韓生義,李玲霞,李淑萍,胡國(guó)元,李生慶*

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,西寧 810003;2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院,西寧 810003;3.青海省動(dòng)物疫病病原診斷與綠色防控技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810003)

沙門菌病是一種人獸共患傳染病,沙門菌感染人和動(dòng)物后能引起胃腸炎,傷寒及副傷寒甚至死亡等,不僅給全球養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失,還能通過動(dòng)物產(chǎn)品污染對(duì)人類的生命健康造成嚴(yán)重威脅[1-2]。近年來,隨著沙門菌的多重耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)峻和國(guó)家提倡的養(yǎng)殖業(yè)“替抗減抗”政策的不斷推行,抗生素替代技術(shù)的開發(fā)研究顯得日益緊迫,噬菌體作為抗生素替代物在預(yù)防和治療細(xì)菌感染方面具有無限應(yīng)用潛力而受到越來越多的關(guān)注[3]。噬菌體在自然界中種類繁多、數(shù)量巨大,不僅易從各種環(huán)境中分離得到,還能特異性裂解多重耐藥病原菌且不破壞環(huán)境中其它正常菌群[4-5]。目前,噬菌體在醫(yī)療、食品加工和畜牧養(yǎng)殖等很多行業(yè)得到應(yīng)用,如美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)已批準(zhǔn)噬菌體可作為食品添加劑用于控制食品加工過程中單核細(xì)胞增生李斯特菌和O157:H7大腸桿菌的污染[6-7]。本研究分離了1株烈性沙門菌噬菌體SP3,對(duì)其形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特性和基因組特點(diǎn)及遺傳進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析,為噬菌體預(yù)防和治療沙門菌感染提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

試驗(yàn)涉及的18株沙門菌和8株大腸桿菌來源于本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定與保存。

1.2 主要試劑

400目銅網(wǎng)購(gòu)自北京中鏡科儀技術(shù)有限公司;1%磷鎢酸溶液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;0.22 μm濾器購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;LB培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司;Tris-平衡酚購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

SM 緩沖液:0.01%明膠,100 mmol·L-1NaCl, 10 mmol·L-1MgSO4, 500 mmol·L-1Tris/HCl,pH=7.0。

1.3 噬菌體的分離篩選

1.3.1 樣品采集和處理 從西寧市奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)附近采集污水樣品500 mL,室溫靜置6 h,收集上層液體,加入CaCl2至終濃度為1 mol·L-1,5 000 r·min-1離心10 min,取上清液100 mL用0.22 μm濾器過濾除菌,得到濾液。

1.3.2 分離與純化 取10 mL的濾液與100 mL沙門菌液混合后于恒溫?fù)u床37 ℃培養(yǎng)12 h;次日離心后取100 μL上清液與等量沙門菌液混合孵育10 min,倒置雙層平板后37 ℃過夜培養(yǎng),次日觀察是否出現(xiàn)噬菌斑。用無菌巴氏吸管挑取單個(gè)噬菌斑,放入SM緩沖液中室溫解離4 h,取100 μL解離液與沙門菌菌液混合,通過雙層平板法進(jìn)行4～5次純化。

1.3.3 濃縮與超速離心 用PEG8000和NaCl對(duì)純化的噬菌體進(jìn)行濃縮,操作方法見參考文獻(xiàn)[8];對(duì)濃縮后的噬菌體進(jìn)行超離,步驟如下:SM緩沖液配制密度分別為ρ= 1.45、1.50和1.70 g·mL-1的氯化銫溶液,并在濃縮的噬菌體液中加入氯化銫至終濃度為1.15 g·mL-1,每支離心管中依次加入2 mL的不同濃度的氯化銫溶液,再加入6 mL已加氯化銫的噬菌體濃縮液,在4 ℃和25 000 r·min-1離心4 h,離心結(jié)束后吸取噬菌體層,4 ℃保存。

1.4 噬菌體的電鏡觀察

吸取 5 μL效價(jià)為109～1010PFU·mL-1的超離的噬菌體液輕輕滴加在銅網(wǎng)的碳涂層面,在室溫下靜置10 min,用干凈濾紙吸干銅網(wǎng)上的液體,然后再滴加5 μL 的1%磷鎢酸溶液負(fù)染2 min,用干凈濾紙吸干銅網(wǎng)上殘余的染液,用透射電鏡觀察噬菌體形態(tài)并拍照。

