李佳逸,康建平,2*,譚 昕,2,何雨靜,2,王燕來(lái),何 勇

(1.四川省紡織科學(xué)研究院有限公司,四川 成都 610000;2.高技術(shù)有機(jī)纖維四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610000)

聚蘋果酸(Poly Malic acid,PMLA)又名聚羥基丁二酸酯,是一種具有良好生物相容性及生物降解性的水溶性脂肪族聚酯類化合物。PMLA 是以重復(fù)的L-蘋果酸為單體,通過(guò)—OH 和α-或β-COOH 形成的酯鍵聚合而成,主要有3 種構(gòu)型:α 型、β型、γ 型,如圖1[1]所示。由于PMLA 側(cè)鏈存在大量游離的羧基,容易被修飾或改性,與具有功能分子的活性基團(tuán)相結(jié)合,從而使其附有特殊功能[2],因此在生物醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[3]。

圖1 蘋果酸和PMLA 的3種構(gòu)型

目前,聚蘋果酸的合成方法主要分為化學(xué)合成法和生物合成法?；瘜W(xué)合成法主要有開(kāi)環(huán)聚合法和直接聚合法,可以得到3種構(gòu)型的PMLA,其中開(kāi)環(huán)聚合法技術(shù)較為成熟。但與生物合成法相比,化學(xué)法合成的PMLA 分子量較小,合成步驟長(zhǎng),提純工藝復(fù)雜,嚴(yán)重制約了其規(guī)?；l(fā)展。微生物合成法是由微生物體內(nèi)通過(guò)三羧酸循環(huán)代謝僅存有β-型,能得到相對(duì)分子量較大的PMLA,且具有較高的化學(xué)純度和光學(xué)純度,性能優(yōu)異,成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。總結(jié)國(guó)內(nèi)外近年來(lái)關(guān)于微生物合成β-PMLA 及其應(yīng)用的相關(guān)研究,為更加深入利用生物法合成PMLA 提供策略。

1 微生物法合成聚蘋果酸

微生物發(fā)酵可以持續(xù)產(chǎn)生PMLA,Shimada等[4]在1969 年首次發(fā)現(xiàn)了從圓弧青霉(Penicillium cyclopium)中分離得到的以蘋果酸為結(jié)構(gòu)單元的一種聚合物對(duì)蛋白酶具有抑制作用,這種聚合物后來(lái)被證實(shí)為PMLA。隨后,Fischer 等[5]從多頭絨泡菌(Physarumpolycephalum)中分離到PMLA,發(fā)現(xiàn)其可抑制α型DNA 聚合酶活性。到目前為止,生物法合成PMLA 的研究菌株主要存在于黏菌科多頭絨泡菌和短梗霉屬。多頭絨泡菌是一種多形態(tài)真菌,PMLA主要產(chǎn)生于其原質(zhì)團(tuán)時(shí)期,多核原質(zhì)團(tuán)以L-蘋果酸為前體,在聚合酶的催化下才能合成分子量為10～300 k Da的PMLA,且產(chǎn)量較低,難以滿足工業(yè)應(yīng)用。目前對(duì)多頭絨泡菌合成聚蘋果酸的研究多集中在合成及代謝調(diào)控方面[6],由于其產(chǎn)量較低,在發(fā)酵法合成方面的研究較少。出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)是一種具有酵母型和菌絲形態(tài)的的多型真菌,其形態(tài)較黏菌相對(duì)穩(wěn)定,合成PMLA 的能力也相對(duì)較強(qiáng)[7]。

1.1 出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)β-聚蘋果酸

Nagata等[8]篩選鑒定了一株出芽短梗霉在以甘露糖為碳源的選擇培養(yǎng)基中產(chǎn)生了一種來(lái)源于葡萄糖的β型胞外聚酯,后被證實(shí)其單體為L(zhǎng)-蘋果酸。出芽短梗霉合成的PMLA 分為兩部分,其中一部分以β-PMLA-葡聚糖結(jié)合體的形式分泌,另一部分被分解為分子量5～10 k Da的自由β-PMLA,分泌到細(xì)胞外。徐玲芬等[9]從自然界中的樹(shù)皮、樹(shù)葉等樣本中分離得到一株高產(chǎn)PMLA 菌株,經(jīng)鑒定屬于出芽短梗霉菌,以葡萄糖為碳源,發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到26.23 g/L。Xia等[10]通過(guò)添加1% (w/v)大豆油使A.pullulans發(fā)酵產(chǎn)生的PMLA 濃度和產(chǎn)率分別提高了34.2%和80%。

