李 為 吳 濤 周 燦 申 楠吳健鈕張?zhí)鞊?楊強(qiáng)健 陳佳佳 陸小龍 湯 智△

（1.湖南省湘潭市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 湘潭 411199；2.湖南省湘潭市第一人民醫(yī)院，湖南 湘潭 411104；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410007；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410021）

骨折是由于遭受外力導(dǎo)致骨的完整性和連續(xù)性中斷的現(xiàn)象，特征主要有患處畸形、運(yùn)動(dòng)異常、骨擦感。隨著經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，各類(lèi)突發(fā)狀況的加多，各種意外情況所導(dǎo)致的骨折日益增多［1］。臨床流行病學(xué)研究表明，5%～10%的骨折患者存在骨折愈合失敗的風(fēng)險(xiǎn)，其中股骨最高達(dá)到13.9%的骨折愈合失敗風(fēng)險(xiǎn)［2］。本課題組在長(zhǎng)期臨床工作和實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)活血化瘀的代表性方劑桃紅四物湯，能夠加快脛腓骨骨折愈合，使骨折愈合的效率顯著升高［3］。研究表明，TLR2 信號(hào)通路的激活可促進(jìn)多種疾病的血管生成［4］，并且參與了調(diào)控破骨細(xì)胞分化的過(guò)程［5］。據(jù)此，本研究旨在探討桃紅四物湯介導(dǎo)TLR2 抑制破骨細(xì)胞分化促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

RAW264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞），貨號(hào)：CL-0190，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

桃紅四物湯，組方：桃仁20 g，紅花10 g，當(dāng)歸20 g，生地黃20 g，赤芍20 g，川芎10 g［6］。飲片由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科中藥房提供。研磨藥材并加水浸泡30 min，然后通過(guò)用沸水沖洗2 h 提取，在65 ℃下液泡成顆粒。3.78 g 桃紅四物湯藥材可以制成1 g顆粒。將桃紅四物湯顆粒密封，室溫?zé)o光條件下保存。用時(shí)將顆粒溶于完全培養(yǎng)基中，制成600 μg/mL的桃紅四物湯水提液。

1.3 試劑與儀器

DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Giboco 公司，RANKL、TLR2 激動(dòng)劑均購(gòu)自Sigma 公司，TLR2 抗體購(gòu)自Abcam 公司，30%甲叉雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、甘氨酸、Tris、Real Band 蛋白預(yù)染Marker、20×TBS 緩沖液、脫脂奶粉均購(gòu)自上海生工公司，SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（1×）、TEMED、SDS、BeyoCoLorTM彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、RIPA 裂解液（強(qiáng)）、TEMED、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）均購(gòu)自上海碧云天公司，PVDF 膜購(gòu)自上海默克化工技術(shù)有限公司，NaCl 購(gòu)自美國(guó)科賽特科技有限公司，超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（250 mL）購(gòu)自蘇州新賽美生物科技有限公司，甲醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，TRIzol 購(gòu)自Thermo Fisher Scientific，RNase-free Water 購(gòu)自索萊寶，異丙醇、無(wú)水乙醇均購(gòu)自天津恒興，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自genecopoeia，Beyo-FastTMSYBR Green qPCR Mix 購(gòu)自Bio-Rad，200 μL PCR 管（無(wú)酶）、10 μL 槍頭（無(wú)酶）均購(gòu)自NEST，α-MEM 培養(yǎng)基購(gòu)自深圳華晨陽(yáng)科技有限公司，穩(wěn)壓電源（電泳用）、SDS-PAGE 蛋白電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)印電泳槽、電泳儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)均購(gòu)自上海天能，脫色搖床購(gòu)自其林貝爾，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)均購(gòu)自HeaLForce，雪花制冰機(jī)購(gòu)自雪科，超純水儀購(gòu)自ELGA，熒光定量PCR 儀購(gòu)自德國(guó)耶拿，多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自PerkinELmer。

1.4 細(xì)胞模型與分組

將RAW 264.7 細(xì)胞在含有10%胎牛血清、4 mmoL谷氨酰胺和1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在5%CO2、37 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)1～2 d，使細(xì)胞傳代，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)。再將細(xì)胞分為對(duì)照組、桃紅四物湯組、TLR2組、桃紅四物湯+TLR2 組。對(duì)照組：RAW 264.7 細(xì)胞需要在含100 μg/L RANKL 的α-MEM 培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)基中的液體需要隔天換1 次，通過(guò)4～5 d 的誘導(dǎo)培養(yǎng)后能產(chǎn)生足量的多核細(xì)胞。桃紅四物湯組：RAW 264.7 細(xì)胞在上述相同培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)的第3天加入600 μg/mL的桃紅四物湯水提物，再孵育48 h。TLR2組：RAW 264.7細(xì)胞先在TLR2激動(dòng)劑中預(yù)處理1 h，再使用上述相同培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)。桃紅四物湯+TLR2 組：RAW 264.7 細(xì)胞先在TLR2 激動(dòng)劑中預(yù)處理1 h，然后在上述相同培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)的第3天加入600 μg/mL的桃紅四物湯水提物，再孵育48 h。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.5.1 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色 選用2.5%戊二醛固定細(xì)胞，用二甲基甲醛將底物進(jìn)行充分溶解，再將緩沖液倒入其中；將亞硝酸鈉和副品紅按照1∶1的比例進(jìn)行混合，放置于安靜狀態(tài)下1 min，再將緩沖液加入；最后將酒石酸加到緩沖液中，TRAP 染液完成配置。在37 ℃的培養(yǎng)皿中加入TRAP染液，進(jìn)行1 h染色；用蒸餾水將細(xì)胞清洗干凈，再用1%甲基綠對(duì)其細(xì)胞核進(jìn)行再次染色；破骨細(xì)胞染色后，呈現(xiàn)出寶石紅色，且核紅染的細(xì)胞不少于3 個(gè)，即為T(mén)RAP+破骨細(xì)胞；最后進(jìn)行拍照，觀察每張玻片的TRAP 染色為陽(yáng)性的破骨細(xì)胞，并將數(shù)量進(jìn)行記錄。

