李曉鋒,林玉鳳,張雅蓓,陳向輝,趙 蕊,朱 偉,謝雅彬,謝 偉,巴德仁貴,姜樹(shù)原,8,劉曉蕾,8,邵 國(guó),9,白?；?賈小娥,楊志甫

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭 014040;2.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;3.包頭醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所;4.內(nèi)蒙古自治區(qū)低氧轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;5.濮陽(yáng)油田總醫(yī)院急診科;6.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院;7.包頭醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院;8.包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院;9.深圳市龍崗區(qū)第三人民醫(yī)院;10.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院基因檢測(cè)中心)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)又稱(chēng)為震顫麻痹,是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,臨床上特征表現(xiàn)為靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直及姿勢(shì)步態(tài)異常,病理特征是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元缺失和路易小體形成;目前具體病因不詳,可能與環(huán)境、遺傳、氧化應(yīng)激、線粒體功能缺陷、免疫、炎癥和年齡等均有一定關(guān)系[1]。PD具有不可逆性和一定的致殘性,嚴(yán)重影響患者學(xué)習(xí)能力和日常生活,對(duì)家庭和社會(huì)造成極大的負(fù)擔(dān)。多巴胺能藥物是目前臨床上治療PD的常用藥物,但長(zhǎng)期使用可能會(huì)出現(xiàn)藥效下降、劑末現(xiàn)象、開(kāi)-關(guān)現(xiàn)象和異動(dòng)癥等并發(fā)癥。因此探索更加有效、長(zhǎng)久和安全的治療方法,提升患者生活質(zhì)量是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

民族醫(yī)藥有著悠久的使用歷史,具有多靶點(diǎn)、增效減毒等效果,和多巴胺能藥物等聯(lián)合使用可能為更有效、安全地治療PD提供新的方案。蒙藥額爾敦-烏日勒寓意“珍貴神奇的藥丸”,是蒙醫(yī)藥歷史上的瑰寶之一,主要由珍珠、牛黃、犀角、桅子、肉桂、決明子、檀香、沉香、木香、紅花、丁香、川諫子、甘草、黑種草子、肉豆寇、草果、土木香和訶子等29味天然藥材配合組成[2-3],是蒙醫(yī)治療“白脈病”(即神經(jīng)系統(tǒng)疾病)的傳統(tǒng)驗(yàn)方[4-5],但其具體作用機(jī)制尚未完全清楚。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中,初拉等[6]通過(guò)不同化學(xué)萃取的方法檢出16種與神經(jīng)相關(guān)的成分。近年來(lái)對(duì)蒙藥額爾敦-烏日勒的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制主要包括促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌、調(diào)控神經(jīng)相關(guān)基因表達(dá),抑制炎癥因子、抗凋亡、抗氧化等方面。但其治療PD的具體作用機(jī)制及靶點(diǎn)研究尚少。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論,從藥物、靶點(diǎn)與疾病間相互作用的整體性和系統(tǒng)性出發(fā),通過(guò)采用復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)模型,揭示藥物、基因、靶點(diǎn)、疾病之間復(fù)雜的整體生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,在此基礎(chǔ)上分析、預(yù)測(cè)藥物的藥理學(xué)作用機(jī)制[7]。中藥方劑成分多,化學(xué)成分復(fù)雜,作用機(jī)制的研究較為困難。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的出現(xiàn)為中藥的機(jī)制探究提供了新的方法,為中藥尋找治療靶點(diǎn),并可能在分析中發(fā)現(xiàn)藥物新的治療作用,極大地促進(jìn)了中醫(yī)中藥的發(fā)展。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法篩選蒙藥額爾敦-烏日勒治療緩解PD的有關(guān)活性成分及可能靶點(diǎn),進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其潛在的作用機(jī)制,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和臨床應(yīng)用提供有力的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1蒙藥額爾敦-烏日勒活性成分及靶點(diǎn)的收集 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)(https://old.tcmsp-e.com/index.php)及相關(guān)文獻(xiàn)收集蒙藥額爾敦-烏日勒主要藥物的化學(xué)成分,以口服利用度(oral bioavailability,OB)閾值≥30%和化合物的類(lèi)藥性(drug-likeness,DL)閾值≥0.18為依據(jù)進(jìn)行篩選,并通過(guò)TCMSP平臺(tái)篩選出蒙藥額爾敦-烏日勒的活性成分的作用靶點(diǎn),通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)把相關(guān)靶點(diǎn)基因轉(zhuǎn)化為“Homo sapiens”的標(biāo)準(zhǔn)基因名稱(chēng),用軟件Cytoscape 3.9.1繪制藥物活性成分-靶點(diǎn)圖。

