鞠愛霞,周育生,單萬亭,劉莉,李秋紅

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040;3.黑龍江省藥品檢驗研究院,黑龍江 哈爾濱 150088)

高脂血癥是誘發(fā)冠心病、心肌梗死、腦卒中等心腦血管疾病的主要危險因素之一,有效防治高脂血癥是預(yù)防心腦血管疾病發(fā)生的重要途徑。澤瀉湯出自《金匱要略》,由澤瀉、白術(shù)兩味中藥配伍而成,具有降血脂、抗高血壓、抗炎等作用[1]?！督饏T要略》原文記載：“心下有支飲,其人苦冒眩,澤瀉湯主之”。該方成分復(fù)雜、作用靶點(diǎn)多,在體內(nèi)可能會影響細(xì)胞色素P450(CYP450)酶的活性或表達(dá),進(jìn)而對其他聯(lián)合應(yīng)用藥物的代謝產(chǎn)生影響[2-3]。CYP450酶是非常重要的Ⅰ相代謝酶,可影響多種藥物在體內(nèi)的代謝,具有多種亞型,易受性別、年齡、藥物、病理及生理狀態(tài)等因素影響[4]。因此,明確CYP450酶與中藥的相互作用關(guān)系對于合理配伍中藥、提高中藥療效、減少藥物的毒副作用至關(guān)重要。為探究澤瀉湯配伍規(guī)律及配伍的合理性,明確澤瀉湯及其拆方對高脂血癥模型小鼠CYP450酶亞型的影響,本研究以高脂血癥模型小鼠為基礎(chǔ),分別采用“Cocktail”探針?biāo)幬锓ê蛁PCR技術(shù),探究澤瀉湯全方及拆方對高脂血癥狀態(tài)下小鼠CYP450亞酶活性及基因表達(dá)量的影響,為澤瀉湯的合理應(yīng)用及進(jìn)一步開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 主要儀器LC-2010C型高效液相色譜儀(日本島津公司);Synergy MX型酶標(biāo)儀(美國Biotek公司);StepOnePlus型實時熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);SmartSpec Plus型核酸蛋白濃度分析儀(上海艾研生物科技有限公司);AR2140型電子分析天平;DELTA320型pH計(梅特勒-托利多儀器公司);DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);TGL16M型臺式高速冷凍離心機(jī)(長沙英泰儀器有限公司);BioSpectrum AC Chemi HR 410型UVP凝膠成像系統(tǒng)(美國);DYY-11B型三恒電泳儀(北京六一生物科技有限公司);BDF-86V50型-80 ℃冰箱(濟(jì)南卓隆生物科技有限公司)。

A.空白肝微粒體;B.空白肝微粒體+混合探針?biāo)幬?內(nèi)標(biāo);C.給藥后肝微粒體+混合探針?biāo)幬?內(nèi)標(biāo) 1.咖啡因;2.氯唑沙宗;3.甲苯磺丁脲;4.地西泮圖1 混合探針?biāo)幬锔挝⒘ｓw樣品色譜圖

1.2 主要藥品與試劑澤瀉、白術(shù)兩味中藥飲片均購自北京同仁堂哈爾濱藥店,經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王振月教授鑒定飲片符合《中國藥典》2020年版(一部)標(biāo)準(zhǔn);咖啡因?qū)φ掌?批號：1108349)、甲苯磺丁脲對照品(批號：20110601)、氯唑沙宗對照品(批號：20110701)、睪酮對照品(批號：MB1636-S)均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：BL521A)購自北京蘭杰柯科技有限公司;瓊脂糖(批號：111860)購自北京維百奧生物科技有限公司;DEPC水(批號：20171204)、SuperRed/GelRed核酸染料(批號：21078812)、RNA上樣緩沖液(批號：6909624)、DNA上樣緩沖液(批號：70090500)、D2000 DNA Ladder(批號：21053625)、Taq plus Master Mix含染料(批號：70120054)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(含DNase)(批號：21049684)均購自北京蘭杰柯科技有限公司;WCGENE mRNA qPCR定量試劑盒(批號：WC-SJH0002)購自上海沃吉基因科技有限公司。甲醇、乙腈均為色譜級。

1.3 實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境本研究所用動物為SPF級雄性KM小鼠,體質(zhì)量為18～22 g,由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2020-0001,實驗動物使用許可證號：SCXK(黑)2018-007。將小鼠飼養(yǎng)于溫度(23±2) ℃、濕度45%～65%、12 h明暗交替的動物房中,飼養(yǎng)期間小鼠正常攝食和飲水。

