袁松,李婕,張娜,張龍浩,劉陽,張慶生

(中國食品藥品檢定研究院,國家藥品監(jiān)督管理局化學(xué)藥品質(zhì)量研究與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102629)

N-亞硝胺類化合物(N-nitrosamines,NAs)是一類結(jié)構(gòu)通式為R1(R2)N-N=O的化合物,其中R1和R2為烷基或芳烴,國際癌癥研究機(jī)構(gòu)于1987年將NAs列入致癌物清單。2017年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的致癌清單中,有近16個(gè)短脂肪鏈的N-亞硝胺類化合物被列為2類致癌物質(zhì)[1]。NAs常常存在于食品、飲用水、煙草、化妝品等物質(zhì)中[2-5],人們長期接觸含NAs的這些物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生潛在危害。自2018年歐洲藥品管理局(European Medicines Agency,EMA)宣布在纈沙坦原料和制劑中檢測出N-亞硝基二甲胺(NDMA)后,各國藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)紛紛加強(qiáng)對藥品中NAs的監(jiān)測,并對多批含有NDMA或其他亞硝胺類雜質(zhì)的沙坦類藥物進(jìn)行召回,并要求對產(chǎn)品中NAs存在進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估及建立合適的控制策略[6-9]。

西格列汀(結(jié)構(gòu)式見圖1)是一種二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制劑,可以刺激胰高血糖素的釋放并減少胰島素的分泌,從而發(fā)揮降糖作用,是一種常見的降糖藥,可與其他藥聯(lián)合用藥來治療包括超重肥胖、胰島素治療不佳、肥胖型 2 型糖尿病等疾病,治療效果良好[10-12]。2022年報(bào)道表明西格列汀合成中間體三氟甲基-5,6,7,8-四氫-1,2,4-三唑并-[4,3-α]-吡嗪鹽酸鹽(TTP)[13]可能與亞硝酸鹽反應(yīng)生成Nitroso-STG-19(NTTP,見圖1)。NTTP是新發(fā)現(xiàn)的一種存在于西格列汀中的基因毒性雜質(zhì),可能是以TTP為原料合成西格列汀時(shí)產(chǎn)生或是最終產(chǎn)品中殘留的TTP與輔料中微量的亞硝酸鹽反應(yīng)生成NTTP。EMA和美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)最初都將其最大攝入量設(shè)定為37 ng·d-1,但FDA為了避免西格列汀產(chǎn)品的短缺,將最大攝入量調(diào)整為246.7 ng·d-1,暫未召回該產(chǎn)品[14-15]。目前國內(nèi)外尚無對西格列汀中的NTTP檢測方法的報(bào)道,本文建立了一個(gè)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測西格列汀中NTTP的方法,為西格列汀相關(guān)原料藥與制劑的藥品質(zhì)量控制和監(jiān)管提供參考。

圖1 西格列汀、TTP和NTTP的結(jié)構(gòu)式

1 材料

1.1 儀器高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Waters公司),配備電噴霧離子源(ESI)和MassLynx V4.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);XP205DR型電子分析天平(瑞士Mettler公司);Milli-Q超純水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.2 藥物與試劑乙腈、甲酸、甲酸銨(質(zhì)譜級(jí),美國Fisher Scientific),水為超純水,對照品NTTP來自本實(shí)驗(yàn)室合成,采用高分辨質(zhì)譜(見圖2A)和核磁(見圖2B、C)對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證。

圖2 結(jié)構(gòu)確證-高分辨質(zhì)譜圖(A,H-ESI+)、核磁共振氫譜圖(B)和碳譜圖(C)

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的制備取NTTP對照品約10 mg,精密稱定,置100 mL量瓶中,加水使溶解并稀釋至刻度,作為對照品儲(chǔ)備液;精密量取對照品儲(chǔ)備液適量,以水為稀釋劑逐級(jí)定量稀釋制成每1 mL中含NTTP 0.54、1.08、4.31、10.79、26.97、53.93 ng的溶液,作為系列線性溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備取磷酸西格列汀原料藥約100 mg,精密稱定,置10 mL量瓶中,加水適量,超聲使溶解,用水稀釋至刻度,搖勻,作為原料藥的供試品溶液。取磷酸西格列汀片10片,精密稱定,研細(xì),混勻,精密稱取約相當(dāng)于磷酸西格列汀100 mg的細(xì)粉,置15 mL離心管中,精密加入水10 mL,超聲并振搖10 min,濾過,取續(xù)濾液作為片劑的供試品溶液。