1.5 噬菌體的生物學(xué)特性研究

1.5.1 宿主譜 以雙層平板法測(cè)定噬菌體對(duì)18株多重耐藥性沙門菌和8株不同血清型的大腸桿菌的宿主譜,具體試驗(yàn)方法見“1.3.2”,以沙門菌QH為指示菌,計(jì)算成斑率(EOP)。

成斑率(EOP)=噬菌體對(duì)不同測(cè)試菌株的裂解效價(jià)/噬菌體對(duì)指示菌的裂解效價(jià)

1.5.2 一步生長(zhǎng)曲線 按參考文獻(xiàn)方法[9]進(jìn)行試驗(yàn),具體如下:沙門菌 QH(OD600 nm=0.6)的培養(yǎng)液中,以感染復(fù)數(shù)為0.01加入噬菌體,繼續(xù)37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)8 h,每隔一定時(shí)間取培養(yǎng)液100 μL在離心機(jī)中12 000 r·min-1離心10 min,取上清液與等體積的沙門菌QH液混合,37 ℃孵育10 min,倒置雙層平板,培養(yǎng)箱中37 ℃過夜培養(yǎng),次日計(jì)數(shù)雙層平板上的噬菌斑,試驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算出不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)液中的噬菌體效價(jià)。

1.5.3 最佳感染復(fù)數(shù) 將噬菌體按照不同的感染復(fù)數(shù)(MOI =10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、1、10、102、103、104、105和106)與等體積的沙門菌QH菌液混合,37 ℃孵育10 min,8 000 r·min-1離心10 min,除去上清液中未吸附的游離噬菌體,將所得的沉淀加入10 mL的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃ 200 r·min-1培養(yǎng)4 h, 再取培養(yǎng)液通過雙層平板法測(cè)定噬菌體的效價(jià),試驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算出不同感染復(fù)數(shù)下的噬菌體效價(jià),并確定噬菌體的最佳MOI。

1.5.4 pH穩(wěn)定性 使用濃鹽酸或氫氧化鈉溶液將SM緩沖液調(diào)整至pH為2～13,取100 μL噬菌體置于900 μL的不同pH的SM緩沖液中,37 ℃靜置2 h后,通過雙層平板法測(cè)定不同pH條件下噬菌體在沙門菌QH中的效價(jià)。

1.5.5 溫度穩(wěn)定性 取噬菌體液100 μL在10、20、30、40、50、60、70和80 ℃條件下,靜置2 h,利用雙層平板法測(cè)定噬菌體在沙門菌QH中的效價(jià)。

1.5.6 噬菌體對(duì)不同血清學(xué)沙門菌的抑菌能力和耐受菌檢測(cè) 為研究噬菌體對(duì)不同血清型沙門菌的抑菌能力,參照文獻(xiàn)方法[10]進(jìn)行試驗(yàn):將培養(yǎng)至穩(wěn)定期(OD600 nm約為1.0)的3株沙門菌液(丙型副傷寒沙門菌QH,腸炎沙門菌GN19和鼠傷寒沙門菌YS01)分為兩組,其中試驗(yàn)組按MOI=0.01接種噬菌體SP3,對(duì)照組不做任何處理,兩組菌液37 ℃和200 r·min-1持續(xù)培養(yǎng)12 h,從0 h開始每隔1 h取樣,采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定培養(yǎng)液中沙門菌的濃度,測(cè)定重復(fù)3次。

通過次級(jí)感染試驗(yàn)[8]檢測(cè)是否出現(xiàn)噬菌體耐受株,具體如下:將上述試驗(yàn)組菌液持續(xù)培養(yǎng)至24 h,取培養(yǎng)液在LB平板上劃線,并37 ℃過夜培養(yǎng), 次日挑選若干單菌落分別接種到LB液體培養(yǎng)基,在37 ℃,200 r·min-1培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后,通過雙層平板法檢測(cè)各菌株是否對(duì)噬菌體SP3耐受。