2 方法

2.1 藥物制備澤瀉湯凍干粉：澤瀉、白術(shù)兩味中藥以5∶2的比例,等比例擴(kuò)大,加入8倍量蒸餾水,浸泡30 min后,冷凝回流煎煮1.5 h,獲取藥液,再煎煮1 h,再次獲取藥液,過濾后,合并兩次濾液,濃縮。將濃縮后的水煎液倒入托盤,放入冷凍干燥機(jī)中,得到凍干粉,計算澤瀉湯凍干粉濃度為4.4 g·g-1。

澤瀉凍干粉：同澤瀉湯凍干操作方法,得到澤瀉凍干粉濃度為7.15 g·g-1。

白術(shù)凍干粉：同上述操作方法,得到白術(shù)凍干粉濃度為2.4 g·g-1。

2.2 分組、造模與給藥50只KM小鼠隨機(jī)分為空白組10只和高脂組40只,參考相關(guān)文獻(xiàn)[5]的方法建立高脂血癥模型,空白組飼喂基礎(chǔ)飼料,其余4組小鼠飼喂高脂飼料(配方組成：維持飼料65%、豬油10%,糖15%、奶粉5%、蛋黃粉5%),自由進(jìn)食、飲水,飼喂6周后,當(dāng)小鼠血清中TC>2.4 mmol·L-1時表示高脂血癥小鼠造模成功。造模結(jié)束后,澤瀉湯組、澤瀉組、白術(shù)組小鼠每天灌胃給藥持續(xù)28 d,小鼠給藥劑量根據(jù)澤瀉湯的成人用藥劑量采用體表面積表折算(澤瀉湯組、澤瀉組、白術(shù)組給藥劑量分別為12.0、8.6、3.4 g·kg-1),空白組、模型組均給予同體積生理鹽水。

2.3 取材末次給藥24 h后將大鼠頸椎脫臼處死,解剖取出肝臟用預(yù)冷的0.9% NaCl溶液沖洗肝臟表面血漬,稱量肝臟質(zhì)量后,部分肝臟放入4%多聚甲醛中浸泡,剩余肝臟迅速置于液氮中固定,隨后放入冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 小鼠肝臟中CYP450酶亞型酶活性檢測

2.4.1 肝微粒體混懸液的制備參考相關(guān)文獻(xiàn)[6],采用氯化鈣沉淀法在4 ℃環(huán)境中制備小鼠肝微粒體混懸液,防止肝藥酶失活變性,采用BCA法測總蛋白含量。

2.4.2 肝微粒體體系孵育及加樣流程肝微粒體體系(蛋白含量為0.4 mg·mL-1的小鼠肝微粒體,濃度為1 mmol·L-1NADPH,混合探針?biāo)幬?咖啡因15 μmol·L-1、甲苯磺丁脲20 μmol·L-1、氯唑沙宗20 μmol·L-1)/單一探針?biāo)幬?睪酮25 μmol·L-1及磷酸鹽緩沖液的總體積為500 μL的體系)孵育30 min后,加入4 ℃預(yù)冷含有8 μg·mL-1地西泮的甲醇終止液500 μL,混勻后,12 000 r·min-1離心15 min,取上清20 μL進(jìn)入HPLC分析。

2.4.3 色譜條件肝微粒體中CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9酶活性測定的色譜條件：采用Diamonsil C18(2)色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以0.05 mmol·L-1pH為3.4的甲醇：磷酸氫二銨緩沖溶液=56∶44(V/V)為流動相進(jìn)行等度洗脫;檢測波長為230 nm;柱溫為30 ℃;流速為0.8 mL·min-1。

肝微粒體中CYP3A4酶活性測定的色譜條件：采用Diamonsil C18(2)色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以乙腈∶水=50∶50(V/V)為流動相進(jìn)行等度洗脫;檢測波長為245 nm;柱溫為30 ℃;流速為1.0 mL·min-1。

建立了同時測定咖啡因、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲3種探針?biāo)幬镆约皢为?dú)測定睪酮的高效液相色譜法。

2.4.4 相對酶活性計算測定4種探針?biāo)幬锟Х纫颉⒓妆交嵌‰?、氯唑沙宗、睪酮的峰面積,將其與內(nèi)標(biāo)地西泮峰面積的比值代入各探針底物的肝微粒體標(biāo)準(zhǔn)曲線中,計算出各探針?biāo)幬镌跇悠分械臐舛?。無活性組作為總底物濃度,其余各實驗組為剩余底物濃度,根據(jù)下式計算：相對酶活性=(總底物濃度-剩余底物濃度)/總底物濃度×100%。

