宋麗麗,霍姍浩,馮夢(mèng)琪,楊旭,張志平,張靖楠,魏濤

鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,河南 鄭州 450001

0 引言

以生物質(zhì)可再生資源為原料,通過生物技術(shù)加工制造生物能源和生物材料產(chǎn)品,是實(shí)現(xiàn)資源可持續(xù)發(fā)展和解決環(huán)境污染問題的重要途徑。煙稈是煙草農(nóng)業(yè)的主要廢棄物,全球每年可產(chǎn)生約2.6×108t煙稈廢棄物[1],煙稈中含有大量的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素,是潛在的高值化生物質(zhì)資源。但與玉米秸稈、麥稈等普通農(nóng)作物秸稈不同,如果將煙稈直接還田,它含有的尼古丁成分對(duì)土壤及水環(huán)境均會(huì)產(chǎn)生一定程度的污染,從而帶來嚴(yán)重的環(huán)境問題[2]。因此,發(fā)展煙稈高值化清潔利用是實(shí)現(xiàn)煙草廢棄物綠色低碳循環(huán)發(fā)展的重要研究方向。

乳酸是一種重要的有機(jī)酸,廣泛存在于人體、動(dòng)植物及微生物中,在食品、制藥、紡織、皮革、卷煙等工業(yè)中有廣泛應(yīng)用[3]。以L-乳酸為原料合成的聚乳酸制品具有環(huán)保、無毒、可降解、食用后可代謝等特點(diǎn),受到行業(yè)的廣泛關(guān)注[4]。傳統(tǒng)乳酸生產(chǎn)所用的原料主要為淀粉和糖,不僅生產(chǎn)成本較高,還存在與人爭(zhēng)糧等問題[5]。因此,發(fā)展以非糧低成本木質(zhì)纖維素作為原料發(fā)酵產(chǎn)乳酸成為當(dāng)前的研究重點(diǎn)[6-8]。煙稈中含有的纖維素、半纖維素等物質(zhì),可作為微生物發(fā)酵生產(chǎn)乳酸潛在的底物來源[9]。但由于煙稈存在抗性屏障作用強(qiáng)、可利用底物釋放難度大、尼古丁抑制作用強(qiáng)等問題[1-2,9],需采用一定的預(yù)處理手段,促進(jìn)糖類物質(zhì)釋放,以供微生物發(fā)酵生產(chǎn)乳酸。常規(guī)理化預(yù)處理手段(如酸處理、堿處理等)雖然能破壞木質(zhì)纖維素的屏障作用,提升纖維素酶解轉(zhuǎn)化效率,但酸堿反應(yīng)過程會(huì)產(chǎn)生對(duì)后期發(fā)酵存在抑制性的副產(chǎn)物(如糠醛、5-羥甲基糠醛、酚類物質(zhì)等),加大了生物脫毒的難度[10-11]。相較于常規(guī)理化預(yù)處理手段,生物預(yù)處理具有反應(yīng)條件溫和、能耗低、無污染、抑制物少等優(yōu)點(diǎn)[12]。Y.L.Su等[2]以煙稈為基質(zhì),對(duì)比分析了白腐菌Trametesversicolor、T.hirsute和Phanerochaetechrysosporium對(duì)煙稈的降解及產(chǎn)酶情況,發(fā)現(xiàn)3種白腐菌不僅能降解煙稈中的尼古丁,還能選擇性降解煙稈中的木質(zhì)素,為煙稈脫毒及資源化利用提供了新思路。乳白耙菌(Iprexlacteus)作為一種高效木質(zhì)素降解菌,具有較強(qiáng)的抗逆性、抗雜能力和選擇性[13-15],在生物質(zhì)煉制[16]、環(huán)境污染物降解[17]等方面具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

糖類物質(zhì)在發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乳酸的過程中存在糖化酶解與發(fā)酵溫度不一致、糖類物質(zhì)共利用困難、易發(fā)生糖類底物抑制等問題[3,18]。與目前乳酸工業(yè)生產(chǎn)菌種(乳酸桿菌屬細(xì)菌)相比,凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)發(fā)酵生產(chǎn)乳酸具有營(yíng)養(yǎng)要求低、木糖利用高效、發(fā)酵溫度高、生長(zhǎng)快速等優(yōu)勢(shì)[19],且對(duì)各種抑制物的耐受力較強(qiáng)[20],適用于木質(zhì)纖維素乳酸轉(zhuǎn)化?；诖?本文擬采用乳白耙菌預(yù)處理煙稈,比較處理前后煙稈組成、結(jié)構(gòu)及酶解產(chǎn)糖效率的變化情況,分析可利用糖類釋放機(jī)制,并利用凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵煙稈產(chǎn)乳酸,比較不同發(fā)酵方式下乳酸的轉(zhuǎn)化率,以期為煙稈的資源化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

