張圓琳,祁曉鳴,馮逸佳,衛(wèi)紫琪,宋麗娟

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院,晉中 030619;2.山西中醫(yī)藥大學(xué)基于炎性反應(yīng)的重大疾病創(chuàng)新藥物山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,晉中 030619;3.國家中醫(yī)藥管理局多發(fā)性硬化益氣活血重點(diǎn)研究室,晉中 030619)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥,也是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因[1-2]。目前,臨床主要通過降壓、降糖的方式控制DN進(jìn)展,尚無針對DN的特異治療方法[3]。中醫(yī)在辨證論治的基礎(chǔ)上,開發(fā)了多種防治DN的中藥復(fù)方及制劑[4-7],參芪地黃降糖顆粒、金水寶膠囊、益腎健脾湯等已被臨床廣泛使用并且取得了良好的治療效果。但是,中藥成分復(fù)雜,物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不明確,阻礙了中醫(yī)藥現(xiàn)代化的研究進(jìn)程。數(shù)據(jù)挖掘[8-9]為系統(tǒng)地認(rèn)識(shí)中醫(yī)藥治療疾病的組方規(guī)律、指導(dǎo)處方加減化裁、擬定新方提供了合理的解決辦法。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[10]為分析中藥治療DN的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制開辟了新方向。生物膜干涉[11]已被廣泛應(yīng)用于中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的研究中,為驗(yàn)證中藥活性成分與DN核心蛋白的相互作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究以古今醫(yī)案云平臺(tái)DN專病醫(yī)案庫為基礎(chǔ),利用數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及生物膜干涉的方法,探索中醫(yī)治療DN的用藥規(guī)律,發(fā)現(xiàn)核心藥對組合及其治療DN的作用機(jī)制,為臨床合理選用DN治療藥物提供新思路及新方法。

1 材料與方法

1.1材料 ForteBio Octet K2生物膜干涉儀(FortiBio公司),異鼠李素、槲皮素(含量>98%,成都曼思特公司),人重組白細(xì)胞介素(interleukin,IL)6蛋白(Sino Biological公司)。

1.2數(shù)據(jù)來源與分析 “古今醫(yī)案云平臺(tái)”由中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥信息研究所大健康智能研發(fā)中心設(shè)計(jì)研發(fā),該平臺(tái)收錄醫(yī)案數(shù)據(jù)40余萬條,兼具醫(yī)案檢索與分析挖掘功能,是總結(jié)中醫(yī)藥經(jīng)驗(yàn)的重要工具。在該平臺(tái)的專病醫(yī)案庫中選擇疾病種類為DN,并進(jìn)行嚴(yán)格篩選:西醫(yī)診斷明確為DN,不伴隨其他并發(fā)疾病,僅使用中藥治療,且中藥處方組成完整。利用平臺(tái)的數(shù)據(jù)挖掘功能,對病案中涉及的中藥進(jìn)行頻次統(tǒng)計(jì)及藥物關(guān)聯(lián)分析。

1.3化學(xué)成分靶點(diǎn)篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP),對核心藥對化學(xué)成分及相應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行篩選,參數(shù)[10]設(shè)為:口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%及類藥性(drug like,DL)≥0.18。

1.4DN靶點(diǎn)篩選 以“Diabetic Nephropathy”及“Diabetic Kidney Disease”為關(guān)鍵詞在TTD、DISGENET及GENE CARD數(shù)據(jù)庫收集疾病靶基因并進(jìn)行整合。在OmicShare平臺(tái)繪制DN靶基因與藥物靶基因韋恩圖,取交集得到核心藥對治療DN的潛在靶點(diǎn)。

1.5核心藥對治療DN蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI )網(wǎng)絡(luò)及化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在STRING網(wǎng)站構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò),選擇物種為Homo sapiens,交互作用可信度(combined score)閾值≥0.7,其余參數(shù)為默認(rèn)值。運(yùn)用Cytoscape 3.7.1版軟件將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)可視化,獲得PPI網(wǎng)絡(luò)中前10的關(guān)鍵基因,其中,節(jié)點(diǎn)大小、顏色深淺與度值正相關(guān),作為關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選依據(jù),同時(shí)構(gòu)建化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6基因功能和通路富集分析 利用生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,DAVID),設(shè)置P<0.05為篩選條件,對篩選到的靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物學(xué)功能和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes,KEGG)富集分析。