1.6 噬菌體基因組的提取和測(cè)序

1.6.1 基因組提取 噬菌體基因組提取參考文獻(xiàn)[8],具體操作如下:在超離的噬菌體液中加入DNase Ⅰ和RNase Ⅰ至終濃度為1 μg·mL-1,37 ℃作用30 min;再加入蛋白酶K和SDS分別至終濃度為50 μg·mL-1和0.5%,混勻后56 ℃水浴1 h;加入等體積的Tris-平衡酚后混勻;12 000 r·min-1,4 ℃離心10 min;吸取上清液并加入等體積的Tris-平衡酚,再次抽提;在上清液中加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)混勻后,12 000 r·min-1,4 ℃離心10 min;收集上清液,加入2倍體積的無水乙醇,4 ℃靜置30 min;12 000 r·min-1,4 ℃離心10 min;棄上清,打開管蓋,至乙醇完全揮發(fā);加入50～100 μL的TE緩沖液溶解噬菌體基因組;-20 ℃保存。

1.6.2 全基因組測(cè)序和生物信息學(xué)分析 將提取的噬菌體基因組送至廣東惠通生物科技有限公司,通過Illumina HiSeq 2500平臺(tái)進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序,并對(duì)基因組進(jìn)行拼接,得到完整的基因序列。應(yīng)用EditSeq對(duì)全基因組組分分析;采用tRNAscan-SE預(yù)測(cè)全基因組中的tRNA; 使用ORF finder預(yù)測(cè)噬菌體的ORF,用Smart Blast對(duì)預(yù)測(cè)的ORF進(jìn)行驗(yàn)證并注釋,進(jìn)行序列相似性及編碼基因的注釋;通過VFDB和CARD分別預(yù)測(cè)毒力和耐藥基因;最后將基因組上傳至NCBI獲得序列號(hào)。選擇噬菌體的末端大亞基酶、主要衣殼蛋白和尾纖絲蛋白基因序列在NCBI進(jìn)行比對(duì),并下載同源性較高的序列,用MEGA7.0中的Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹;將噬菌體SP3基因組在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì),下載同源性最高的10條噬菌體基因組,用BRIG和Artemis Comparison Tool進(jìn)行基因組比較分析和可視化。

2 結(jié) 果

2.1 噬菌體的分離篩選及形態(tài)學(xué)觀察

通過雙層平板法從樣品中分離出1株以丙型副傷寒沙門菌QH為宿主的噬菌體,并命名為SP3。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)噬菌體SP3頭部為正多面體,平均直徑為70 nm;有一條長(zhǎng)而收縮的尾巴,尾巴平均長(zhǎng)度為130 nm (圖1)。

圖1 噬菌體SP3電鏡下的形態(tài)特征Fig.1 Transmission electron micrograph of phages SP3

2.2 噬菌體的生物學(xué)特性

利用實(shí)驗(yàn)室保存的18株沙門菌和8株大腸桿菌對(duì)噬菌體SP3進(jìn)行宿主譜鑒定發(fā)現(xiàn),SP3能裂解3種不同血清型共8株沙門菌(包括4株鼠傷寒沙門菌、對(duì)3株腸炎沙門菌和1株丙型副傷寒沙門菌),對(duì)不同血清型沙門菌的EOP由高到低依次為丙型副傷寒沙門菌、腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌,但不能裂解大腸桿菌,詳見表1。

一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果表明,噬菌體SP3的潛伏期約為40 min,而爆發(fā)期為40～160 min (圖2a),此時(shí)噬菌體的效價(jià)可達(dá)5.5×108PFU·mL-1,而感染初期宿主菌QH的含量為5.0×106CFU·mL-1,計(jì)算得知噬菌體SP3的爆發(fā)量為110 PFU·cell-1;將噬菌體SP3與宿主菌QH按不同的MOI混合后測(cè)定效價(jià)發(fā)現(xiàn),SP3最佳MOI為0.000 1 (圖2b);pH耐受性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在pH 4.0～11.0時(shí),噬菌體SP3的效價(jià)無明顯變化,但當(dāng)pH>11或<4時(shí)噬菌體活性快速下降直至完全失活,表明SP3對(duì)堿性環(huán)境的耐受性較強(qiáng),但對(duì)酸性環(huán)境的耐受性較弱(圖2c);噬菌體SP3經(jīng)20～50 ℃水浴處理2 h后,效價(jià)無顯著變化,但隨著溫度的逐漸升高,效價(jià)急劇下降,70 ℃時(shí)大部分失活,80 ℃時(shí)完全失活(圖2d)。