1.2 出芽短梗霉合成PMLA代謝途徑

出芽短梗霉合成PMLA 主要途徑包括TCA 循環(huán)和乙醛酸途徑,L-蘋果酸作為PMLA 唯一單體,與PMLA 合成效率有著密切的關(guān)系。蘋果酸是TCA 循環(huán)中的關(guān)鍵中間體,經(jīng)延胡索酸酶催化生成,隨后在線粒體內(nèi)經(jīng)蘋果酸脫氫酶(m MDH)催化轉(zhuǎn)化為草酰乙酸。在乙醛酸循環(huán)中,蘋果酸合成酶(MSE)能夠催化乙醛酸和乙酰輔酶A 縮合成蘋果酸,如圖2所示[11]。

圖2 出芽短梗霉PMLA 合成途徑

L-蘋果酸能夠在添加外源性碳酸鹽時(shí),通過(guò)細(xì)胞質(zhì)中的還原途徑產(chǎn)生,丙酮酸會(huì)被丙酮酸羧化酶先一步羧化為草酰乙酸,然后再被蘋果酸脫氫酶進(jìn)一步還原成蘋果酸。因此,在出芽短梗霉發(fā)酵培養(yǎng)基中通常會(huì)添加CaCO3以提高PMLA 產(chǎn)量。值得注意的是,CaCO3的缺失或不足會(huì)導(dǎo)致出芽短梗霉能夠合成其他多種胞外產(chǎn)物,如普魯蘭多糖、淀粉酶等。

2 聚蘋果酸的發(fā)酵調(diào)控

2.1 培養(yǎng)基成分

PMLA 發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)酸,碳源和氮源是微生物生長(zhǎng)代謝的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),低濃度的無(wú)機(jī)鹽能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成。常用的碳源有葡萄糖、淀粉、蔗糖等,除此之外也有不少學(xué)者通過(guò)利用生物質(zhì)作為碳源發(fā)酵產(chǎn)生PMLA,以降低發(fā)酵原料的成本,從而降低聚蘋果酸的生產(chǎn)成本。Timothy等[12]使用H2O2預(yù)處理小麥秸稈,當(dāng)在含有5%的小麥秸稈發(fā)酵液中加入3%CaCO3時(shí),獲得23.5 g/L的聚蘋果酸產(chǎn)量。Wei等[13]通過(guò)在5 L發(fā)酵罐中分批補(bǔ)料發(fā)酵,以稀釋后的甘蔗糖蜜作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),不添加其他額外的成分,即可滿足發(fā)酵需求,PMLA,產(chǎn)量達(dá)到1 163 g/L。Liu等[14]通過(guò)出芽短梗霉ZD-3d以分批補(bǔ)料的發(fā)酵方式,在木薯原料水解液中生成PMLA,產(chǎn)量達(dá)到101.9 g/L。

幾乎所有的氮源都能促進(jìn)PMLA 發(fā)酵,但發(fā)酵產(chǎn)量有所差異,靳挺等[15]研究以硫酸銨、尿素、丁二酸胺作為氮源發(fā)酵產(chǎn)PMLA,結(jié)果表明這3種氮源均能提高PMLA 產(chǎn)量,其中丁二酸作為氮源時(shí)產(chǎn)量最高。吳艷麗等[16]通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究了最佳碳源、氮源和碳酸鈣添加量,并進(jìn)行Box-Benhken實(shí)驗(yàn),得到最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基成分為120 g/L葡萄糖,3.02 g/L丁二酸胺,30 g/L CaCO3,p H 值4.68 時(shí)PMLA 產(chǎn)量最大達(dá)到17.48 g/L。