1.7黃芪-丹參-茯苓藥對化學(xué)成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對接 利用Sybyl-2.1軟件的SurFlex-Dock(SFXC)模塊對該藥對中的化學(xué)成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接研究。小分子優(yōu)化選用Tripos力場,電荷類型為Gasteiger-Huckel,Gradient設(shè)為0.005,Max Iteration設(shè)為1 000次。蛋白做殘基修飾,加氫,Amber7 FF99力場下加AMBER電荷,生成口袋,進(jìn)行柔性對接。

1.8生物膜干涉實(shí)驗(yàn) 使用Octet K2生物分子互作儀,檢測異鼠李素、槲皮素與IL-6的結(jié)合。將人重組IL-6蛋白包被于超級(jí)鏈霉親和素(super streptavidin,SSA)傳感器,浸沒于不同濃度的化合物溶液中,結(jié)合、解離時(shí)間均為60 s。采用Data Analysis 11版軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行收集與分析。

2 結(jié)果

2.1中藥使用頻次統(tǒng)計(jì) 篩選出2008—2018年間101例患者的醫(yī)案183條。涉及中藥333味,總用藥頻次1 050次。使用頻次居前10位的中藥及其用量見表1。在183條醫(yī)案所記載方劑中,黃芪出現(xiàn)43次,為使用頻次最高的一味中藥,而且方中重用黃芪,平均使用劑量為37 g,最大使用劑量達(dá)到了60 g;丹參與茯苓次之,使用頻次均為36次,平均使用劑量分別為23、21 g,最大使用劑量也分別達(dá)到了30、45 g。

表1 治療DN的中藥使用頻次(前10位)及劑量

2.2藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 置信度反映了前一種中藥出現(xiàn)時(shí),后一種中藥也出現(xiàn)的概率;提升度則表明兩藥之間的相關(guān)性,提升度>1表明正相關(guān)性越高,提升度<1且越低則表明負(fù)相關(guān)性越高,提升度=1則表明無相關(guān)性。在置信度≥0.60,且提升度≥1.00的條件下,得到藥物關(guān)聯(lián)分析結(jié)果(表2)。對183條醫(yī)案所記載方劑中的中藥進(jìn)行組方規(guī)律分析,方藥中以黃芪(單獨(dú)出現(xiàn)43次)為基礎(chǔ),同時(shí)配伍茯苓、丹參的頻次分別為28次與25次,是組方中與黃芪配伍最多的2味中藥。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步分析了黃芪-丹參-茯苓同時(shí)出現(xiàn)的頻次為19次,具有最高的置信度與提升度。因此,選擇這3味中藥作為臨床治療DN的常用藥對,并利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對其作用機(jī)制進(jìn)行研究。

表2 高頻中藥關(guān)聯(lián)分析

2.3黃芪-丹參-茯苓化學(xué)成分篩選 篩選到化學(xué)成分共計(jì)100個(gè),黃芪20個(gè),丹參65個(gè),茯苓15個(gè),多為三萜類、酚酸類、黃酮類及甾體類化合物。部分化合物信息見表3。

表3 黃芪-丹參-茯苓中的成分

2.4黃芪-丹參-茯苓治療DN潛在靶點(diǎn)預(yù)測 使用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到100個(gè)化學(xué)成分對應(yīng)的144個(gè)靶點(diǎn),與TTD、DISGENET及GeneCards數(shù)據(jù)庫中的DN疾病靶點(diǎn)取交集,發(fā)現(xiàn)共同靶點(diǎn)89個(gè)(圖1),即為黃芪-丹參-茯苓治療DN的潛在靶點(diǎn)。

