梁霧瀅,劉 鎮(zhèn),曾玉淇,呂俊瑾,莫睿文,遠立國*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院,廣州 510642;2.廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點實驗室,廣州 510642;3.廣東省寵物工程技術(shù)研究中心,廣州 510642)

慢性疼痛為持續(xù)或者反復發(fā)作時間超過3個月,與潛在或?qū)嶋H組織損傷有關(guān)的不良情感體驗。因發(fā)生率高,病因復雜,機制尚未明晰,目前尚無科學有效的干預措施,慢性疼痛已成為威脅健康的關(guān)鍵因素之一[1-3]。科學干預是使“疼痛最小化”唯一途徑[4],藥物干預是獸醫(yī)臨床慢性疼痛治療的主要方法,雖可抑制疼痛反應,但尚存在不同程度的不良反應。

慢性疼痛過程涉及多種介質(zhì)[5],Nav1.8作為電壓門控鈉離子通道(voltage-gated sodium channels, VGSC)的一種亞型,在慢性疼痛過程參與度較高,優(yōu)先分布于外周感覺系統(tǒng)的小直徑神經(jīng)元中,參與鈉離子內(nèi)流過程,在外周神經(jīng)敏化中作為重要的離子通道發(fā)揮作用[6-7]。VGSC阻滯劑鎮(zhèn)痛效果明顯[8],但廣譜鈉通道阻滯劑并非僅阻滯與疼痛相關(guān)的亞型,同時會阻滯與骨骼肌、心肌相關(guān)的亞型并產(chǎn)生嚴重的副作用。阻滯Nav1.8后不會影響機體主要的生理功能,且Nav1.8結(jié)構(gòu)和功能的改變在慢性疼痛的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用,因此已成為治療慢性疼痛備受關(guān)注的靶點[9-10]。

海因類化合物作為鈉離子通道阻滯劑或一種非肽類生長抑制素,受體配體可高度選擇性作用于SSTR2,具有良好的鎮(zhèn)痛作用[11],通過結(jié)構(gòu)改造或修飾可以克服現(xiàn)有不足[12],有望成為治療慢性疼痛的先導化合物[13]。MH作為哺乳動物的代謝產(chǎn)物,屬海因類最簡單的小分子化合物,價廉、易得,若MH可通過選擇性阻滯Nav1.8的表達而起到鎮(zhèn)痛效果,其成藥潛力巨大。因此本文通過MH對坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型(chronic constriction injury, CCI)大鼠慢性疼痛的作用,探究MH鎮(zhèn)痛的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

Nav1.8通道的CHO細胞系(中國SCOPE公司);1-甲基海因(CATO);氨溴索(上海甄準生物科技有限公司);二甲基亞砜(北京索萊寶科技有限公司);水合氯醛(天津大茂化學試劑廠);兔多克隆抗體to Nav1.8、山羊抗兔IgG抗體(英國Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及建模 SPF級SD大鼠60只,體重(250±10)g,廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供[生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2016-0041],飼養(yǎng)于華南農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心。倫理批文號:2018B092。大鼠按雌、雄各半隨機分為正常對照組(N組)、假手術(shù)組(P組)、模型對照組(M組)、1-甲基海因組(MH組)、氨溴索組(A組)、利多卡因組(L組),每組10只。參照Bennett 等[14]的方法建立CCI模型;假手術(shù)組暴露坐骨神經(jīng)但不結(jié)扎;正常對照組不作任何處理。MH組、A組和L組大鼠在建模后第10天開始,直至第21或28天取DRG為止,分別接受肌注MH(25 mg·kg-1)、口服氨溴索(1 000 mg·kg-1)以及肌注2%利多卡因(0.2 mg·kg-1)治療。

1.2.2 蛋白免疫印跡 經(jīng)NCBI查詢獲得Nav1.8的蛋白序列,根據(jù)序列通過Expasy計算出通道分子量。從分離出的大鼠背根神經(jīng)節(jié)中提取總蛋白并測定蛋白濃度,蛋白樣品經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜于4 ℃封閉2 h ,用TBST緩沖液1∶4 000配制兔多克隆抗體to Nav1.8,4 ℃孵育12 h,山羊抗兔IgG抗體按1∶5 000稀釋,4 ℃避光孵育6 h,洗膜后利用紅外熒光掃面成像儀器進行掃膜,以β-actin為內(nèi)參,分析相關(guān)蛋白的表達水平。