2.2 色譜及質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件采用Agilent Eclipse Plus C18RRHD(3.0 mm×150 mm,1.8 μm)色譜柱,以含0.1%甲酸的水溶液為流動(dòng)相A,0.1%甲酸的乙腈溶液為流動(dòng)相B,梯度洗脫：0～8.0 min, 40%B→100%B;8.0～8.1 min,100%B→40%B;8.1～12.0 min,40%B;流速為0.35 mL·min-1,柱溫為30 ℃,進(jìn)樣器溫度為10 ℃,進(jìn)樣體積為5 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源(Electrospray Ionization Source,ESI),正離子檢測模式,毛細(xì)管電壓為4.0 kV,脫溶劑氣溫度為500 ℃,脫溶劑氣流量為1 000 L·h-1,錐孔氣流量為150 L·h-1,離子源溫度為150 ℃。監(jiān)測模式為多反應(yīng)監(jiān)測(Multiple reaction monitor,MRM),以m/z 221.83→191.95作為定量離子對,錐孔電壓為10 V,碰撞能量為10 V,以離子對m/z 221.83→164.71作為定性離子對,錐孔電壓為10 V,碰撞能量為20 V。采集時(shí)間為2.3～8.0 min。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn)取水作為空白溶劑和“2.1.1”項(xiàng)下約4 ng·mL-1的對照品溶液分別進(jìn)樣,記錄色譜圖,在所建立的色譜和質(zhì)譜條件下,NTTP的保留時(shí)間為2.62 min(見圖3A),峰型良好,空白溶劑對檢測無干擾。

A.空白溶劑;B.對照品溶液;C.片劑供試品溶液圖3 空白溶劑、對照品溶液和片劑供試品溶液提取的離子流色譜圖

2.3.2 系統(tǒng)精密度取“2.1.1”項(xiàng)下約4 ng·mL-1的線性溶液連續(xù)進(jìn)樣6次,得NTTP峰面積的RSD為1.13%,結(jié)果表明系統(tǒng)精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性

2.3.3.1 原料藥重復(fù)性取磷酸西格列汀原料藥(批號(hào)：SGZ1040006),按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份原料藥供試品溶液,進(jìn)樣檢測,按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算NTTP含量,計(jì)算得6份原料藥供試品溶液中NTTP含量的RSD為7.2%。結(jié)果表明方法對原料藥測定具有良好的重復(fù)性。

云浮族的書籍一般用莎草紙撰寫，只有最重要的典籍，為了長久地流傳后世，才會(huì)用到羊皮紙。羊皮紙昂貴且做工復(fù)雜，將新鮮剝下的適齡羊皮，經(jīng)石灰水浸泡數(shù)十天，溶解掉其中的膠質(zhì)等物，再刮去羊毛，以浮石軟化，并經(jīng)防腐、拉伸、晾曬等多道工藝，最終炮制而成。而眼前的羊皮卷，竟用了十余張足尺羊皮，展開后長長的一大張。它年代久遠(yuǎn)，顏色沉黃，邊緣也都起了毛邊，帶著一股霉變味。

2.3.3.2 片劑重復(fù)性取磷酸西格列汀片,按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份片劑供試品溶液,進(jìn)樣檢測,按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算NTTP含量,計(jì)算得6份片劑供試品溶液中NTTP含量的RSD為3.3%,結(jié)果表明方法對片劑測定具有良好的重復(fù)性。

2.3.4 線性分別取“2.1.1”項(xiàng)下系列線性溶液,進(jìn)樣檢測,記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) (X),NTTP峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸,在0.54～53.93 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)線性結(jié)果為Y=5 100.84X+539.79(r=1.000 0)。結(jié)果顯示NTTP在其線性范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣濃度之間呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 回收率試驗(yàn)

2.3.5.1 原料藥回收率試驗(yàn)取磷酸西格列汀原料藥(批號(hào)：GZ1040006)約100 mg,精密稱定,置10 mL量瓶中,分別用“2.1.1”項(xiàng)下25 ng·mL-1(高濃度)、10 ng·mL-1(中濃度)、4 ng·mL-1(低濃度)的線性溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為原料藥回收率溶液,每個(gè)濃度點(diǎn)平行制備3份,進(jìn)樣檢測,結(jié)果見表1,低、中、高濃度點(diǎn)的回收率分別為107.21% (RSD2.9%,n=3)、105.95% (RSD2.5%,n=3)、105.43% (RSD3.2%,n=3),結(jié)果表明原料藥回收率良好。

表1 原料藥加樣回收率結(jié)果

表2 片劑加樣回收率結(jié)果

2.3.5.2 片劑回收率試驗(yàn)取磷酸西格列汀片(批號(hào)：200515JA),精密稱定,研細(xì),混勻,精密稱取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于西格列汀100 mg),置10 mL量瓶中,分別用“2.1.1”項(xiàng)下25 ng·mL-1(高濃度)、10 ng·mL-1(中濃度)、4 ng·mL-1(低濃度)的線性溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液作為片劑回收率溶液,每個(gè)濃度點(diǎn)平行制備3份,進(jìn)樣檢測,結(jié)果見表3,低、中、高濃度點(diǎn)的回收率分別為115.03% (RSD2.1%,n=3)、115.95% (RSD3.6%,n=3)、120.20% (RSD1.4%,n=3),結(jié)果表明片劑回收率在可接受范圍內(nèi)。