圖1 黃芪-丹參-茯苓靶點(diǎn)與DN靶點(diǎn)韋恩圖

2.5黃芪-丹參-茯苓治療DN PPI網(wǎng)絡(luò)及成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)結(jié)果分析 將“2.4節(jié)”中89個(gè)藥物-疾病共同靶點(diǎn)作PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖2),共包含79個(gè)節(jié)點(diǎn),337條邊,平均節(jié)點(diǎn)度為8.53。選取節(jié)點(diǎn)度值大于2倍度值均數(shù)的蛋白作為黃芪-丹參-茯苓防治DN的關(guān)鍵靶蛋白。其中排名前10的靶點(diǎn)是IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、血管內(nèi)皮生長因子A (vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)8、MAPK1、JUN、TP53、IL-1β、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)和前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2(prostaglandin endoperoxide synthase 2,PTGS2),為該藥對治療DN的核心靶點(diǎn)。藥對-化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖展示了100個(gè)化合物與89個(gè)靶點(diǎn)的作用情況(圖3)。綠色圓形代表黃芪、丹參、茯苓3種中藥,粉色圓形、亮綠色圓形及黃色圓形代表3種中藥對應(yīng)的化學(xué)成分,棕色圓形代表黃芪與茯苓的共有成分,藍(lán)色圓形代表疾病,紅色圓形代表靶點(diǎn)。在網(wǎng)絡(luò)中,化合物作用的靶點(diǎn)數(shù)越多,度值越高,據(jù)此列出了前10個(gè)化學(xué)成分,括號(hào)里為度值:槲皮素(57)、山奈酚(29)、木犀草素(26)、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇(25)、刺芒柄花素(23)、異鼠李素(22)、丹參新醌(21)、二氫丹參內(nèi)酯(18)、鼠尾草酚酮(17)、丹參酮ⅡA(16)。由此可見,同一種成分可以與多個(gè)靶點(diǎn)對應(yīng),同一個(gè)靶點(diǎn)亦可以與多種成分對應(yīng),說明藥材中多種成分可通過作用于多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮協(xié)同治療作用,體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

2.6KEGG富集分析 KEGG富集分析結(jié)果根據(jù)P值列出前15條通路,并繪制高級(jí)氣泡圖(圖4)。其中包括腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、Toll樣受體信號(hào)通路(Toll-like receptor signaling pathway)、NOD樣受體信號(hào)通路(NOD-like receptor signalingpathway)等。與藥物成分、靶點(diǎn)相關(guān)程度最高的通路為TNF炎癥信號(hào)通路,共富集到9個(gè)基因。其中,IL-6與TNF-α位于TNF炎癥信號(hào)通路最下游,是該通路激活后釋放的關(guān)鍵促炎因子。提示TNF炎癥信號(hào)通路和靶點(diǎn)可能是黃芪-丹參-茯苓組分抗DN的核心途徑和潛在作用靶點(diǎn)。

圖4 核心靶基因KEGG富集分析氣泡圖

2.7黃芪-丹參-茯苓藥對化學(xué)成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對接結(jié)果 將“2.5節(jié)”中列出的10個(gè)化合物與IL-6(PDB ID 4cni)、TNF(PDB ID 2az5)及VEGFA(PDB ID 4kzn)進(jìn)行分子對接研究,按照Total Score得分高低進(jìn)行排序(表4),Total Score≥5即認(rèn)為化合物與靶點(diǎn)有較好結(jié)合,對接得分值>7提示具有強(qiáng)烈的結(jié)合作用[12]。化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)IL-6的時(shí)按得分均>5,其中7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇、異鼠李素、槲皮素和丹參酮ⅡA與IL-6的對接得分均>7,具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性。因此,選取這4個(gè)化合物與IL-6進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

表4 活性成分與靶蛋白的分子對接

2.8異鼠李素、槲皮素與IL-6的結(jié)合作用 生物膜干涉實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在10～100 μmol·L-1濃度區(qū)間,異鼠李素、槲皮素與IL-6有較強(qiáng)的結(jié)合作用力,解離常數(shù)(KD)分別為56與68 μmol·L-1,這與分子對接的結(jié)果基本吻合,并且呈現(xiàn)出迅速結(jié)合,迅速解離的趨勢(圖5)。盡管7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇與IL-6具有最高的得分,但是化合物難以獲得;丹參酮ⅡA與SSA傳感器存在強(qiáng)烈的非特異性結(jié)合,導(dǎo)致擬合數(shù)據(jù)異常。因此,實(shí)驗(yàn)中僅檢測了異鼠李素、槲皮素與IL-6的結(jié)合作用。