a. 一步生長(zhǎng)曲線;b. 感染復(fù)數(shù);c. pH耐受性;d. 溫度耐受性A. One step growth curve;b. Multiplicity of infection;c. The pH stability; d. The temperature stability圖2 噬菌體SP3的部分生物學(xué)特性Fig.2 Partial biological characteristics of bacteriophage SP3

抑菌能力試驗(yàn)表明,在丙型副傷寒沙門菌QH、腸炎沙門菌GN19和鼠傷寒沙門菌YS01中加入噬菌體SP3后,上述3種沙門菌液中的活菌量持續(xù)下降,分別于5、5和7 h時(shí)達(dá)到最低(圖3),表明噬菌體SP3對(duì)不同血清型沙門菌的抑菌效果存在差異;次級(jí)感染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),噬菌體SP3與上述3株不同血清型沙門菌持續(xù)共培養(yǎng)24 h后,再次分離的菌株與噬菌體SP3互作后,通過雙層平板法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)均無噬菌斑出現(xiàn),表明上述3種不同血清型沙門菌與噬菌體SP3長(zhǎng)期互作后,均能產(chǎn)生耐受性。

a.噬菌體SP3對(duì)丙型副傷寒沙門菌QH的抑菌效果;b.噬菌體SP3對(duì)腸炎沙門菌GN19的抑菌效果;c.噬菌體SP3對(duì)鼠傷寒沙門菌YS01的抑菌效果A. The antibacterial effect of phage SP3 on Salmonella paratyphoid C QH strain; b. The antibacterial effect of phage SP3 on Salmonella enteritis strain GN19; c. The antibacterial effect of phage SP3 on Salmonella typhimurium strain YS01圖3 噬菌體SP3的抑菌效果Fig.3 The antibacterial effect of phage SP3

2.3 噬菌體的基因組分析

噬菌體SP3的基因組(MW296 865.1)大小為88 039 bp,GC%為38.85%,共有130個(gè)開放閱讀框(ORF),編碼基因全長(zhǎng)77 746 bp,基因平均長(zhǎng)度為698 bp,編碼基因共占比88.31%;其中大部分編碼功能未知的假定蛋白,僅32個(gè)ORFs與已知的功能基因有較高的相似性,包括噬菌體結(jié)構(gòu)基因、DNA復(fù)制和細(xì)菌裂解相關(guān)酶的編碼基因等,未發(fā)現(xiàn)編碼整合酶、切除酶或阻遏物等與溶原有關(guān)的基因,表明是一株烈性噬菌體;SP3基因組含有22個(gè)編碼tRNA的序列,轉(zhuǎn)運(yùn)包括Pro(脯氨酸)、Glu(谷氨酸)、Asn(天冬酰胺)、Tyr(酪氨酸)、Asp(天冬氨酸)、Lys(賴氨酸)、Met(甲硫氨酸)、Ile(異亮氨酸)、Arg(精氨酸)、Leu(亮氨酸)、Ala(丙氨酸)、Gly(甘氨酸)、Thr(蘇氨酸)、Val(纈氨酸)、Gln(谷氨酰胺)、His(組氨酸)和Phe(苯丙氨酸)在內(nèi)的共17種氨基酸。