1.2.3 全細胞膜片鉗技術(shù) 根據(jù)全細胞膜片鉗技術(shù)檢測經(jīng)MH孵育的CHO細胞電生理變化,選用利多卡因作為陽性對照化合物,檢測其對Nav1.8電流的抑制率。

2 結(jié) 果

2.1 蛋白免疫印跡試驗

建模后第21和28天,與P組相比,手術(shù)各組大鼠DRG中Nav1.8的表達均提高,未用藥的M組Nav1.8表達最多。用藥各組DRG中Nav1.8表達量依次為MH組、L組、A組。用藥各組與M組比較,Nav1.8表達量均顯著降低(圖1和圖2,P<0.05)。N組與P組比,差異不顯著(圖1和2,P>0.05)。

A. Nav1.8表達量;B.灰度相對值分組介紹: N. 正常對照組; P. 假手術(shù)組; M. 模型對照組; MH. 1-甲基海因組; A. 氨溴索組; L. 利多卡因組,各組均與N組比較,*. P<0.05;用藥組與M組比較,#. P<0.05A. Expression of Nav1.8; B. Relative grayscale Group introduction: N. Normal control group; P. Sham surgery group; M. Model control group; MH. 1-methylhyne group; A. Ambroxol group; L. Lidocaine group, all groups were compared with group N, *. P<0.05; The treatment groups compared with group M, #. P<0.05圖1 第21天大鼠DRG中Nav1.8的表達量及灰度相對值Fig.1 The expression of Nav1.8 and relative brightness DRG of rats on the 21st day

A. Nav1.8表達量;B.灰度相對值分組介紹: N. 正常對照組; P. 假手術(shù)組; M. 模型對照組; MH. 1-甲基海因組; A. 氨溴索組; L. 利多卡因組,各組均與N組比較,*. P<0.05;用藥組與M組比較,#. P<0.05A.Expression of Nav1.8; B.Relative brightness Group introduction: N. Normal control group; P. Sham surgery group; M. Model control group; MH. 1-methylhyne group; A. Ambroxol group; L. Lidocaine group, all groups were compared with group N, *. P<0.05; The treatment groups compared with group M, #. P<0.05圖2 第28天大鼠DRG中Nav1.8的表達量及灰度相對值Fig.2 The expression of Nav1.8 and relative brightness DRG of rats on the 28th day

2.2 全細胞膜片鉗技術(shù)檢測

10和100 μmol·L-1MH對Nav1.8的電流抑制率分別為6.34%±3.13%和14.6%±1.52%,陽性對照化合物100 μmol·L-1利多卡因?qū)av1.8的抑制率為57.2%±2.23%(圖3和4),因此抑制Nav1.8通道電流抑制強度依次為100 μmol·L-1利多卡因、100 μmol·L-1MH、10 μmol·L-1MH。

Control為正常外液記錄的電流,然后依次灌流10、100 μmol·L-1 MH,洗脫后給予100 μmol·L-1利多卡因Control was the current recorded from the normal external fluid, and then 10 and 100 μmol·L-1 MH were successively perfused, and 100 μmol·L-1 lidocaine was administered after elution圖3 抑制Nav1.8通道電流圖Fig.3 Pattern of inhibition of current of Nav1.8 channel

3 討 論

本試驗通過MH和Nav1.8調(diào)節(jié)劑干預大鼠慢性疼痛后脊髓背根神經(jīng)節(jié)的變化,使用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測大鼠L4～L6 段DRG中Nav1.8的蛋白表達,采用全細胞膜片鉗技術(shù)檢測MH作用下的Nav1.8通道峰電流,初步探究MH對慢性疼痛大鼠Nav1.8的作用。

疼痛造成了動物DRG中Nav1.8蛋白表達量上調(diào),可能是因為慢性疼痛造成DRG中傳入感覺神經(jīng)元上的Nav1.8表達增加,但隨著時間推移,機體自身免疫系統(tǒng)參與抗炎,炎癥減輕,蛋白表達下降[15-17]。