2.5 小鼠肝臟中CYP450酶亞型相關(guān)基因表達(dá)檢測提取大鼠肝臟總RNA(參照動物總RNA快速抽提試劑盒說明書)進(jìn)行質(zhì)量檢測,隨后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實時熒光定量PCR總反應(yīng)體系為10 μL,包含上下引物各0.2 μL、5 μL SYBR Green、0.2 μL 50×ROX Reference Dye 2、2.4 μL 超純水以及2 μL cDNA模板。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min;40次循環(huán)(95 ℃變性15 s;60 ℃退火/延伸30 s);65 ℃到95 ℃每升高0.5 ℃采集一次熒光信號。引物由上海生工生物工程有限公司提供(見表1)。

表1 引物序列

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察專屬性考察結(jié)果表明,各色譜峰峰形尖銳,且分離度良好,各肝微粒體的內(nèi)源性物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)地西泮在相應(yīng)色譜條件下不干擾咖啡因、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和睪酮的測定,該方法專屬性良好。該方法的靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性均較高,滿足生物樣品的各項方法學(xué)考察要求。探針?biāo)幬镏g以及與內(nèi)標(biāo)地西泮不產(chǎn)生相互干擾,能夠特異性檢測出各CYP450酶亞型的活性。肝微粒體樣品色譜圖見圖1～2。

3.2 澤瀉湯及其拆方對CYP450酶亞型酶活性的影響如表2所示,與空白組相比,模型組CYP2E1、CYP3A4酶活性顯著降低(P<0.01),CYP1A2、CYP2C9酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組相比,澤瀉湯組、澤瀉組、白術(shù)組均誘導(dǎo)了CYP3A4酶活性(P<0.01);澤瀉湯組、澤瀉組、白術(shù)組對CYP2E1酶活性有抑制作用(P<0.01或P<0.05);澤瀉湯組對CYP1A2酶有抑制作用(P<0.05);澤瀉湯組、澤瀉組、白術(shù)組對CYP2C9酶活性有抑制作用,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 澤瀉湯及其拆方對CYP450酶亞型酶活性的影響

3.3 澤瀉湯及其拆方對CYP450酶亞型基因表達(dá)的影響與空白組比較,模型組小鼠肝臟中CYP1A2、CYP3A4 mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05),模型組小鼠肝臟中CYP2E1、CYP2C9 mRNA表達(dá)水平無影響。與模型組相比,澤瀉湯組、澤瀉組小鼠肝臟中CYP1A2 mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.05),白術(shù)組小鼠肝臟中CYP1A2 mRNA表達(dá)水平升高,但差異無統(tǒng)計意義;澤瀉湯組小鼠肝臟中CYP2E1 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05);澤瀉湯組、澤瀉組、白術(shù)組小鼠肝臟中CYP3A4 mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.05);澤瀉湯組、澤瀉組、白術(shù)組小鼠肝臟中CYP2C9 mRNA表達(dá)水平無影響,結(jié)果見表3。

表3 澤瀉湯及其拆方對CYP450酶亞型基因表達(dá)的影響

4 討論

澤瀉湯臨床應(yīng)用廣泛,也經(jīng)常加味配伍使用或與其他藥物聯(lián)合使用,并且澤瀉湯成分復(fù)雜,與其他藥物聯(lián)合用藥時可能會發(fā)生配伍變化[7-9]。CYP450酶及其亞型是藥物在體內(nèi)發(fā)生相互作用的關(guān)鍵因素,CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9是CYP450酶系的主要亞型,目前上市藥品經(jīng)CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9酶代謝的達(dá)70%,因此,本研究選擇上述4個亞型進(jìn)行研究。明確澤瀉湯及其拆方在疾病狀態(tài)下對CYP450酶亞型酶活性及基因表達(dá)量的影響,能夠使?jié)蔀a湯在臨床上更合理地配伍使用,也盡量減少因藥物相互作用產(chǎn)生的不良反應(yīng)。