1.2藥物活性成分與PD的共同靶點(diǎn) 在人類(lèi)基因-疾病相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards)(hppp://www.genecards.org/)、人類(lèi)基因和遺傳紊亂的數(shù)據(jù)庫(kù)(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)(http://www.omim.org)和治療目標(biāo)TTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://db.idrblab.net/ttd/),以“Parkinson’s disease”為檢索詞進(jìn)行檢索,獲取PD疾病靶點(diǎn),刪除重復(fù)靶點(diǎn),用微生信在線(https://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html)將蒙藥額爾敦-烏日勒活性成分相關(guān)靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行匹配映射,繪制韋恩圖(Venn),以獲得蒙藥額爾敦-烏日勒活性成分治療PD的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3共同靶點(diǎn)的蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 String平臺(tái)(http://string-db.org/Version 10.5)是蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù),可搜索已知蛋白之間和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用。將蒙藥額爾敦-烏日勒和PD共同靶點(diǎn)輸入到String數(shù)據(jù)庫(kù),將研究物種選擇為人類(lèi)(“Homo sapiens”),設(shè)置置信度,標(biāo)準(zhǔn)為confidence>0.4,并勾選show your query protein names和Experiments,繪制蛋白互作圖,并將String中下載的.tsv文件用Cytoscape 3.9.1進(jìn)行處理,將蛋白互作圖進(jìn)行可視化分析,根據(jù)度值(degree)繪制網(wǎng)絡(luò)圖,得到前200個(gè)PPI核心基因靶點(diǎn)。

1.4基因本體(gene ontology,GO)、京都基因和基因百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)功能富集分析 將1.3獲得的200個(gè)核心基因靶點(diǎn)應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov)及微生信平臺(tái)(www.bioinformatics.com.cn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析,將前20個(gè)結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.5藥物活性成分-靶點(diǎn)蛋白分子對(duì)接 先利用Cytoscape 3.9.1軟件對(duì)蒙藥額爾敦-烏日勒中的有效活性成分進(jìn)行篩選,得到度值最高的5種小分子化合物,分別為槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇和木樨草素,然后在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中下載小分子的mol.2格式文件。在Autodock1.5.7上對(duì)其進(jìn)行加氫和旋轉(zhuǎn)鍵設(shè)置后導(dǎo)出為pdbqt格式文件。選取預(yù)測(cè)靶點(diǎn)度值前5位的靶點(diǎn)蛋白,然后在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)及相關(guān)文獻(xiàn)中查找合適的靶點(diǎn)蛋白的pdb文件,運(yùn)用pymol及Autodock1.5.7分別進(jìn)行去除水和溶劑分子、配體、加氫操作后導(dǎo)出為pdbqt文件。在Autodock1.5.7中運(yùn)行AutoGrid和AutoDock后,獲得pdbqt格式的對(duì)接結(jié)果文件及對(duì)接能大小等信息。最后在Pymol軟件上對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化處理,并將其對(duì)接能繪制成熱圖。

