號通路、Toll樣受體信號通路、c型凝集素受體信號通路、低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號通路、鞘脂信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、PI3K-AKT信號通路、松弛素信號通路、Nod樣受體信號通路、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號通路、Fc蛋白RI信號通路,見圖5。

圖5 核心靶點中篩選KEGG的頂級計數(shù)

2.4 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系發(fā)現(xiàn) 整合了網(wǎng)絡(luò)藥理學的研究結(jié)果,以突出黃芪—鬼箭羽方抗DN的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,這些網(wǎng)絡(luò)關(guān)系與所有核心靶點、基于GO的生物過程和KEGG相關(guān)的分子途徑有關(guān),見圖6。

圖6 黃芪—鬼箭羽方抗DN的核心靶點、生物學過程和分子通路間網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 4組小鼠臨床治療效果比較 與空白對照組相比,DN組、小劑量組、大劑量組腎臟指數(shù)、血糖、尿蛋白及血清TNF-α、IL-6水平升高,體質(zhì)量降低(P<001);與DN組相比,小劑量組、大劑量組腎臟指數(shù)、血糖、尿蛋白及血清TNF-α、IL-6水平降低,體質(zhì)量增加(P<0.01);與小劑量組相比,大劑量組腎臟指數(shù)、血糖、尿蛋白及血清TNF-α、IL-6水平降低,體質(zhì)量增加(P<0.01),見表1。

表1 4組小鼠臨床治療效果比較

2.6 4組小鼠GASP3和AKT1陽性細胞數(shù)比較 與空白對照組相比,DN組、小劑量組、大劑量組GASP3和AKT1陽性細胞數(shù)增多(P<0.01);與DN組相比,小劑量組、大劑量組GASP3和AKT1陽性細胞數(shù)減少(P<0.01);與小劑量組相比,大劑量組GASP3和AKT1陽性細胞數(shù)減少(P<0.01),見表2。

表2 4組小鼠GASP3和AKT1陽性細胞數(shù)比較個,n=8)

3 討 論

DN是一種由高血糖引起的腎炎綜合征,在糖尿病終末期可惡化,導(dǎo)致腎衰竭,因此,需采用藥物治療DN,現(xiàn)有部分中藥被用于DN的預(yù)防和治療,如黃芪、鬼箭羽。中草藥可有效糾正代謝異常,減輕炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng),增強免疫功能,并調(diào)節(jié)腎微小RNA[9]。既往有研究概述了黃芪、鬼箭羽治療DN的治療效果[10],但黃芪和鬼箭羽治療DN的藥理機制尚不清楚。本研究通過計算和算術(shù)數(shù)據(jù)確定了黃芪—鬼箭羽方對抗DN的候選和核心靶點及信號通路,核心靶點包括AKT1、IL-6、TP53、VEGFA、TNF、JUN、CASP3,這些關(guān)鍵基因在功能上可減輕炎性反應(yīng)、增強機體免疫和改善腎組織微環(huán)境。中醫(yī)學理論認為,采用黃芪—鬼箭羽方治療DN具有“腎消”“水腫”和“關(guān)格”的抑制作用。本研究結(jié)果顯示,與DN組相比,小劑量組、大劑量組腎臟指數(shù)、血糖、尿蛋白及血清TNF-α、IL-6水平降低,體質(zhì)量增加;與小劑量組相比,大劑量組腎臟指數(shù)、血糖、尿蛋白及血清TNF-α、IL-6水平降低,體質(zhì)量增加,表明黃芪—鬼箭羽方治療DN小鼠可增加體質(zhì)量,減小腎臟,降低血糖、尿蛋白和炎性細胞因子,尤其大劑量用藥效果更佳。前一項體內(nèi)研究結(jié)果表明,黃芪—鬼箭羽方通過藥理活性可有效抑制DN。通過進一步的網(wǎng)絡(luò)藥理學數(shù)據(jù)驗證,黃芪—鬼箭羽方處理的DN樣本突出了GASP3、AKT1的腎內(nèi)蛋白表達以劑量依賴的方式下調(diào)。GASP3在與程序性細胞凋亡或增殖相關(guān)的內(nèi)在和外在途徑中起著關(guān)鍵作用。據(jù)報道,激活GASP3表達會促進DN的發(fā)生發(fā)展。AKT1是一種原癌基因,在癌細胞中過度活躍,被認為是人類惡性腫瘤的脆弱基因。既往有報道稱,AKT1與小鼠腎內(nèi)缺血—再灌注損傷過程中的腎小管細胞凋亡和炎性反應(yīng)有關(guān)[11]。根據(jù)目前的網(wǎng)絡(luò)藥理學分析,已確定的黃芪—鬼箭羽方的抗DN功能參與了炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細胞因子的產(chǎn)生和凋亡信號傳導(dǎo)。因此,本研究結(jié)果提示,與DN組相比,小劑量組、大劑量組GASP3和AKT1陽性細胞數(shù)降低;與小劑量組相比,大劑量組GASP3和AKT1陽性細胞數(shù)降低,表明黃芪—鬼箭羽方的抗DN作用與GASP3/AKT1功能調(diào)節(jié)有關(guān),尤其是大劑量用藥效果更佳,后續(xù)還需進一步確定黃芪—鬼箭羽方中的抗DN靶點。

PharmMapper是一種表征黃芪—鬼箭羽方有效成分化學結(jié)構(gòu)的有效工具。Swiss-Prot的其他數(shù)據(jù)庫,如Uniprot,旨在識別目標序列。本文采用生物信息學和實驗數(shù)據(jù)揭示了黃芪—鬼箭羽方對抗DN的藥理機制和靶點。值得關(guān)注的是,一些核心靶點已經(jīng)在黃芪—鬼箭羽方處理的DN小鼠中被驗證,包括GASP3、AKT1。然而,在未來臨床應(yīng)用黃芪—鬼箭羽方治療DN前,還需進行更多的臨床前驗證研究。

綜上所述,通過網(wǎng)絡(luò)藥理學揭示了黃芪—鬼箭羽方抗DN的藥理機制和靶點,臨床前實驗表明黃芪—鬼箭羽方可有效治療DN,尤其是大劑量用藥效果更佳。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。