圖5 活性成分(異鼠李素和槲皮素)與IL-6的結(jié)合解離圖

3 討論

本研究利用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)對古今醫(yī)案云平臺(tái)DN專病醫(yī)案庫進(jìn)行用藥規(guī)律分析。共納入有效方劑183條,涉及中藥333味。發(fā)現(xiàn)臨床治療DN使用次數(shù)最多的是黃芪(43次)、其次是丹參(36次)、茯苓(36次)、山藥(23次)、澤瀉(21次)等。方中重用黃芪,以加強(qiáng)補(bǔ)氣之功效;丹參活血祛瘀;茯苓兼具補(bǔ)氣與利水之功效,符合中醫(yī)治療DN的原則。以黃芪為基礎(chǔ),通過對不同藥物進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)“黃芪-丹參-茯苓”為治療DN的最基本組合。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析了“黃芪-丹參-茯苓”治療DN的作用機(jī)制。成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集后,發(fā)現(xiàn)了共同靶點(diǎn)89個(gè)。對它們進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析,篩選到節(jié)點(diǎn)度值>2倍平均度值的核心靶點(diǎn)10個(gè),依次為IL-6、TNF、VEGFA、MAPK8、MAPK1、JUN、TP53、IL-1β、EGF和PTGS2。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵信號(hào)通路包括TNF炎癥信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路以及Toll樣受體信號(hào)通路,它們在調(diào)節(jié)腎臟疾病的炎癥反應(yīng)中起重要作用[13-14],而炎癥是DN發(fā)生與發(fā)展的重要病理因素[15]。TNF炎癥信號(hào)通路共富集到基因9個(gè),包括IL-6、TNF-α及IL-1β等核心靶點(diǎn),這些促炎因子均位于TNF炎癥信號(hào)通路最下游,激活后會(huì)加重炎癥反應(yīng),涉及DN的各個(gè)階段。研究發(fā)現(xiàn),IL-6作為一種促炎因子,通過與IL-6受體或其他蛋白質(zhì)形成復(fù)合物,激活下游的免疫、炎癥反應(yīng),損傷腎小球、系膜細(xì)胞、足細(xì)胞等腎臟細(xì)胞,使腎小球基底膜增厚,出現(xiàn)蛋白尿,誘發(fā)、加劇DN[16]。研究表明,重組的抗IL-6受體融合蛋白[17]通過阻斷IL-6受體,抑制了IL-6信號(hào)通路下游的免疫、炎癥反應(yīng),從而對DN起到了一定的治療作用。這也提示,通過靶向IL-6,而不是IL-6受體來阻斷IL-6信號(hào)通路引起的炎癥反應(yīng),可能是未來治療DN的一種新選擇。

通過研究中藥活性成分與靶蛋白的相互作用,有利于闡明中藥藥理作用機(jī)制。分子對接技術(shù)與生物膜干涉技術(shù)可分別在虛擬篩選及體外實(shí)驗(yàn)水平分析藥物分子與靶蛋白之間的相互作用。生物膜干涉技術(shù)[18]可以實(shí)時(shí)檢測蛋白質(zhì)與藥物小分子的相互作用情況,廣泛應(yīng)用于中藥活性成分發(fā)現(xiàn)與作用機(jī)制研究。通過測定動(dòng)力學(xué)常數(shù),可以反映藥物小分子與蛋白質(zhì)間的結(jié)合情況。解離常數(shù)(KD)值可反映小分子與靶蛋白的結(jié)合強(qiáng)度,結(jié)合速率常數(shù)(association rate constant,Kon)與解離速率常數(shù)(dissociation rate constant,Koff)可反映小分子與靶蛋白的作用特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,異鼠李素和槲皮素與IL-6的對接得分值>7,具有強(qiáng)烈的結(jié)合作用。生物膜干涉實(shí)驗(yàn)也證實(shí)2種成分與IL-6具有較強(qiáng)的結(jié)合作用力,并且呈現(xiàn)出迅速結(jié)合,迅速解離的趨勢,預(yù)示上述2種成分具有抑制IL-6信號(hào)通路、減輕炎癥反應(yīng)的潛力。

因此,TNF炎癥信號(hào)通路和IL-6可能是“黃芪-丹參-茯苓”治療DN的核心途徑和潛在作用靶點(diǎn)。本研究篩選到的槲皮素[19]、山奈酚[20]及木犀草素[21]已被證實(shí)對DN具有治療作用,但是作用機(jī)制尚不明確,特別是針對IL-6信號(hào)通路的研究較少。后續(xù)研究中仍需擴(kuò)大分析樣本,聯(lián)合使用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段,在細(xì)胞及動(dòng)物水平觀察核心成分對IL-6信號(hào)通路以及細(xì)胞生物功能的調(diào)節(jié)作用。