2.2 添加酶抑制劑、輔因子

通過(guò)平衡TCA 循環(huán)和乙醛酸途徑之間的代謝流量,并調(diào)控中間代謝產(chǎn)物的量,可以提高菌株利用碳源合成β-PMLA 的效率。Liu等[17]在研究中發(fā)現(xiàn),向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加馬來(lái)酸、丙二酸、蘋果酸和琥珀酸可促進(jìn)PMLA 的合成,在添加三氟乙酸的情況下則有抑制作用。相比對(duì)照組,添加20 g/L琥珀酸可以使PMLA產(chǎn)量提高44%。推測(cè)原因是丙二酸競(jìng)爭(zhēng)性抑制琥珀酸脫氫酶,導(dǎo)致TCA 循環(huán)的代謝通量流經(jīng)乙醛酸循環(huán),從而能夠提高PMLA 合成產(chǎn)量。Zuo等[18]研究發(fā)現(xiàn)向培養(yǎng)基中補(bǔ)充TCA 還原途徑的輔助因子生物素和CO2供體可以提高PMLA 的產(chǎn)量。喬長(zhǎng)晟等[19]比較野生出芽短梗霉菌株TKPM00006和誘變菌株CGMCC30007在相同發(fā)酵條件下的關(guān)鍵酶活,結(jié)果表明CGMCC30007的丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫羧酶活力分別提高了29%和18%。與Liu等的研究結(jié)果一致的是,添加三氟乙酸會(huì)抑制TCA 循環(huán)和乙醚酸循環(huán),導(dǎo)致PMA 的合成產(chǎn)量下降25.7%。

2.3 發(fā)酵條件

提高PMLA 發(fā)酵產(chǎn)量除了篩選高產(chǎn)菌株外,菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件,如溫度、p H 值、攪拌轉(zhuǎn)速和不同補(bǔ)料方式對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響也十分重要。

發(fā)酵溫度是影響微生物生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的重要因素。對(duì)于出芽短梗霉來(lái)說(shuō),一般在適宜的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵,通常在25～30 ℃之間。陳曦等[20]通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出芽短梗霉BK-10培養(yǎng)條件,得出結(jié)論:最佳發(fā)酵溫度26 ℃,250 m L搖瓶裝液量50 m L時(shí),生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到0.89 g/(L·h)。

p H 值是另一個(gè)重要的因素,直接影響微生物的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。對(duì)于出芽短梗霉來(lái)說(shuō),適宜的p H 值范圍一般在4.5～6.5之間。王麗燕等[21]通過(guò)搖瓶實(shí)驗(yàn)研究了A.pullulansBS02最優(yōu)培養(yǎng)條件為:以葡萄糖為碳源,添加50 g/L CaCO3,在p H 值4.0～5.0、溫度24 ℃下發(fā)酵培養(yǎng)10 d,其產(chǎn)量達(dá)到30 g/L。

發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí)攪拌器的作用是改善通氣效率,改變?nèi)苎?。出芽短梗霉作為?qiáng)好氧菌,發(fā)酵過(guò)程中溶氧越高越有利于菌體生長(zhǎng)。Cao等[22]發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)節(jié)不同發(fā)酵階段溶氧可以提升出芽短梗霉ipe-1合成PMLA的產(chǎn)量。

微生物的生長(zhǎng)繁殖離不開(kāi)養(yǎng)分的供給,但過(guò)量的碳源、氮源會(huì)導(dǎo)致菌體過(guò)量繁殖,過(guò)早衰老、自溶,致使目標(biāo)產(chǎn)物合成效率降低。合理的補(bǔ)料方式可以提供適當(dāng)?shù)酿B(yǎng)分供給,促進(jìn)發(fā)酵過(guò)程的穩(wěn)定和高效進(jìn)行,從而提高發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量和產(chǎn)量。昝占全[23]在研究出芽短梗霉A.pullulanFMT1801發(fā)酵甘薯淀粉水解液產(chǎn)PMLA 時(shí)發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過(guò)程中隨著底物的不斷消耗,發(fā)酵72 h時(shí)殘?zhí)禽^低,不足以供應(yīng)發(fā)酵菌株合成PMLA,所以考慮補(bǔ)料培養(yǎng),通過(guò)分批補(bǔ)料的方式,PMLA產(chǎn)量提高了42.4%。

