梁從蓮,韓文悅,王智超,劉紅燕,張永清*

(1.山東中醫(yī)藥大學藥學院,山東 濟南 250355;2.山東中醫(yī)藥大學實驗中心,山東 濟南 250355)

藥材紅花為菊科植物紅花(CarthamustinctoriusL.)的干燥管狀花,藥用歷史悠久,其性溫、味辛,歸心、肝經(jīng),具有活血通經(jīng)、散瘀止痛等功效,用于治療經(jīng)閉、痛經(jīng)、惡露不行、癥瘕痞塊、胸痹心痛、瘀滯腹痛、胸脅刺痛、跌撲損傷、瘡瘍腫痛等[1-2]。紅花也是重要的藏藥之一,藏語名“Ku-gong”,藏醫(yī)臨床多用于治療痛經(jīng)、難產、外傷、血瘀、肝炎、肝熱,被譽為“保肝圣藥”[3-4]。含有紅花的藏藥成方較多,如“十四味羚羊角丸”“石榴日輪丸”“二十五味松石丸”“七味鐵屑丸”等[5]?，F(xiàn)代研究顯示,紅花含有黃酮類、生物堿類、倍半萜類、有機酸類等成分,其中黃酮類是紅花的主要活性成分,也是活血化瘀的藥效物質[6-7]。我國紅花栽培歷史悠久,早在漢代就有關于紅花栽培和藥用的記載,目前紅花主產于新疆、四川、云南、河南等地,西藏部分地區(qū)也有栽培。有關紅花種質資源、栽培技術、化學成分、藥理活性等的研究文獻眾多,但鮮見藏產紅花質量方面的研究。本文探討了采收時間及干燥方式對藏產紅花黃酮類、酚酸類成分含量及其提取液抗氧化活性的影響,旨在為提高和穩(wěn)定藏產紅花藥材質量提供參考,助力藏藥產業(yè)發(fā)展。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料紅花樣品采自西藏自治區(qū)山南市,原植物經(jīng)山東中醫(yī)藥大學張永清教授鑒定,確認為菊科植物紅花(C.tinctoriusL.)。分別在初花期(初開放為黃色時)、中花期(漸變?yōu)辄S紅色時)、盛花期(成熟為紅色時)、敗花期(在植株上枯敗為土紅色時)采摘開放的管狀花,置于50 ℃烘箱熱風烘干;將在盛花期采摘的鮮花,分別50 ℃烘干、陰干和曬干。以上樣品充分干燥后,粉碎,過三號篩,避光密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器Agilent 1260 Infinity Ⅱ 高效液相色譜分析儀(美國安捷倫科技有限公司);GFL-230型烘箱(天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司);LG-01粉碎機(瑞安市百信制藥機械有限公司);MSA6.6S-0CE電子天平[賽多利斯(上海)貿易有限公司];PL203型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國宇儀器制造有限公司);SpectraMax M5酶標儀[美谷分子儀器(上海)有限公司]。

1.3 試劑羥基紅花黃色素A(純度≥98%,批號：606H021)、山柰酚(純度≥98%,批號：1208J022)、槲皮素(純度≥99.85%,批號：MUST-22042012)、蘆丁(純度≥98%,批號：SR8250)、原兒茶酸(純度≥98%,批號：310E023)、沒食子酸(純度≥98%,批號：1008U021)、1,1-二苯基-苦基肼(DPPH,純度≥98%,批號：914S021)、2,2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS,純度≥98%,批號：1031F022)均購自北京索萊寶科技有限公司。

流動相用甲醇、磷酸為色譜純,水為純凈水,其他試劑均為分析純。

2 試驗方法

2.1 含量測定

2.1.1 供試品溶液的制備羥基紅花黃色素A、槲皮素、蘆丁、原兒茶酸及沒食子酸的方法依照文獻[8]并稍做改進。取紅花樣品粉末約0.20 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇10 mL,稱定重量,超聲處理(功率300 W,頻率50 kHz,50 ℃)40 min,放冷,用50%甲醇補足減失的重量,2 000 r·min-1離心2 min,取上清液,用0.22 μm微孔濾膜過濾,即得供試品溶液。依照《中國藥典》2020年版(以下簡稱藥典)紅花[1]中山柰酚制備方法制備山柰酚供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備精密稱定羥基紅花黃色素A、山柰酚、槲皮素、蘆丁、原兒茶酸及沒食子酸對照品各12.065、13.121、17.976、9.023、6.911、5.424 mg,加25%甲醇10 mL,制成混合標準品儲備溶液,精密量取1 mL用25%甲醇稀釋至10 mL,混勻。