主要材料:煙稈,取自河南鄭州,于60 ℃干燥箱中烘干至恒重,置于干燥處備用。乳白耙菌、凝結(jié)芽孢桿菌,保存于鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院。

主要試劑:纖維素酶、木聚糖酶,美國(guó)Sigma-Aldrich 試劑公司;葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和乳酸標(biāo)準(zhǔn)品,均為色譜純,美國(guó)Sigma-Aldrich 試劑公司;其他化學(xué)試劑均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S20145927型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、TY283788298型生化培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;TY014003862型無菌操作臺(tái),鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;Vertex70型傅里葉紅外光譜儀,德國(guó)布魯克公司;Agilent-1290型高效液相色譜(HPLC)儀,美國(guó)安捷倫公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基制備馬鈴薯液體培養(yǎng)基(PDY)(1 L):20 g馬鈴薯浸出液,2 g蔗糖,121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯固體培養(yǎng)基(PDA)(1 L):20 g 馬鈴薯浸出液,2 g 蔗糖,2 g瓊脂,121 ℃滅菌20 min。

乳酸菌厭氧培養(yǎng)基(MRS)(1 L):蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,酵母粉5 g,K2HPO42 g,檸檬酸二銨2 g,乙酸鈉5 g,葡萄糖20 g,吐溫-80 1 mL,MgSO4·7H2O 0.58 g,MnSO4·4H2O 0.25 g,調(diào)節(jié)pH值至 6.2～6.4,121 ℃滅菌20 min。

煙稈培養(yǎng)基:稱取10 g煙稈裝入250 mL三角瓶,加入10 mL蒸餾水,塑料膜封口,121 ℃滅菌30 min。

1.3.2 煙稈預(yù)處理將乳白耙菌斜面上劃分的小塊接種至PDY培養(yǎng)基,搖床(28 ℃、120 r/min)培養(yǎng)7 d,吸取4份5 mL菌球至煙稈培養(yǎng)基中,28 ℃分別靜置培養(yǎng)5 d、10 d、15 d和20 d后,將各樣品于60 ℃干燥箱中烘干至恒重,備用。

1.3.3 煙稈物化性能測(cè)定1)組分測(cè)定。參考美國(guó)國(guó)家可再生能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(NREL)方法測(cè)定煙稈中纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[21],通過下式計(jì)算纖維素降解率。

2)結(jié)構(gòu)表征。乳白耙菌能夠選擇性降解煙稈木質(zhì)素,較多地保留纖維素和半纖維素作為可發(fā)酵底物的來源,但由于煙稈是異質(zhì)性大分子結(jié)構(gòu),各組分被生物降解的同時(shí),其內(nèi)部化學(xué)結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生變化,這對(duì)后期酶解糖化及乳酸發(fā)酵的影響也至關(guān)重要。將煙稈樣品與純KBr研磨均勻,制成薄而透明的圓形薄片置于傅里葉紅外光譜儀中進(jìn)行紅外光譜分析[22],掃描波數(shù)范圍為4000～400 cm-1。

1.3.4 煙稈的酶解糖化以煙稈為基質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)乳酸的過程中,糖含量的高低直接影響乳酸轉(zhuǎn)化率,因此,對(duì)乳白耙菌預(yù)處理后的煙稈進(jìn)行酶解糖化,探究乳白耙菌轉(zhuǎn)化煙稈的產(chǎn)糖能力,有助于進(jìn)一步研究乳酸轉(zhuǎn)化率。

以1∶20的固液比(0.45 g煙稈∶9 mL 復(fù)合酶液)將煙稈樣品置于復(fù)合酶液中,其中纖維素酶和木聚糖酶的酶活均為30 U/(g基質(zhì)),45 ℃靜置酶解72 h ,離心,取上清,使用HPLC法測(cè)定酶解液中葡萄糖和木糖的質(zhì)量。