1.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR） 通過(guò)Total RNA 提取，反轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)熒光定量PCR，PCR 結(jié)束后用2-ΔΔCt分析方法對(duì)所記錄的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.5.3 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)（WB） 通過(guò)總蛋白抽提與定量，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后將在4 ℃下一抗孵育；然后洗膜，室溫下孵育PVDF膜2 h，進(jìn)行二抗孵育，TBST洗膜3次，每次10 min；將膜放在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中，涂布均勻；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光30/60 s，觀察結(jié)果并保存圖片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組破骨細(xì)胞的形態(tài)觀察

結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，桃紅四物湯組活躍的破骨細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞核數(shù)量減少，TLR2組破骨細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可以看到大量細(xì)胞核存在，而且體積顯著增大，桃紅四物湯+TLR2組與TLR2組對(duì)比，桃紅四物湯+TLR2組破骨細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞核數(shù)量減少，體積也明顯減小。見(jiàn)圖1。

圖1 各組破骨細(xì)胞的形態(tài)（TRAP染色）

2.2 各組TLR2 mRNA的表達(dá)比較

見(jiàn)表1、圖2。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，桃紅四物湯組TLR2 mRNA 的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，TLR2 組的TLR2 mRNA 的表達(dá)顯著上升（P＜0.01）；與桃紅四物湯組比，TLR2 組、桃紅四物湯+TLR2 組的TLR2 mRNA 的表達(dá)顯著上升（P＜0.01）；與TLR2 組比，桃紅四物湯+TLR2 組TLR2 mRNA 的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）。

表1 各組TLR2 mRNA及TLR2蛋白表達(dá)比較（±s）

表1 各組TLR2 mRNA及TLR2蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與桃紅四物湯組比較，##P ＜0.01；與TLR2組比較，△△P ＜0.01。

TLR2蛋白0.996±0.045 0.480±0.045*2.583±0.057**1.523±0.135##△△組 別對(duì)照組桃紅四物湯組TLR2組桃紅四物湯+TLR2組n3333 TLR2 mRNA 1.002±0.069 0.584±0.053*3.405±0.119**1.701±0.162##△△

圖2 各組TLR2蛋白條帶

2.3 各組TLR2蛋白表達(dá)比較

見(jiàn)表1、圖2。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，桃紅四物湯組TLR2 蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，TLR2組的TLR2蛋白的表達(dá)顯著上升（P＜0.01）；與桃紅四物湯組比，TLR2 組、桃紅四物湯+TLR2 組的TLR2 蛋白的表達(dá)顯著上升（P＜0.01）；與TLR2 組比，桃紅四物湯+TLR2 組TLR2 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）。

3 討 論

骨或骨小梁的完整性或連續(xù)性遭到斷裂稱(chēng)為骨折。骨折這一病名最早見(jiàn)于唐·王燾的《外臺(tái)秘要》。骨折的原因主要分為內(nèi)外兩因，大多數(shù)骨折由外因?qū)е?。外因主要包括?chē)禍、撞擊等引起的直接暴力，也可由間接暴力、肌肉韌帶忽然的劇烈牽引力、長(zhǎng)期同一姿勢(shì)等引起的勞損等引起。內(nèi)因主要包括患者的年齡、骨質(zhì)的結(jié)構(gòu)等變化。如老年人因?yàn)槟挲g大，常易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，可能打噴嚏就能發(fā)生脆性骨折。骨的正常生長(zhǎng)和愈合主要是因?yàn)楣谴x的正常進(jìn)行，骨化需要同時(shí)滿(mǎn)足兩個(gè)條件：一是需要正常的骨組織，這是骨化的必要條件；二是需要在軟骨細(xì)胞的作用下才能進(jìn)行，兩者缺一不可。只有通過(guò)機(jī)體中的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的相互影響相互約束，才能維持骨代謝的正常進(jìn)行［7］。隨著中醫(yī)藥事業(yè)的不斷進(jìn)步，在骨折愈合方面中醫(yī)藥的治療發(fā)揮著越來(lái)越大的作用，在骨損傷愈合的治療上療效突出，從古至今都是骨科方面的研究重點(diǎn)［8］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨折愈合主要包括第一階段的瘀血消除，第二階段新血的生成，最后階段骨折的愈合。古代有許多醫(yī)案、書(shū)籍記載了在骨傷科的治療方面“活血化瘀”最為重要［9］。骨骼的生長(zhǎng)和重建主要通過(guò)骨骼的血液供應(yīng)。骨折后血液供應(yīng)的質(zhì)量直接影響骨骼愈合過(guò)程的快慢，并與其愈合有關(guān)。骨形成和骨重建與血管的生成息息相關(guān)［10］。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為一旦有骨折宜先運(yùn)用活血化瘀的中藥，血不活，則骨不能接［11］。