2.1.3 色譜條件色譜柱：Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相：選用0.7%的磷酸-水溶液(A)和甲醇(B)進行梯度洗脫;梯度條件：0～15 min,2% B→20% B;15～30 min,20% B→30% B;30～35 min,30% B;35～70 min,30% B→80% B;檢測波長：254 nm;流速：1.0 mL·min-1;柱溫：(30±0.8)℃;樣品室溫度10 ℃,進樣量：10 μL。色譜圖見圖1。

1.沒食子酸;2.原兒茶酸;3.羥基紅花黃色素A;4.蘆丁;5.槲皮素;6.山柰酚圖1 混合對照品(A)、供試品(B、C)在254 nm下HPLC圖

2.2 方法學考察

2.2.1 精密度試驗取“2.1.2”項下混合對照品溶液,連續(xù)進樣6次,記錄羥基紅花黃色素A、山柰酚、蘆丁、槲皮素、沒食子酸、原兒茶酸峰面積,計算各成分峰面積的RSD值,結果顯示的RSD值分別為0.9%、1.1%、1.2%、0.9%、1.3%、1.1%,證明儀器的精密度良好。

2.2.2 線性關系考察取混合標準品儲備溶液1 mL,用25%甲醇分別定容于5、25、50、100、200 mL容量瓶中,配置成一系列濃度梯度的混合對照品線性溶液,按“2.1.3”項下色譜條件進行梯度洗脫,以樣品濃度(X)為橫坐標,峰面積(Y)為縱坐標,進行線性回歸分析,并計算相關系數(shù)。結果如表1所示,由表1可知,6種成分在相應濃度范圍內線性關系良好。

表1 各成分的回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍

2.2.3 重復性試驗取烘干處理的中花期紅花粉末樣品0.2 g,精密稱定,平行6組,按“2.1.1”項分別制成兩種供試品溶液,在“2.1.3”項下的色譜條件分別進樣,計算羥基紅花黃色素A、山柰酚、蘆丁、槲皮素、沒食子酸、原兒茶酸含量的RSD,結果顯示6種成分含量的RSD值分別為1.4%、1.6%、0.9%、1.3%、0.9%、1.3%,表明該方法測定6種化學成分的重復性良好。

2.2.4 加樣回收試驗取已知含量的烘干處理的中花期紅花粉末樣品0.2 g,精密稱量,按“2.1.1”項下分別制備成兩種供試品溶液,平行9組,按1.5∶1、1∶1、1∶0.5分為高、中、低各3組,分別加入相應對照品,按“2.1.3”項中的色譜條件進行檢測,計算羥基紅花黃色素A、山柰酚、蘆丁、槲皮素、沒食子酸、原兒茶酸6種成分加樣回收率,回收率范圍分別為97.5%～101.8%、97.9%～101.2%、98.3%～100.9%、98.5%～101.5%、98.1%～102.3%、98.5%～102.7%,RSD值分別為1.8%、1.5%、0.9%、1.3%、1.7%、1.3%。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗分別取“重復性”項下的兩種供試品溶液的第一份,在“2.1.3”項下的色譜條件分別在0、2、4、6、10、16、24 h連續(xù)進樣,記錄羥基紅花黃色素A、山柰酚、蘆丁、槲皮素、沒食子酸、原兒茶酸的峰面積,計算峰面積的RSD,分別為0.9%、0.7%、1.1%、0.9%、1.7%、1.9%,表明供試品溶液在10 ℃條件下,24 h內穩(wěn)定性良好。

2.3 抗氧化活性分析樣品提?。杭t花醇提取物制備參照文獻[9]并稍做改進。精密稱取紅花樣品0.2 g,加入50%甲醇25 mL,超聲處理(功率300 W,頻率50 kHz,50 ℃)30 min,2 000 r·min-1離心2 min,取上清液備用。

DPPH清除能力測定：參照文獻[10]并稍做改進。移取上述紅花樣品提取液,用50%甲醇稀釋適當倍數(shù),向100 μL樣品溶液中加入0.015 mg·mL-1DPPH溶液100 μL,混合均勻,室溫避光放置30 min。在517 nm波長下測定反應溶液的吸光度。以50%甲醇作為空白對照。重復3次。根據(jù)以下公式計算 DPPH 自由基清除率：

DPPH自由基清除率(%)=1-(Ai-Aj)/Ao×100

其中,Ai為DPPH溶液+樣品溶液的吸光度;Aj為樣品溶液+50%甲醇溶液的吸光度;Ao為DPPH溶液+50%甲醇溶液的吸光度。

ABTS清除能力的測定：參照文獻[11]并稍做改進。取7.4 mmol·L-1ABTS 儲備液和2.6 mmol·L-1過硫酸鉀溶液以1∶1(V/V)混勻,室溫避光靜置12 h后,作為ABTS工作液。移取上述紅花提取液,用50%甲醇稀釋適當倍數(shù),向100 μL樣品溶液中加入上述配制的ABTS工作液100 μL,混合均勻,室溫避光下靜置30 min,在734 nm波長下測定反應溶液的吸光度。以50%甲醇作為空白對照。重復3次。ABTS自由基清除率計算公式同DPPH。