基于主要衣殼蛋白構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明,噬菌體SP3與大腸桿菌噬菌體SP22(LC519 489.1,日本)和沙門菌噬菌體S19cd(MZ150 758.1,中國(guó))位于同一進(jìn)化分支(圖4);基于末端酶大亞基構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明,噬菌體SP3與大腸桿菌噬菌體SEM50(MT887 289.1,韓國(guó))、大腸桿菌噬菌體vB EcoM Shy(MT833 282.1,葡萄牙)、大腸桿菌噬菌體JN01(MN882 542.1,中國(guó))、大腸桿菌噬菌體PHB11(MK524 176.1,中國(guó))以及沙門噬菌體vB SalM SPJ41(ON868 915.1,中國(guó))位于同一進(jìn)化分支(圖5);根據(jù)ICTV(https://ictv.global/taxonomy)的最新分類標(biāo)準(zhǔn)發(fā)現(xiàn),噬菌體SP3與上述位于同一分支的其它噬菌體均屬于Duplodnaviria圈、Heunggongvirae界、Uroviricota門、Caudoviricetes綱、Ounavirinae亞目、Felixounavirus屬;對(duì)SP3的尾纖絲蛋白Blastbn比對(duì)發(fā)現(xiàn),與大腸桿菌噬菌體humlepung(MN850 564.1)和nataliec(MN850 611.1)的相似性最高,與二者的覆蓋度(cover)分別為51%和63%,序列比對(duì)的一致度(Per ident)分別為88.97% 和98.31%;同時(shí)基于尾纖絲蛋白構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明,噬菌體SP3與humlepung和nataliec(MN850 611.1)位于同一進(jìn)化分支(圖6),與其它沙門菌噬菌體的尾纖絲蛋白遺傳進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。

圖4 基于主要衣殼蛋白構(gòu)建的進(jìn)化樹Fig.4 The evolutionary tree base on major capsid protein

圖5 基于末端酶的大亞基構(gòu)建的進(jìn)化樹Fig.5 The evolutionary tree based on large subunit of the large subunit of terminal enzyme

圖6 基于尾部纖絲蛋白構(gòu)建的進(jìn)化樹Fig.6 The evolutionary tree based on large subunit of the tail fiber protein

將SP3基因組在NCBI中Blastn得到10條相似性最高的噬菌體基因組中,6條為大腸桿菌噬菌體(MT833 282.1、NC_027 369.1、MN882 542.1、MK524 176.1、OQ174 507.1和OL825 705.1),3條為沙門菌噬菌體(MN227 145.1、MZ150 758.1和OL656 108.1),1條為志賀菌噬菌體(MN655 999.1)。以噬菌體SP3為參考基因組,通過BRIG與上述10條基因組進(jìn)行比對(duì)和可視化發(fā)現(xiàn)(圖7),11株噬菌體的大部分基因(尤其是已知的功能基因)同源性很高,僅少部分基因同源性很低,這些基因主要分布在基因組6個(gè)區(qū)域,且大部分基因編碼功能未知的假定蛋白;其中,Region 1包括ORF 14-18,Region 2包括ORF 45-52,Region 3包括ORF 68和69,Region 4包括ORF 83、84、86和87,Region 5包括ORF 99-101,Region 6包括ORF129;對(duì)以上區(qū)域中基因編碼的蛋白序列進(jìn)一步的blastp發(fā)現(xiàn),僅部分ORF編碼蛋白與已知的功能蛋白具有較高的相似性,如ORF 69與Escherichiaphage EC6中g(shù)p128有較高相似性(92.80%),ORF 83與Escherichiaphage EC6中g(shù)p006有較高相似性(97.30%),ORF101與Escherichiaphage EC6中g(shù)p024有較高相似性(86.25%),而ORF129與Escherichiaphage nataliec編碼的tail fibers protein有較高相似性(73.29%)。

由內(nèi)向外依次為(from inside to outside):Escherichia coli phage vB-EcoM-Shy(MT833282.1)、Escherichia phage EC6(NC_027369.1)、Escherichia phage JN01(MN882542.1)、Escherichia phage PHB11(MK524176.1)、Escherichia phage REP8(OQ174507.1)、Escherichia phage vB-EcoM-DE7(OL825705.1)、Salmonella phage BPSELC-1(MN227145.1)、Salmonella phage S19cd(MZ150758.1)、Salmonella phage UAB-69(OL656108.1)、Shigella phage-Z31(MN655999.1)圖7 沙門菌噬菌體SP3基因組和10條噬菌體的全基因組比對(duì)Fig.7 The genome comparison between the Salmonella phage SP3 and 10 phages