根據(jù)文獻(xiàn)[10]和本課題組前期研究基礎(chǔ)選擇公認(rèn)的探針?biāo)幬镞M(jìn)行CYP450酶亞型酶活性測定,肝藥酶CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9、CYP3A4的特異性探針底物分別為咖啡因、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、睪酮。探針?biāo)幬镏g以及與內(nèi)標(biāo)地西泮不產(chǎn)生相互干擾,能夠特異性檢測出各CYP450酶亞型的活性。由于本次實驗探究了澤瀉湯對CYP450酶4個亞型的影響,設(shè)置單一陽性藥物對照對多個酶活性的探究意義不明顯,因此,本研究并未單設(shè)陽性藥物組。

對酶活性實驗結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),高脂血癥在動物水平可以顯著降低CYP2E1、CYP3A4酶活性,提示臨床上高脂血癥患者使用經(jīng)上述兩種酶代謝的藥物時,應(yīng)考慮給藥劑量,以避免造成藥物蓄積。他汀類藥物是具有代表性的一線降脂藥物,其經(jīng)過CYP3A4酶代謝[11]。研究發(fā)現(xiàn),阿托伐他汀治療攜帶CYP3A4*18B基因的患者比未攜帶者血藥濃度高,調(diào)脂療效更顯著[12]。因此,高脂血癥患者在服用阿托伐他汀等他汀類藥物降脂時,應(yīng)進(jìn)行治療藥物監(jiān)測,防止產(chǎn)生藥物蓄積,避免出現(xiàn)橫紋肌溶解等嚴(yán)重不良反應(yīng)[13-14]。本研究結(jié)果顯示,澤瀉湯全方及拆方逆轉(zhuǎn)了高脂血癥對CYP3A4酶活性的抑制作用。另有研究表明,CYP3A4酶與脂代謝相關(guān)[15],因此,澤瀉湯在對代謝酶產(chǎn)生影響的同時間接發(fā)揮了降脂作用,這也可能是其治療高脂血癥的機(jī)制,有待于進(jìn)一步研究。研究表明,硝苯地平、氨氯地平等降壓藥物經(jīng)CYP3A4代謝[16],與澤瀉湯合用時,由于澤瀉湯誘導(dǎo)CYP3A4酶,會加快硝苯地平在體內(nèi)的代謝降低血藥濃度,進(jìn)而影響藥效。格列本脲是臨床上常用的降糖藥物,其為CYP2C9的底物,而澤瀉湯抑制CYP2C9酶的活性,所以,當(dāng)格列本脲與澤瀉湯同時使用時,會減少格列本脲在體內(nèi)的代謝,增加其血藥濃度,提高藥效的同時可能會增加不良反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險。這些經(jīng)CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9酶代謝的藥物與澤瀉湯聯(lián)合使用時,極易發(fā)生相互作用影響藥效,甚至?xí)a(chǎn)生毒性反應(yīng)。因此,當(dāng)澤瀉湯與副作用或毒性較大的藥物聯(lián)合使用時,應(yīng)進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測,及時調(diào)整給藥劑量,避免發(fā)生不良反應(yīng)。

本研究還采用實時熒光定量PCR檢測澤瀉湯及其拆方對CYP450酶亞型基因表達(dá)的影響。實驗結(jié)果表明,澤瀉湯全方及其拆方逆轉(zhuǎn)了高脂血癥對CYP3A4 mRNA表達(dá)水平的抑制作用,與其對酶活性的影響具有一致性,且單味澤瀉組與全方具有一致性,優(yōu)于白術(shù)組,充分體現(xiàn)了澤瀉在澤瀉湯中的主導(dǎo)地位。同時,澤瀉湯和澤瀉還逆轉(zhuǎn)了高脂血癥對CYP1A2 mRNA表達(dá)水平的抑制作用。澤瀉湯抑制了高脂血癥小鼠CYP2E1 mRNA表達(dá)水平,與其對酶活性的影響一致,然而,單味澤瀉組和白術(shù)組雖抑制了CYP2E1 mRNA表達(dá)水平,卻對酶活性無影響。澤瀉湯全方及其拆方對CYP2E1酶活性和基因表達(dá)不一致,可能是由于基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯受轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾的影響,多肽鏈合成很多但功能化不足導(dǎo)致酶活性與基因表達(dá)量不成正比。

本研究以CYP450酶為核心,探索了澤瀉湯及其拆方對高脂血癥模型小鼠CYP450酶亞型酶活性及基因表達(dá)量的影響,為澤瀉湯的合理應(yīng)用及澤瀉和白術(shù)配伍研究提供了理論基礎(chǔ),也為澤瀉湯的進(jìn)一步研究提供新思路。