HPLC檢測(cè)條件:HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm,Bio-Rad),柱溫為80 ℃;采用示差折光檢測(cè)器(RID),溫度為35 ℃;流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4,流速為0.65 mL/min。

煙稈酶解后葡萄糖、木糖產(chǎn)量及葡萄糖轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式為:

1.3.5 煙稈發(fā)酵產(chǎn)乳酸與其他產(chǎn)乳酸工業(yè)菌種(Lactobacillusrhamnosus、Lactococcuslactis)相比,凝結(jié)芽孢桿菌可同時(shí)代謝己糖和戊糖產(chǎn)乳酸,一方面提高了酶解效率,另一方面也避免了發(fā)酵過程中高濃度戊糖的反饋抑制作用[23],實(shí)現(xiàn)煙稈的高效轉(zhuǎn)化。發(fā)酵過程如下:

1)凝結(jié)芽孢桿菌活化與培養(yǎng)。吸取250 μL的B.coagulans甘油管菌液于MRS培養(yǎng)基中,30 ℃靜置培養(yǎng)16 h,獲得凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵種子液。

2)煙稈同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乳酸。以1∶20的固液比將0.45 g煙稈樣品置于9 mL復(fù)合酶液中,其中纖維素酶和半纖維素酶的負(fù)荷均為30 U/(g基質(zhì)),CaCO3添加量為40 g/L,按10%的接種比例接入凝結(jié)芽孢桿菌種子液,45 ℃厭氧發(fā)酵48 h,離心,取上清,使用HPLC法測(cè)定發(fā)酵液中的乳酸質(zhì)量,測(cè)試條件同1.3.4。

3)煙稈分批發(fā)酵產(chǎn)乳酸。將1.3.4的酶解液離心后取上清液,加入40 g/L CaCO3,按10%的接種比例接入凝結(jié)芽孢桿菌種子液,45 ℃厭氧發(fā)酵48 h,離心,取上清,測(cè)定發(fā)酵液中的乳酸質(zhì)量。

4)乳酸產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式為:

2 結(jié)果與分析

2.1 乳白耙菌預(yù)處理對(duì)煙稈組分的影響

經(jīng)乳白耙菌預(yù)處理前后煙稈中各組分測(cè)定結(jié)果見表1。由表1可知,原料煙稈中纖維素和半纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為37.24%和19.24%,表明煙稈中含有豐富的可發(fā)酵底物。乳白耙菌預(yù)處理初期(5 d),木質(zhì)素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著性變化(P>0.05),而半纖維素作為主要消耗底物,其降解率為7.74%,表明該階段乳白耙菌利用半纖維素作為碳源與能源進(jìn)行菌體生長(zhǎng)。當(dāng)預(yù)處理10 d后,木質(zhì)素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降,其降解率為27.99%,表明乳白耙菌發(fā)生了與木質(zhì)素降解相關(guān)的次級(jí)代謝反應(yīng)[24]。預(yù)處理20 d后,乳白耙菌對(duì)3種組分均有不同程度的降解,纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解率分別為16.91%、27.81%和44.90%。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),木質(zhì)素與多糖的比值逐漸降低,說明乳白耙菌在以煙稈為底物的生長(zhǎng)過程中,能夠選擇性地降解木質(zhì)素,較大程度保留糖類物質(zhì)作為可發(fā)酵底物的來源。而木質(zhì)素作為影響生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵制約因素,其降解率的提升對(duì)后期煙稈酶解糖化及發(fā)酵產(chǎn)乳酸具有較好的促進(jìn)作用[25]。

表1 乳白耙菌預(yù)處理前后煙稈中各組分測(cè)定結(jié)果Table 1 The determination results of various components in tobacco stalks before and after pretreatment with I.lacteus

2.2 乳白耙菌預(yù)處理對(duì)煙稈結(jié)構(gòu)的影響

圖1 乳白耙菌處理后煙稈的紅外光譜Fig.1 Infrared spectrum of tobacco stalks pretreated with I.lacteus