2 結(jié)果

2.1蒙藥額爾敦-烏日勒的活性成分及預(yù)測(cè)靶點(diǎn) 通過(guò)TCMSP平臺(tái)以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為依據(jù),篩選蒙藥額爾敦-烏日勒主要成分(蓽茇、丁香、訶子、川楝子、梔子、紅花、肉豆蔻、決明子、草果、木香、降香、沉香、海金沙、人工牛黃)的活性成分。篩選后各成分以中文名字的首字母進(jìn)行命名,其主要化學(xué)成分命名為首字母加數(shù)字,如蓽茇的部分活性成分命名為BIBA1、BIBA2等,其中各藥物的重復(fù)化學(xué)成分共有13種,分別命名為A1、B1、C1、D1、E1、F1、F2、F3、F4、F5、L1、N1、O1,并繼續(xù)在此平臺(tái)上篩選出每種藥物活性成分的靶點(diǎn),通過(guò)篩選共獲得260個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)(圖1),蒙藥額爾敦-烏日勒207個(gè)作用靶點(diǎn)與PD有關(guān)。蒙藥額爾敦-烏日勒的同一活性成分可以作用于不同的靶點(diǎn),同一靶點(diǎn)又可以受不同的活性成分作用,體現(xiàn)了蒙藥額爾敦-烏日勒治療PD的多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

圖1 蒙藥額爾敦-烏日勒的活性成分及預(yù)測(cè)靶點(diǎn):其中青色正方形為蒙藥額爾敦-烏日勒的主要成分,環(huán)繞藥物周?chē)膱A形為其主要化合物成分,五邊形代表不同中藥里含有的共同化合物成分,菱形為活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)

2.2藥物活性成分與PD的共同靶點(diǎn) 在GeneCards、OMIM和TTD數(shù)據(jù)庫(kù)以“Parkinson’s disease”進(jìn)行檢索,獲取PD疾病靶點(diǎn),整合到一起,刪除重復(fù)靶點(diǎn),得到PD的靶點(diǎn)9 908個(gè)。用微生信在線(https://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html)軟件將蒙藥額爾敦-烏日勒活性成分相關(guān)的260個(gè)靶點(diǎn)和9 908個(gè)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行匹配映射,繪制Venn圖,獲得蒙藥額爾敦-烏日勒的活性成分的潛在治療PD的作用靶點(diǎn)共207個(gè)(圖2)。

圖2 Venn圖

2.3PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將2.2獲得的蒙藥額爾敦-烏日勒活性成分的潛在治療PD作用的207個(gè)靶點(diǎn),輸入到String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.string-db.org/),獲得蒙藥額爾敦-烏日勒與PD的PPI網(wǎng)絡(luò),圖中階段之間的連線表示兩者之間存在相互作用,顏色不同則相互作用類(lèi)型不同,連線越多則作用越密切。節(jié)點(diǎn)數(shù)為206,邊數(shù)為2 522,平均節(jié)點(diǎn)度為24.5,平均局部聚類(lèi)系數(shù)為0.556(圖3A)。將圖String中下載的.tsv文件用軟件Cytoscape 3.9.1將PPI圖網(wǎng)絡(luò)分析圖進(jìn)行可視化分析,根據(jù)度值制圓形,通過(guò)圓形的大小及顏色深淺可更直觀地看出各節(jié)點(diǎn)所鏈接節(jié)點(diǎn)數(shù)的多少,圓形越大,顏色越深則該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越關(guān)鍵,得到前200個(gè)PPI核心基因靶點(diǎn),其中關(guān)聯(lián)度值最高的前5個(gè)節(jié)點(diǎn)依次為AKT1、TP53、TNF、VEGFA、CASP3(圖3B),表明了這些基因可能是蒙藥額爾敦-烏日勒治療PD的潛在靶點(diǎn)。