選取相似性最高的Escherichiaphage JN01(MN882 542.1)和Salmonellaphage S19cd(MZ150 758.1)與SP3進(jìn)行基因組共線性分析發(fā)現(xiàn),噬菌體SP3基因組上主要的模塊區(qū)域(藍(lán)、橙和綠色區(qū)域)相似性很高,而且這3個(gè)區(qū)域含有的基因也相同或高度相似,表明噬菌體SP3基因組有重排現(xiàn)象發(fā)生(圖8)。

圖8 噬菌體基因組的共線性分析Fig.8 The Genome collinearity analysis of phage genomes

3 討 論

在本研究中分離了一株烈性沙門菌噬菌體SP3,該噬菌體具有較寬的宿主譜和較強(qiáng)的pH和溫度耐受性。pH和溫度耐受范圍與芩鑫等[11]分離的沙門菌噬菌體S5接近,能在pH4～11和10～50 ℃保持高活性;噬菌體SP3的潛伏期(40 min)比噬菌體L6jm(15 min)[12]、KM104(6 min)[13]、S5(5 min)[11]和PEA2-3(20 min)[14]更長(zhǎng),但其爆發(fā)期(120 min)比KM104(62 min)、S5(90 min)和PEA2-3(80 min)更長(zhǎng),與L6jm(120 min)相同;此外沙門菌噬菌體SP3的爆發(fā)量較高,高于噬菌體JN-S202001(67 PFU/cell)[15]、v B_EcoS_AH50(67 PFU·cell-1)[16]、vB_CpeS_SD72(28.5 PFU·cell-1)[17]和PSM6(56 PFU·cell-1)[18],與vB_EcoM_F2(101 PFU·cell-1)[19]接近,低于SJT-90(141 PFU·cell-1)[20]和vB_EcoM_GXBP08(154 PFU·cell-1)[21];其最佳MOI為0.000 1,低于L6jm(0.01)、KM104(0.1)和PEA2-3(0.01);噬菌體SP3的體外抑菌能力與喻勝孟[22]報(bào)道的大腸桿菌噬菌體相似,即在0～1 h內(nèi)抑菌效果較弱,1～6 h內(nèi)抑菌效果不斷增強(qiáng),6～7 h內(nèi)抑菌效果達(dá)到最強(qiáng),隨后抑菌效果迅速下降,菌液中活菌數(shù)量不斷增加。研究發(fā)現(xiàn)噬菌體與細(xì)菌在長(zhǎng)期互作過程中,細(xì)菌可以通過多種防御性機(jī)制獲得對(duì)噬菌體的抗性,如大腸桿菌即可以通過群體感應(yīng)系統(tǒng)下調(diào)菌體表面受體數(shù)量來阻止噬菌體的吸附[23],也可以通過外膜囊泡中和噬菌體的感染[24];銅綠假單胞菌可在群體感應(yīng)系統(tǒng)和CRISPR-Cas系統(tǒng)的共同作用下提高對(duì)噬菌體的耐受[25];此外,受體合成相關(guān)基因的缺失或突變也會(huì)導(dǎo)致噬菌體感染失敗,如通過自然突變出現(xiàn)的銅綠假單胞菌PA1突變株基因組缺失了galU基因后,使得突變株丟失作為噬菌體受體的O抗原而獲得耐受性[26];而對(duì)噬菌體耐受的鼠傷寒沙門菌突變株的研究發(fā)現(xiàn),與毒力和脂多糖合成的相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生了下調(diào)后,導(dǎo)致噬菌體對(duì)該突變株的吸附率急劇下降[27]。以上研究表明,噬菌體與細(xì)菌在互作的過程中,宿主細(xì)菌很容易通過各種機(jī)制產(chǎn)生對(duì)噬菌體的抗性,而此類難題的解決方式之一就是通過多種噬菌體配制噬菌體雞尾酒來防止耐受菌的產(chǎn)生,如包紅朵等[28]研究發(fā)現(xiàn)由多株噬菌體制備的雞尾酒JS-SP1對(duì)6種不同血清型的沙門菌的抑菌效果明顯優(yōu)于單株噬菌體組。噬菌體SP3的環(huán)境耐受力強(qiáng)特點(diǎn)可以使其在胃腸道和高溫等不良環(huán)境中保持高活性,其較低的感染復(fù)數(shù)有助于降低生產(chǎn)成本,而較長(zhǎng)的爆發(fā)期和高爆發(fā)量的特點(diǎn)可以用于在短時(shí)間內(nèi)殺死大量的沙門菌,但也存在著長(zhǎng)期互作后宿主菌易產(chǎn)生耐受性等缺點(diǎn),因此可以合理通過與其它噬菌體配制雞尾酒等方式解決這一弊端,才能充分發(fā)揮其在環(huán)境消毒和臨床治療等方面的應(yīng)用潛力。