2.3 乳白耙菌預(yù)處理煙稈酶解糖化效果

2.3.1 乳白耙菌預(yù)處理對(duì)煙稈酶解產(chǎn)糖的影響乳白耙菌預(yù)處理對(duì)煙稈酶解產(chǎn)糖的影響如圖2所示。由圖2可知,未經(jīng)處理的煙稈,由于其結(jié)構(gòu)致密,酶解抗性作用顯著,葡萄糖和木糖產(chǎn)量分別為80 mg/g和32 mg/g,表明原料煙稈酶解效率較低。隨著乳白耙菌預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng),葡萄糖和木糖產(chǎn)量逐步提升,當(dāng)處理20 d后,葡萄糖和木糖產(chǎn)量分別達(dá)到260 mg/g和112 mg/g,較原料煙稈分別提高了2.25倍和2.50倍。其原因可能是乳白耙菌預(yù)處理過程能夠選擇性降解木質(zhì)素,使秸稈多孔性增加,提升纖維素酶和半纖維素酶的有效吸附效率[30],進(jìn)而提高葡萄糖和木糖的產(chǎn)量。

圖2 乳白耙菌預(yù)處理對(duì)煙稈酶解產(chǎn)糖的影響Fig.2 Effect of pretreatment with I.lacteus on enzymatic hydrolysis of tobacco stalks

2.3.2 煙稈酶解糖化動(dòng)力學(xué)研究酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究最早使用的是經(jīng)典Henri-Michaelis-Menten模型,但研究表明,在復(fù)雜非均相條件下發(fā)生酶催化反應(yīng)時(shí),Henri-Michaelis-Menten模型對(duì)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的表征會(huì)出現(xiàn)偏差,不適合復(fù)雜木質(zhì)纖維素反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)研究[31]。B.Nidetzky 等[32]通過對(duì)小麥秸稈的酶解研究,將木質(zhì)纖維素與纖維素酶的反應(yīng)描述為二級(jí)反應(yīng),通過該模型揭示了經(jīng)白腐菌處理后,不同木質(zhì)纖維素基質(zhì)可反應(yīng)纖維素占總纖維素比率的變化。本研究基于文獻(xiàn)[32]所提出的酶解二級(jí)反應(yīng)理論,利用二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型對(duì)煙稈酶解過程進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合,酶解動(dòng)力學(xué)曲線和參數(shù)如圖3和表3所示。由表3可知,相關(guān)系數(shù)R2均在0.98以上,說明數(shù)據(jù)擬合度較高。由此可以確定煙稈和纖維素酶的反應(yīng)特征參數(shù)P和K。

圖3 煙稈酶解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3 Kinetic curve of enzymatic hydrolysis reaction of tobacco stalks

表3 煙稈和纖維素酶反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 Kinetics parameters of cellulase conversion of tobacco stalks

P為煙稈中可反應(yīng)纖維素占總纖維素的比例(%),反映煙稈對(duì)纖維素酶的可接觸性。木質(zhì)纖維素的天然結(jié)構(gòu)致密復(fù)雜、秸稈表層蠟質(zhì)的保護(hù)作用及木質(zhì)素空間位阻障礙等對(duì)纖維素酶解糖化產(chǎn)生極大的抗性,阻止纖維素酶與纖維素相互作用,僅有部分纖維素大分子可與纖維素酶直接接觸發(fā)生水解作用[33]。隨著乳白耙菌預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng),P有不同程度的增加,當(dāng)乳白耙菌預(yù)處理20 d后,P達(dá)到72.42%,比原料煙稈提高了2.47倍,說明經(jīng)乳白耙菌預(yù)處理能夠增加煙稈中纖維素的暴露性,提升可反應(yīng)纖維素的比例,有效提高纖維素的水解效率。

K為達(dá)到最大纖維素水解率一半時(shí)的水解時(shí)間(h),隨著預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng),K值也隨之增大。A.Romaní等[34]用堿和水熱處理燕麥秸稈,其酶解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)K較對(duì)照均有所提升;余洪波[35]研究了白腐菌改性木質(zhì)纖維素對(duì)纖維素酶反應(yīng)性變化的影響,結(jié)果表明,基于二級(jí)反應(yīng)模型得出的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)K隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,這與本文的研究結(jié)果基本一致。