3 聚蘋果酸的應(yīng)用

3.1 藥物載體

PMLA 具有較高的溶解性、生物相容性和優(yōu)良的生物可降解性,能夠包裹藥物與特性的組織特異性標(biāo)記物共價(jià)結(jié)合,從而控制藥物釋放的時(shí)間和部位。Abdellaui等[24]通過(guò)酰胺鍵鏈接PMLA 與抗癌藥物Dox,形成穩(wěn)定的靶向給藥系統(tǒng),使載體在滲透進(jìn)髓細(xì)胞K562細(xì)胞核后才將藥物釋放。喬友備[25]通過(guò)在β-聚蘋果酸主鏈上引入酰胺鍵修飾羥基喜樹(shù)堿,得到聚蘋果酸-羥基喜樹(shù)堿軛合物,該軛合物能夠有效改善羥基喜樹(shù)堿的溶解性能。

3.2 生物醫(yī)學(xué)材料

PMLA 及其衍生物優(yōu)異的可降解性和生物可吸收性使其可以用于制備手術(shù)縫合線、固體藥物包裝、骨骼修復(fù)等生物醫(yī)學(xué)材料。Michel[26]通過(guò)研究PMLA 改性制備的透析袋性能,發(fā)現(xiàn)其具有較高的膠體滲透壓,能夠代替具有毒性的傳統(tǒng)聚硅酮腹膜透析袋。李世普等[27]利用PMLA 作為主鏈,通過(guò)接枝導(dǎo)電基團(tuán)和可降解基團(tuán)的改造,研發(fā)了一種既可降解又導(dǎo)電的生物醫(yī)用高分子材料。這種材料可以用于生產(chǎn)導(dǎo)管、縫合線、薄膜及組織工程支架等多種生物醫(yī)學(xué)材料。Viviane等[28]研究發(fā)現(xiàn)以PMLA 保護(hù)的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子具有高效誘導(dǎo)骨生成能力。

3.3 食品添加劑

PMLA 熱水解產(chǎn)物L(fēng)-蘋果酸是一種天然有機(jī)酸,其風(fēng)味與蘋果酸味相似,較為柔和,因此可以被用于酸味劑。同時(shí),L-蘋果酸作為三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物,可以被人體直接吸收,從而為機(jī)體供能,被用于食品保健領(lǐng)域。

4 展 望

4.1 PMLA具有優(yōu)良特性,開(kāi)發(fā)潛力巨大

目前PMLA 供應(yīng)量較少,因此關(guān)于其應(yīng)用研究也較少。但是PMLA 具有優(yōu)良的可生物降解性、生物相容性及易修飾性質(zhì),在生物醫(yī)藥、生物材料、紡織等領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力。Qiu等[29]通過(guò)采用環(huán)保疏水的二元醇1,8-辛二醇作為交聯(lián)劑,在PMLA 中構(gòu)建無(wú)定形網(wǎng)絡(luò),提高PMLA 力學(xué)性能的同時(shí),也賦予了PMLA 形狀記憶效應(yīng)。因此推測(cè)后續(xù)可應(yīng)用于形狀記憶紡織品中,填補(bǔ)PMLA 在紡織品領(lǐng)域應(yīng)用的空白。

4.2 PMLA合成存在技術(shù)瓶頸,規(guī)?；a(chǎn)難度極大

目前聚蘋果酸的生產(chǎn)能力仍然較低,化學(xué)法生產(chǎn)成本高,環(huán)境污染大;生物法發(fā)酵菌株出芽短梗霉生長(zhǎng)繁殖速度慢,發(fā)酵周期長(zhǎng),產(chǎn)物提純難,導(dǎo)致PMLA 還沒(méi)有大規(guī)模應(yīng)用。

4.3 PMLA微生物合成法潛力大,研究前景廣闊

在PMLA 微生物合成法后續(xù)的研究中,如優(yōu)化代謝途徑、誘變選育穩(wěn)定高產(chǎn)菌株、優(yōu)化發(fā)酵條件,進(jìn)一步提高菌株微生物合成PMLA 的能力及分子量,減少反應(yīng)中副產(chǎn)物的合成成為主要研究方向。相信隨著研究的不斷深入,微生物法合成聚蘋果酸工業(yè)化指日可待。