3 結果與分析

3.1 采摘時間對藏產紅花化學成分含量及抗氧化活性的影響

3.1.1 對化學成分含量的影響經(jīng)測定,采摘時間對藏產紅花化學成分含量的影響參見圖2,藏產紅花中羥基紅花黃色素A、山柰酚含量在4個不同時期采摘均符合藥典標準。羥基紅花黃色素A、蘆丁含量顯示中花期>盛花期>初花期>敗花期,山柰酚、原兒茶酸含量顯示中花期>盛花期>敗花期>初花期,槲皮素含量顯示敗花期>盛花期>中花期>初花期,沒食子酸含量顯示中花期>初花期>盛花期>敗花期。4個花期之間的沒食子酸含量均有顯著性差異(P<0.05),中花期和盛花期的羥基紅花黃色素A、蘆丁、槲皮素和山柰酚含量無顯著性差異,盛花期和敗花期的原兒茶酸含量無顯著性差異。

圖2 采摘時間對藏產紅花6種化學成分含量的影響

3.1.2 對抗氧化活性的影響經(jīng)測定,不同花期紅花甲醇提取液對DPPH和ABTS自由基的清除能力如圖3所示,采摘時間對藏產紅花抗氧化活性的影響較大。中花期、盛花期采摘的紅花對兩種自由基的清除率均較高,說明這兩個時期的紅花抗氧化活性較強。擬合各采摘時間抗氧化活性曲線,得出紅花DPPH自由基清除率的IC50值在初花期、中花期、盛花期和敗花期分別為3.232、2.422、2.625、5.257;ABTS自由基清除率的IC50值在初花期、中花期、盛花期和敗花期分別為0.416、0.306、0.340、0.578。

圖3 采摘時間對藏產紅花DPPH(A)和ABTS(B)自由基清除率的影響

3.2 干燥方法對藏產紅花化學成分含量及抗氧化活性的影響

3.2.1 對化學成分含量的影響干燥方式對藏產紅花化學成分含量的影響如圖4所示,陰干、曬干與烘干藏產紅花的羥基紅花黃色素A和山柰酚含量均符合國家藥典標準,且羥基紅花黃色素A含量均是藥典規(guī)定標準的2倍以上。烘干紅花的羥基紅花黃色素A、蘆丁和沒食子酸3種成分含量均最高,分別是陰干和曬干的1.024、1.243,1.149、1.182,1.239、1.257倍。陰干紅花的山柰酚和槲皮素含量最高,分別是烘干和曬干的1.061、1.273倍及1.208、1.203倍。曬干紅花的原兒茶酸含量最高,分別是陰干和烘干的1.226、1.314倍。差異性分析結果顯示,陰干、曬干及烘干紅花的羥基紅花黃色素A和沒食子酸含量均有顯著性差異(P<0.05),而陰干與烘干紅花的山柰酚、原兒茶酸含量,烘干與曬干紅花的槲皮素含量,陰干和曬干紅花的蘆丁含量,均無顯著性差異。

圖4 干燥方式對藏產紅花6種化學成分含量的影響

3.2.2 對抗氧化活性的影響干燥方式對藏產紅花抗氧化活性的影響,如圖5所示。圖5結果顯示,干燥方式對藏產紅花抗氧化活性影響較大。烘干紅花對兩種自由基的清除率均高于其他2種干燥方式,其次是陰干和曬干。擬合各干燥方式抗氧化活性曲線,得出紅花DPPH自由基清除率的IC50值在烘干、陰干和曬干的處理下分別為2.670、3.185、5.656;ABTS自由基清除率的IC50值在烘干、陰干和曬干的處理下分別為0.339、0.416、0.757。

圖5 干燥方式對藏產紅花DPPH(A)和ABTS(B)自由基清除率的影響

3.3 統(tǒng)計分析

3.3.1 化學成分與抗氧化活性間的相關性分析采用Excel軟件,將不同時間采摘、不同方式干燥藏產紅花DPPH、ABTS的IC50值,分別與6種化學成分含量進行灰色關聯(lián)度分析,結果如表2所示,藏產紅花6種化學成分含量與DPPH、ABTS IC50值的關聯(lián)系數(shù)均大于0.6,表明關聯(lián)度較高。

表2 藏產紅花化學成分含量與抗氧化活性間的灰色關聯(lián)系數(shù)

采用SPSS軟件中的斯皮爾曼法進行雙變量相關性分析,結果如表3所示,藏產紅花DPPH IC50值與羥基紅花黃色素A、蘆丁含量,ABTS IC50值與羥基紅花黃色素A、蘆丁、沒食子酸含量,存在顯著負相關(P<0.05);而沒食子酸和山柰酚的含量與DPPH的IC50值中度相關,山柰酚、槲皮素和原兒茶酸的含量與ABTS的IC50值中度相關。