2.4 乳白耙菌預(yù)處理對(duì)煙稈發(fā)酵產(chǎn)乳酸的影響

不同發(fā)酵方式對(duì)煙稈乳酸產(chǎn)量的影響結(jié)果如表4所示。由表4可知,原料煙稈經(jīng)發(fā)酵后乳酸產(chǎn)量較低;經(jīng)乳白耙菌預(yù)處理20 d后,煙稈的結(jié)構(gòu)抗性屏障被破壞,纖維素酶能充分與底物接觸,酶解糖化效率提升,乳酸產(chǎn)量也有較大幅度的升高,較原料煙稈提升了2.79～3.59倍。其中,同步糖化發(fā)酵的乳酸產(chǎn)量達(dá)到376.17 mg/g,較分批發(fā)酵提高了38.75%,說明發(fā)酵前期,葡萄糖和木糖的積累對(duì)煙稈發(fā)酵產(chǎn)乳酸產(chǎn)生了抑制作用。與其他乳酸菌相比,本研究使用的凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵溫度為45 ℃,其耐高溫的特性避免了由于酶解和發(fā)酵溫度不一致而導(dǎo)致的酶解效率低下的問題[23],提高了纖維素酶和半纖維素酶的利用效率,提升了乳酸轉(zhuǎn)化率。相較于分批發(fā)酵,同步糖化發(fā)酵操作過程簡(jiǎn)單,乳酸產(chǎn)量高,更適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

表4 不同發(fā)酵方式對(duì)煙稈乳酸產(chǎn)量的影響Table 4 Effects of different fermentation methods on lactic acid production of tobacco stem

以乳白耙菌預(yù)處理20 d的煙稈為樣品,進(jìn)一步采用同步糖化發(fā)酵法測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵液中乳酸與殘?zhí)呛?結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,發(fā)酵前12 h,乳酸含量較低,說明菌體前期處于適應(yīng)期。發(fā)酵12～24 h,乳酸含量快速提高,葡萄糖的積累趨于0 mg/g,而木糖持續(xù)累計(jì)到18 h,說明凝結(jié)芽孢桿菌優(yōu)先利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)乳酸,葡萄糖的存在抑制了木糖的利用率。發(fā)酵60 h后,乳酸產(chǎn)量為392.16 mg/g,乳酸轉(zhuǎn)化率為86.95%,較原料煙稈提高了3.78倍。同理化預(yù)處理[36]相比,乳白耙菌預(yù)處理免去了水洗脫毒步驟,發(fā)酵后期乳酸得率高,具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)化,綠色無污染的優(yōu)勢(shì)。

圖4 乳白耙菌預(yù)處理煙稈發(fā)酵液中乳酸與殘?zhí)呛縁ig.4 The content of lactic acid and residual sugar in fermentation broth of tobacco stalks pretreated with I.lacteus

3 結(jié)論

本文研究了乳白耙菌預(yù)處理對(duì)煙稈結(jié)構(gòu)特征和酶解產(chǎn)糖效率的影響,并比較了不同發(fā)酵方式下煙稈發(fā)酵產(chǎn)乳酸的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果表明,經(jīng)乳白耙菌預(yù)處理20 d的煙稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解率分別為16.19%、27.81%和44.90%,乳白耙菌能夠選擇性地降解木質(zhì)素,破除木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)屏障;乳白耙菌能夠有效破壞木質(zhì)素的苯環(huán)骨架結(jié)構(gòu),并對(duì)木質(zhì)素側(cè)鏈基團(tuán)等有一定程度的降解,同時(shí)對(duì)半纖維素的結(jié)構(gòu)也有一定程度的破壞;經(jīng)預(yù)處理后的煙稈結(jié)構(gòu)抗性屏障作用解除,酶解糖化效果較原料煙稈顯著提升,葡萄糖產(chǎn)量達(dá)到260 mg/g,木糖產(chǎn)量為112 mg/g,較原料煙稈分別提高了2.25倍和2.50倍。進(jìn)一步研究酶解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征,乳白耙菌預(yù)處理能夠增加纖維素的暴露性,增加可反應(yīng)纖維素比例,進(jìn)而提升煙稈酶解糖化效果。以凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵煙稈產(chǎn)乳酸,預(yù)處理后煙稈乳酸產(chǎn)量較未處理提高了2.79～3.59倍,相較于分批發(fā)酵,同步糖化發(fā)酵的乳酸產(chǎn)量提升效果更明顯,發(fā)酵60 h后乳酸產(chǎn)量為392.16 mg/g,乳酸轉(zhuǎn)化率為86.95%。后續(xù)可對(duì)乳酸發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,為煙稈資源化利用提供參考和依據(jù)。