在細(xì)菌多重耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重和國(guó)家提倡全面禁抗的背景下,噬菌體療法作為一種“替抗”的綠色防治技術(shù),具有易獲得、宿主譜窄、環(huán)境耐受力強(qiáng)、可殺滅多重耐藥菌、治療所需劑量小和安全無副作用等優(yōu)點(diǎn)[29]。然而用于實(shí)際生產(chǎn)中的噬菌體不僅需要爆發(fā)量大和裂解力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),還必須遺傳背景清楚,且不攜帶毒力、耐藥和溶源相關(guān)等不良基因[30]。通過對(duì)噬菌體SP3的全基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),SP3編碼的130個(gè)基因中,盡管大部分基因編碼功能未知的假定蛋白,但其不攜帶任何毒力、耐藥和溶原相關(guān)基因,此外SP3攜帶22個(gè)編碼tRNA的序列,研究發(fā)現(xiàn)噬菌體攜帶的tRNA能通過彌補(bǔ)宿主菌缺少的tRNA而提高裂解酶等蛋白的翻譯效率外;并且攜帶的tRNA越多,噬菌體的裂解性越強(qiáng),如烈性噬菌體就含有比溫和噬菌體更多的tRNA[31]。以上研究結(jié)果表明噬菌體SP3作為生物防治手段的安全性高,不會(huì)水平轉(zhuǎn)移有害基因。通過對(duì)噬菌體SP3的形態(tài)學(xué)觀察和基于兩種結(jié)構(gòu)蛋白(major capsid protein和large subunit terminase)的編碼基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明SP3是屬于Ounavirinae亞目、Felixounavirus屬,與已知的不同地理位置分離的沙門菌噬菌體和大腸桿菌噬菌體的親緣關(guān)系很近,具有共同的遺傳進(jìn)化起源;SP3與上述噬菌體的大部分編碼基因相似性很高,而包含部分結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因在內(nèi)的少數(shù)基因的低相似性是造成SP3與上述噬菌體進(jìn)化差異的主要因素。研究發(fā)現(xiàn),尾纖絲蛋白屬于受體結(jié)合蛋白(receptor binding protein, RBP),是噬菌體用于特異性識(shí)別和吸附宿主受體的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),直接決定著噬菌體的宿主范圍[32]。本研究中,由于實(shí)驗(yàn)室存儲(chǔ)和用于測(cè)試宿主譜的大腸桿菌菌株數(shù)量有限,噬菌體SP3雖然未能裂解8株大腸桿菌,但基于尾纖絲蛋白基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn),相比于其它沙門菌噬菌體,噬菌體SP3的尾纖絲蛋白與大腸桿菌噬菌體的親緣關(guān)系更近,表明SP3可能能裂解其它大腸桿菌菌株。噬菌體SP3與親緣關(guān)系最近的噬菌體基因組共線性比較發(fā)現(xiàn),多個(gè)具有相似或相關(guān)生物學(xué)功能的基因聚集并進(jìn)行重新排列,證實(shí)了基因組重排在不同噬菌體之間是非常普遍和共性的[33],而研究表明基因組重排與噬菌體經(jīng)歷過選擇壓力有關(guān)[34],以上說明噬菌體SP3在進(jìn)化過程中可能在選擇壓力作用下,通過復(fù)雜的基因水平轉(zhuǎn)移、突變和重組等演化而來。

4 結(jié) 論

分離出一株烈性沙門菌噬菌體SP3,具有對(duì)不良環(huán)境耐受力強(qiáng)、感染復(fù)數(shù)小、爆發(fā)量大且不攜帶任何有害基因等優(yōu)點(diǎn),在環(huán)境消殺和臨床治療等方面具有一定的應(yīng)用潛力。