表3 藏產紅花6種化學成分和抗氧化活性的雙變量相關性分析

3.3.2 回歸分析采用SPSS軟件中的偏最小二乘法分別對兩種抗氧化活性的IC50值和顯著相關成分之間建立多元回歸方程,其中以IC50值為因變量,相關成分為自變量,DPPH的多元回歸方程為Y=10.240-2.374X1-11.559X2,X1為羥基紅花黃色素A,X2為蘆丁;ABTS的多元回歸方程為Y=1.420-0.320X1-0.320X2-9.366X3;X1為羥基紅花黃色素A,X2為蘆丁,X3為原兒茶酸。在DPPH的多元回歸方程中,蘆丁系數(shù)為-11.559,在回歸方程里負向貢獻最大,且在相關性分析中,蘆丁含量與抗氧化活性的相關系數(shù)為-0.893,也是具有極顯著(P<0.01)負相關的成分。在ABTS的多元回歸方程中,沒食子酸的系數(shù)為-9.366,在回歸方程里負向貢獻最大,羥基紅花黃色素A、蘆丁的系數(shù)均為-0.320,貢獻較小。綜上,在清除DPPH自由基的過程中,6種成分起主要作用的是蘆丁,而在清除ABTS自由基的過程中,沒食子酸為發(fā)揮主要作用的成分。

4 討論與結論

紅花在開花過程中會經(jīng)歷因化學成分變化導致的花色變化,因此,為了獲得花色好、有效成分含量高的紅花藥材,適宜的采摘時間非常重要。丁麗麗等[12]研究表明紅花羥基紅花黃色素A的含量變化為盛花期>始初期>花蕾期>衰落期;山柰酚的含量變化為衰落期>盛花期>始初期>花蕾期。胡喜巧等[13]對始花期、盛花期和衰落期的新鄉(xiāng)紅花進行黃酮、羥基紅花黃色素A、多糖含量的測定,結果以上成分在紅花盛開后3～4 d左右的盛花期含量最高。干燥是中藥材加工必不可少的環(huán)節(jié),干燥能降低藥材的含水量,便于貯藏運輸。中藥材的干燥方法較多,較常用的有曬干、陰干、烘干、紅外干燥等。不同干燥方法由于干燥時間、溫度控制等不同,形成的藥材在性狀、成分含量上存在差異。如張彥等[14]分別測定了陰干、曬干、45 ℃烘干和60 ℃烘干處理下新疆產紅花羥基紅花黃色素A和山柰酚的含量,結果發(fā)現(xiàn)45 ℃烘干條件下兩種成分保留的更多。許蘭杰等[15]研究發(fā)現(xiàn)紅花中的羥基紅花黃色素A隨著溫度50～100 ℃范圍內升高呈直線下降趨勢,說明采用50 ℃以下的烘干溫度能使羥基紅花黃色素A得到更多的保留。

藥典規(guī)定紅花藥材的采收加工為夏季花由黃變紅時釆摘,陰干或曬干。據(jù)實地觀察,藏產紅花花色會經(jīng)歷黃色、橙色、紅色至土紅色的變化;紅花藥材在當?shù)丶庸r,常采用曬干、陰干和低溫烘干。為此本研究收集了黃色初花、橙色中花、紅花盛花和土紅色敗花幾種花期的紅花,選擇產地常用3種干燥方式,考察其中4種黃酮類成分和2種酚酸類成分的含量及其提取液抗氧化性的影響。結果表明,中花期紅花羥基紅花黃色素A、蘆丁、山柰酚、原兒茶酸和沒食子酸的含量均是最高的,且中花期和盛花期的羥基紅花黃色素A、蘆丁、山柰酚和槲皮素含量無顯著性差異;抗氧化活性測定結果也表明,中花期和盛花期采摘的紅花對兩種自由基清除率較高;因此在藏產紅花的實際生產中,應該盡量于花冠發(fā)育至黃紅色到紅色期間進行采摘。采摘過早,不僅藥效成分含量少、抗氧化活性較弱,產量也較低;采摘過晚,紅花干枯,藥材色澤變差,藥效成分含量也較低。烘干紅花羥基紅花黃色素A、蘆丁和沒食子酸的含量最高,陰干紅花山柰酚和槲皮素的含量最高,但陰干和烘干紅花的山柰酚含量無顯著性差異;且烘干紅花兩種自由基清除率均是最高的,其次為陰干和曬干;因此在藏產紅花的產地加工過程中,應該盡量選擇低溫烘干的方式,沒有烘干設備的條件下盡量選擇通風處陰干,并注意時時翻動。