鈉離子通道結(jié)構(gòu)和功能的改變影響疼痛轉(zhuǎn)歸過程,利多卡因通過調(diào)節(jié)鈉離子通道狀態(tài)而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果,MH和利多卡因均抑制了Nav1.8的活性,表明這兩種化合物的鎮(zhèn)痛機制可能涉及鈉離子通道,也說明抑制Nav1.8可能與鎮(zhèn)痛反應有關(guān),但也可能涉及多種復雜機制。本試驗測得氨溴索抑制Nav1.8蛋白表達的效果強于利多卡因,但鎮(zhèn)痛效果則是利多卡因最佳,其原因可能是氨溴索是Nav1.8高選擇性阻滯劑,而造成疼痛的機制復雜,抑制Nav1.8的表達只是其中的一個通道,利多卡因還可拮抗其它通道如Nav1.9的表達而起到更好的鎮(zhèn)痛效果[18]。

神經(jīng)或組織損傷后,Nav1.8直接參與DRG神經(jīng)元異常電活動,產(chǎn)生異常的鈉離子電流,這可能是因為吸引交感神經(jīng)纖維包裹成籃狀結(jié)構(gòu),繼續(xù)產(chǎn)生異常的細胞膜電位[19]。MH對Nav1.8通道電流具有抑制作用,且呈現(xiàn)濃度依賴性。將暴露于100 μmol·L-1MH的CHO細胞洗脫,該細胞的Nav1.8通道幾乎可以從失活狀態(tài)恢復到靜息狀態(tài),說明100 μmol·L-1MH對Nav1.8的抑制作用基本可逆。相較于100 μmol·L-1酚那酸類藥物作用于CHO細胞洗脫后,CHO細胞的Nav1.8通道難以從失活狀態(tài)恢復到靜息狀態(tài),抑制作用不完全可逆[20]。證明了在用藥后MH對Nav1.8通道電流具有抑制作用,且基本不影響疼痛恢復期Nav1.8的功能,說明MH在治療慢性疼痛過程中的安全性。

目前,已有Nav1.8阻滯劑進入臨床試驗,但數(shù)量十分有限。本研究證明,當濃度從10 μmol·L-1升至100 μmol·L-1,MH對Nav1.8抑制率僅從6.34%±3.13%增長到14.6%±1.52%,表明MH對 Nav1.8抑制效果較弱,但由于MH結(jié)構(gòu)簡單,廉價易得,通過結(jié)構(gòu)改造或修飾可以克服現(xiàn)有不足,因此仍然具有成為動物鎮(zhèn)痛藥物的潛力。目前,已確定磺胺類鎮(zhèn)痛藥與鈉離子通道蛋白的結(jié)合位點,并且與經(jīng)典的小分子鈉通道阻滯藥如利多卡因等物不同,后者作用于鈉離子通道的孔隙區(qū)域,所以通常對不同的鈉通道亞型選擇性很小,故后續(xù)可能通過利用磺胺類化合物的高特異性結(jié)合位點,對海因類化合物類鎮(zhèn)痛藥進行篩選設(shè)計和改造。

本試驗對1-甲基海因治療大鼠CCI模型致慢性疼痛的進行了初步研究,發(fā)現(xiàn)MH可以抑制Nav1.8蛋白表達,同時抑制鈉離子電流。但本研究具有一定的局限性,Nav通道各亞型之間具有高度相似性[21],后續(xù)可檢測模型動物DRG中Nav1.8基因的表達情況,分析MH對其余鈉通道亞型的阻滯作用和選擇性,為后期基于MH結(jié)構(gòu)進行改造或修飾,從而進一步研發(fā)出特異性高、副作用少的新型鎮(zhèn)痛藥提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

MH通過下調(diào)慢性疼痛大鼠DRG中Nav1.8的表達,同時抑制Nav1.8通道電流,進而產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛作用,故MH具有成為動物鎮(zhèn)痛藥物的潛力,本試驗為臨床科學治療慢性疼痛和基于MH進行動物專用新型鎮(zhèn)痛藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。