桃紅四物湯主要功效是補(bǔ)血的同時(shí)能活血，兼有消腫止痛、去瘀生新的作用［12］。方中君藥為桃仁、紅花。桃仁有效成分為苦杏仁苷，而羥基紅花黃色素A是紅花中的主要成分，兩者的主要作用是促進(jìn)微循環(huán)，抑制血小板聚集，在活血化瘀中起關(guān)鍵作用，主要用于治療骨折、痛經(jīng)、骨質(zhì)疏松、冠心病等疾病［13］。川芎中含有阿魏酸，具有抗炎、消腫等作用［14］。當(dāng)歸中含有藁本內(nèi)酯，能夠舒張血管，同樣具有很好的活血化瘀作用［15］。研究發(fā)現(xiàn)，赤芍能夠?qū)ρ艿膹椥赃M(jìn)行改善，芍藥苷是它的主要成分［16］。毛蕊花糖苷是生地黃的主要成分，它主要的作用是提高人體免疫、延緩衰老等［17］。整方合用，能夠加快骨折愈合的速度。桃紅四物湯主要通過(guò)改善血流變特性、促進(jìn)HIF-1的分泌、加快骨折區(qū)域的血管新生、增加eNOS 和NO 及VEGF 的水平等［18］，為桃紅四物湯對(duì)骨折的治療提供了更加充分的理論支持。

骨折的愈合是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，其本質(zhì)是骨折端發(fā)生的骨重建和成形過(guò)程。通過(guò)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)骨重建。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的共同參與完成骨組織代謝，為達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，機(jī)體需通過(guò)骨形成和骨吸收之間的不斷轉(zhuǎn)化。電鏡下可以看到，破骨細(xì)胞的褶皺膜上有許多結(jié)構(gòu)完全不同的亞結(jié)構(gòu)，這是破骨細(xì)胞行使骨吸收功能的保證，褶皺膜由于其不規(guī)則的表面而大大增加了各個(gè)亞結(jié)構(gòu)之間的接觸面積，這反過(guò)來(lái)又大大增加了破骨細(xì)胞骨吸收的面積，因此破骨細(xì)胞在骨折愈合的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。

清·陳士鐸《辨證錄·接骨門(mén)》認(rèn)為，摔傷后有大量瘀血存在體內(nèi)，不能消散，血液不流通則瘀血不易散去，瘀血不去則骨折就難以愈合［19］。故治療上應(yīng)當(dāng)運(yùn)用攻利之法。人到老年，肝腎不足，筋骨衰弱，骨質(zhì)疏松，瘀血證雖屬實(shí)證，但多數(shù)虛中夾實(shí)，治療上更應(yīng)注意活血和養(yǎng)血相配合。桃紅四物湯可使?fàn)I血調(diào)和，補(bǔ)血不停滯，活血而不離經(jīng)，在骨代謝中具有與成骨-破骨細(xì)胞耦合的動(dòng)態(tài)平衡相同的作用，有利于動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)OPG-RANKL-RANK 傳導(dǎo)通路，有利于骨組織重建和恢復(fù)。TLRs 受體中包括TLR2，可通過(guò)在外周血白細(xì)胞的表面進(jìn)行表達(dá)，也能激活NF-κB 和AP1 等轉(zhuǎn)錄因子，主要是因?yàn)樗芘c細(xì)菌和內(nèi)源性配基發(fā)生相互作用，在4 號(hào)染色體4q32 區(qū)可以找到它的編碼基因［20］。前期驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)中，用桃紅四物湯處理實(shí)驗(yàn)小鼠，發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯在骨折愈合過(guò)程中的不同階段可以抑制骨髓單核細(xì)胞中TLR2的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)將RAW264.7 細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、桃紅四物湯組、TLR2 組及桃紅四物湯+TLR2 組，檢測(cè)各組的TRAP 染色、qPCR 及WB，發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯通過(guò)抑制TLR2 的表達(dá)，使破骨細(xì)胞的分化受到抑制，進(jìn)而使骨吸收的速度得到延緩，最終加快骨折愈合的進(jìn)程。本研究發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯促進(jìn)骨折愈合的分子機(jī)制，為我們開(kāi)發(fā)新的骨折愈合治療藥物和干預(yù)方案提供一個(gè)潛在的切入點(diǎn)，也將中醫(yī)的“活血化瘀”與“破骨細(xì)胞分化”理論結(jié)合起來(lái)，豐富了“活血化瘀”的現(xiàn)代內(nèi)涵。