2.4GO、KEGG功能富集分析 應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(http://metascape.org)和微生信平臺(tái)(www.bioinformatics.com.cn)對(duì)獲得的靶點(diǎn)進(jìn)行GO、KEGG富集分析。GO富集分析結(jié)果表明,蒙藥額爾敦-烏日勒治療PD的作用機(jī)制主要涉及RNA聚合酶啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、正調(diào)控DNA模板轉(zhuǎn)錄和正調(diào)控基因表達(dá)等生物過(guò)程(圖4)。繪制KEGG富集氣泡圖,橫坐標(biāo)為基因比例(gene ratio),縱坐標(biāo)為化合物分子發(fā)揮功能的通路,氣泡大小表示富集的顯著性(即Pvalue的數(shù)值大小),Pvalue越小越接近紅色,富集程度越高。KEGG富集分析結(jié)果表明,共富集到1 021條通路。根據(jù)度值篩選到20條關(guān)鍵通路,其中與治療PD相關(guān)的包括與脂質(zhì)動(dòng)脈硬化、IL-17信號(hào)通路、P13K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等(圖5)。以上結(jié)果表示,蒙藥額爾敦-烏日勒通過(guò)多通路協(xié)同作用治療PD。

圖4 GO富集分析

圖5 KEGG氣泡圖:蒙藥額爾敦-烏日勒治療PD相關(guān)的通路

2.5分子對(duì)接 將蒙藥額爾敦-烏日勒中度值最高的5種化合物槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇和木樨草素和靶點(diǎn)蛋白中度值最高的前5位靶點(diǎn)蛋白分子AKT1(3o96)、TP53(1gzh)、TNF(5uui)、VEGFA(1mkk)、CASP3(1nms)分別進(jìn)行分子對(duì)接,獲得其結(jié)合能的大小,將其繪制成熱圖(圖6A),并分別對(duì)每個(gè)靶點(diǎn)蛋白結(jié)合能最低的小分子化合物進(jìn)行可視化。共進(jìn)行25次分子對(duì)接,結(jié)果顯示結(jié)合能均小于-6.0,對(duì)接結(jié)果良好(圖6B)。

圖6 分子對(duì)接:A圖示結(jié)合能大小;B圖示對(duì)接結(jié)果的可視化

3 討論

蒙藥額爾敦-烏日勒中有效成分為黃酮類(lèi)化合物、木犀草素、梔子苷、桂皮醇等[8-10]。其中黃酮類(lèi)化合物具有調(diào)節(jié)炎癥和細(xì)胞生存相關(guān)的microRNA表達(dá)的特性;木犀草素可通過(guò)降低表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)的mRNA表達(dá),抑制EGF介導(dǎo)氧化磷酸化、ERK和MARK-PI3K-Akt信號(hào)通路激活,從而增強(qiáng)腦內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞穩(wěn)定性[11]。梔子苷可以提高損傷神經(jīng)細(xì)胞活力,減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡,對(duì)PD小鼠模型具有調(diào)節(jié)DA代謝和神經(jīng)保護(hù)作用,改善PD小鼠的睡眠障礙[12]。體外實(shí)驗(yàn)表明桂皮醇可減輕IL-1刺激下大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子COX和PGE2的釋放[13]。大量研究表明,蒙藥額爾敦-烏日勒通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮腦源性營(yíng)養(yǎng)作用和神經(jīng)保護(hù)作用[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn),蒙藥額爾敦-烏日勒中含有118個(gè)活性成分可與和PD相關(guān)的207個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮作用,這些活性成分發(fā)揮抗PD作用的主要靶點(diǎn)是AKT1、TP53、TNF、VEGFA、CASP3等。應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)和微生信平臺(tái)對(duì)蒙藥額爾敦-烏日勒潛在作用于PD的靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析,結(jié)果顯示蒙藥額爾敦-烏日勒治療PD的作用機(jī)制主要涉及RNA聚合酶啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、正調(diào)控DNA模板轉(zhuǎn)錄和正調(diào)控基因表達(dá)等生物過(guò)程。這些通路在細(xì)胞代謝、增殖、細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和血管生成等方面發(fā)揮作用,額爾敦-烏日勒的治療作用可能與促進(jìn)這些生命活動(dòng)的進(jìn)行有關(guān)。

AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,是PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要中間分子,在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路中起重要作用,調(diào)節(jié)許多過(guò)程,包括代謝、增殖、細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和血管生成。李筱媛[16]通過(guò)病例對(duì)照對(duì)我國(guó)北方地區(qū)漢族中散發(fā)PD患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),TLR2和AKT1基因多態(tài)性均與中國(guó)北方漢族散發(fā)性PD的人群具有風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)。研究表明,PD和動(dòng)脈粥樣硬化在發(fā)病機(jī)制上有很多相同和相似之處,發(fā)病機(jī)制都涉及血管內(nèi)皮功能紊亂、炎癥反應(yīng)等過(guò)程[17]。IL-17RA/核因子κB通路激活是PD神經(jīng)元死亡的主要原因之一。研究發(fā)現(xiàn),在與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)或添加IL-17后,多能干細(xì)胞衍生的PD中腦神經(jīng)元在IL-17受體(IL-17R)上調(diào)和NF-κB激活的驅(qū)動(dòng)下,導(dǎo)致神經(jīng)元死亡增加,而阻斷IL-17或IL-17R,或添加FDA批準(zhǔn)的抗IL-17抗體secukinumab,可有效挽救神經(jīng)元的死亡。上述研究表明,產(chǎn)生IL-17的T淋巴細(xì)胞在散發(fā)性PD中起著關(guān)鍵作用[18-19]。P13K/Akt信號(hào)通路可促進(jìn)細(xì)胞代謝、增殖、存活、生長(zhǎng),參與癌癥的發(fā)生、化療耐藥和血管生成的調(diào)控。Shimoke等[20]應(yīng)用NGF(神經(jīng)生長(zhǎng)因子)治療MPTP誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞PD模型,發(fā)現(xiàn)其有保護(hù)作用,且這種保護(hù)作用可被PI3K的特異性抑制劑LY294002所削弱,認(rèn)為NGF可能通過(guò)Akt信號(hào)通路起到對(duì)PD的治療作用。劉曉芳[21]研究發(fā)現(xiàn),鈣釋放激活鈣通道調(diào)節(jié)分子1的表達(dá)下降可通過(guò)PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路影響神經(jīng)炎癥,從而使多巴胺能神經(jīng)元含量下降,參與PD發(fā)展。MAPK是細(xì)胞內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,已被證實(shí)參與多種細(xì)胞生理活動(dòng),通過(guò)逐步激活將細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi),進(jìn)而調(diào)整細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡、炎癥等生理及病理過(guò)程。MAPK家族主要包括p38MAPK、c-Jun氨基末端激酶和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶[22]。在多項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn),α-突觸核蛋白異常蓄積激活p38 MAPK可促進(jìn)神經(jīng)元死亡,進(jìn)而參與多種神經(jīng)退行性疾病的致病進(jìn)程[23]。在伴有認(rèn)知功能障礙PD小鼠的相關(guān)研究中也發(fā)現(xiàn)了p38MAPK的異常激活;而抑制p38MAPK可改善PD小鼠突觸可塑性,改善其認(rèn)知功能;該項(xiàng)研究認(rèn)為,p38MAPK異常激活可損傷突觸的可塑性,是PD認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制之一[24]。本研究經(jīng)KEGG富集發(fā)現(xiàn),蒙藥額爾敦-烏日勒治療PD的主要作用通路包括與脂質(zhì)動(dòng)脈硬化相關(guān)通路、IL-17信號(hào)通路、P13K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等。我們認(rèn)為,蒙藥額爾敦-烏日勒通過(guò)多通路協(xié)同作用治療PD。

綜上所述,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)蒙藥額爾敦-烏日勒的主要成分進(jìn)行研究,預(yù)測(cè)了蒙藥額爾敦-烏日勒治療PD的主要靶點(diǎn)及作用機(jī)制,初步詮釋了蒙藥額爾敦-烏日勒可通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路治療PD,為進(jìn)一步理論研究、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和臨床應(yīng)用指明了方向。