2.3.6 檢測限與定量限取“2.1.1”項(xiàng)下約0.5 ng·mL-1的線性溶液,以水為稀釋劑逐步稀釋,分別在信噪比為3∶1和10∶1時(shí)作為檢測限和定量限,測得NTTP的檢測限和定量限分別為0.02 ng·mL-1和0.08 ng·mL-1。

2.3.7 提取效率考察取磷酸西格列汀原料藥(批號(hào)：SGZ1040006)和磷酸西格列汀片(批號(hào)：T024447),分別按“2.1.2”項(xiàng)平行制備2份溶液,分別超聲并振搖10、20 min,進(jìn)樣檢測,按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算NTTP含量,計(jì)算得原料藥2份供試品溶液中NTTP含量相對標(biāo)對偏差為3.32%,片劑2份供試品溶液中NTTP含量相對標(biāo)對偏差為2.02%,結(jié)果表明超聲并振搖10 min可提取完全。

2.4 樣品測定按“2.1”項(xiàng)下制備磷酸西格列汀供試品溶液,照“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣檢測,記錄色譜圖(典型圖譜見圖2B、C),以峰面積按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算供試品溶液中NTTP的含量。4家原料廠家的12批樣品中檢出NTTP含量為0.014～0.20 μg·g-1;有3批磷酸西格列汀片中檢測出NTTP,含量為1.26～1.41 μg·g-1。

3 討論

NTTP在水中易溶,以水為溶劑配制濃度約為1 μg·mL-1的對照品溶液,分別采用ESI離子源和APCI離子源下針泵進(jìn)樣對NTTP的響應(yīng)及定量/定性離子進(jìn)行考察,結(jié)果表明NTTP在ESI離子源正離子采集模式下響應(yīng)更好,繼續(xù)對ESI+條件進(jìn)行優(yōu)化,最終確定NTTP定量離子對為m/z 221.83→191.95,錐孔電壓為10 V,碰撞能量為10 eV,定性離子對為m/z 221.83→164.71作為,錐孔電壓為10 V,碰撞能量為20 eV。

以水為溶劑配制含磷酸西格列汀和NTTP濃度均約為100 μg·mL-1的混合溶液,采用紫外檢測器對NTTP峰與西格列汀峰之間的分離情況進(jìn)行了考察,分別試驗(yàn)了甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng),試驗(yàn)證明當(dāng)流動(dòng)相為乙腈-水時(shí)NTTP和西格列汀出峰較快,且可完全分離,水中加入甲酸銨后NTTP的質(zhì)譜響應(yīng)降低明顯且峰型變差,加入甲酸可以增強(qiáng)離子化效率提高質(zhì)譜響應(yīng)。最終以含0.1%甲酸的水溶液為流動(dòng)相A,0.1%甲酸的乙腈溶液為流動(dòng)相B,并進(jìn)行梯度洗脫。在最終確定的色譜條件下,磷酸西格列汀在2.2 min即可洗脫完全,質(zhì)譜采集時(shí)間設(shè)定為2.3～8.0 min,高濃度的磷酸西格列汀經(jīng)液相洗脫后直接從廢液排出,以避免對質(zhì)譜的污染。

磷酸西格列汀片未明確最大單日劑量,按推薦劑量100 mg·d-1計(jì);EMA和FDA最初都將NTTP最大攝入量設(shè)定為37 ng·d-1,但FDA為了避免西格列汀產(chǎn)品的短缺,將NTTP最大攝入量調(diào)整為246.7 ng·d-1[15];如按37 ng·d-1計(jì)算,則磷酸西格列汀中NTTP的殘留限度為0.37 μg·g-1,所檢原料藥中NTTP均未超過此限度,但片劑中NTTP含量已超限度值;如按246.7 ng·d-1計(jì)算,則磷酸西格列汀中NTTP的殘留限度為2.47 μg·g-1,原料藥和片劑中NTTP均未超出此限度。片劑中NTTP含量顯著高于原料藥,可能是由于終產(chǎn)品中的TTP殘留繼續(xù)與極微量的亞硝酸鹽繼續(xù)反應(yīng)生產(chǎn)NTTP,關(guān)于TTP殘留量與NTTP殘留量之間的相關(guān)性還需進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本研究建立了磷酸西格列汀原料藥及片劑中NTTP的UPLC-MS/MS檢測方法,并進(jìn)行了相關(guān)方法學(xué)驗(yàn)證,結(jié)果表明,所建立的方法具有良好的專屬性、靈敏度和準(zhǔn)確度,可準(zhǔn)確測定磷酸西格列汀原料藥及片劑中潛在的NTTP含量,有助于磷酸西格列汀的市場監(jiān)管,保障藥品質(zhì)量安全。