李莉莉,陳凱風(fēng),陳 兵,周洲平,王南威,瞿孝云,徐成剛,廖 明,3,張建民*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省動(dòng)物源性人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,人獸共患病防控制劑國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,廣州 510642;2.深圳海關(guān)動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,深圳 518045;3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,廣州 510640)

沙門菌是一種廣泛流行的人畜共患病原菌,不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,同時(shí)也危害人類的健康[1]。而鼠傷寒沙門菌是沙門菌中最重要的血清型之一[2-4],也是目前我國(guó)流行率最廣的血清型之一[5],其具有較強(qiáng)的適應(yīng)性,不僅可以對(duì)抗生素及抑菌劑產(chǎn)生耐受性[6],而且可以抵抗宿主體內(nèi)的壓力,實(shí)現(xiàn)在宿主體內(nèi)的生存并增殖[7-8],使其在世界范圍內(nèi)廣泛傳播。據(jù)統(tǒng)計(jì)全球每年由鼠傷寒沙門菌感染引起的胃腸炎病例約有9 380萬(wàn)例,其中約有15萬(wàn)人死亡[9],同時(shí)在沙門菌導(dǎo)致的食物中毒病例中鼠傷寒占比16.81%[10]。因此,具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。故鼠傷寒沙門菌適應(yīng)性機(jī)制的揭示對(duì)于其防控至關(guān)重要。

研究發(fā)現(xiàn),細(xì)菌生物被膜的形成在其適應(yīng)性中發(fā)揮著重要作用[11],而生物被膜形成的關(guān)鍵是廣泛存在于細(xì)菌中的第二信使分子環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)[12]。c-di-GMP主要是由鳥苷酸環(huán)化酶(guanylate cyclase, DCGs)和磷酸二酯酶(phosphodiesterase, PDEs)分別合成與降解,而這兩種酶分別由高度保守的GGDEF與EAL結(jié)構(gòu)域組成[13]。目前在鼠傷寒沙門菌中共發(fā)現(xiàn)22個(gè)GGDEF與EAL結(jié)構(gòu)域相關(guān)基因,部分基因已被證明可以參與c-di-GMP代謝。如含有GGDEF結(jié)構(gòu)域的AdrA能夠通過(guò)調(diào)控胞外多糖的合成促進(jìn)細(xì)菌生物被膜的形成[14];含有EAL結(jié)構(gòu)域的STM1697基因,其缺失可以導(dǎo)致鼠傷寒沙門菌對(duì)細(xì)胞的侵襲與黏附能力增強(qiáng)[15];含有EAL結(jié)構(gòu)域的STM1344可以抑制鼠傷寒沙門菌的運(yùn)動(dòng)能力[16];具有PDE活性的YhjH可以促進(jìn)鼠傷寒沙門菌的運(yùn)動(dòng)[17]等,但仍有部分基因功能尚未深入研究。作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)室前期強(qiáng)生物被膜與弱生物被膜菌株轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)20個(gè)與c-di-GMP代謝相關(guān)基因發(fā)生差異表達(dá),其中STM1827作為含有EAL結(jié)構(gòu)域的假定基因,其在生物被膜與環(huán)境適應(yīng)性方面的具體調(diào)控作用尚不清楚。因此進(jìn)一步了解該基因的功能有助于闡明c-di-GMP在鼠傷寒沙門菌生物被膜形成中的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與揭示鼠傷寒沙門菌的適應(yīng)性機(jī)制。

基于此,本研究以STM1827為對(duì)象,通過(guò)基因缺失株與回補(bǔ)株,揭示STM1827在鼠傷寒沙門菌中對(duì)c-di-GMP水平、細(xì)菌生物被膜形成、運(yùn)動(dòng)性、環(huán)境應(yīng)激之間的調(diào)控作用,進(jìn)一步完善c-di-GMP在生物被膜形成中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),同時(shí)為沙門菌病的防控奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

鼠傷寒沙門菌WT269、質(zhì)粒pKD4、pKD46、pCP20及質(zhì)粒PBAD均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑、儀器

硫酸卡那霉素、氨芐青霉素、硫酸慶大霉素均購(gòu)自鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司;c-di-GMP含量 ELISA KIT試劑盒購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司;LB瓊脂、LB肉湯培養(yǎng)基均購(gòu)自環(huán)凱微生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)鼠傷寒沙門菌全基因組序列,使用Primer 5設(shè)計(jì)引物,引物STM1827-Red-F/R用來(lái)擴(kuò)增含有STM1827同源片段的卡那霉素抗性片段;引物STM1827-JD-F/R用于鑒定STM1827基因;引物STM1827-HF/HR用于STM1827基因擴(kuò)增;引物PBAD-F/R用于STM1827回補(bǔ)株的鑒定。具體引物信息見表1,所有的引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 PCR引物名稱及序列Table 1 PCR primer name and sequence

1.4 缺失株與回補(bǔ)株的構(gòu)建

根據(jù)Red同源重組方法[18]構(gòu)建STM1827基因缺失株。利用引物STM1827-Red-F/R擴(kuò)增質(zhì)粒pKD4上的卡那霉素基因片段,后將擴(kuò)增片段進(jìn)行膠回收。將回收的STM1827基因打靶片段電轉(zhuǎn)化入含有質(zhì)粒pKD46并已誘導(dǎo)表達(dá)的親本株WT269感受態(tài)細(xì)胞中,后將其復(fù)蘇涂布含有卡那霉素平板,培養(yǎng)過(guò)夜,挑取單菌落搖菌,經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的菌液涂布于含有卡那霉素平板于42 ℃消除質(zhì)粒pKD46,利用引物pKD46-JD-F/R鑒定質(zhì)粒pKD46消除。通過(guò)質(zhì)粒pCP20去除卡那霉素抗性片段,同樣經(jīng)熱激消除質(zhì)粒pCP20,最后將鑒定正確的STM1827基因缺失株命名為269ΔSTM1827。

利用質(zhì)粒PBAD構(gòu)建STM1827克隆載體,繼而電轉(zhuǎn)入菌株269ΔSTM1827感受態(tài)細(xì)胞中,利用引物PBAD-F/R進(jìn)行PCR鑒定,將鑒定正確的菌株命名為269ΔSTM1827R,即為回補(bǔ)株。

1.5 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

挑取WT269、269ΔSTM1827、269ΔSTM1827R單菌落至LB肉湯中培養(yǎng)過(guò)夜,次日將菌液稀釋到的LB肉湯中并調(diào)整OD600 nm至0.1,37 ℃,200 r·min-1連續(xù)培養(yǎng)20 h,每隔1 h測(cè)其OD600 nm,繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

1.6 c-di-GMP含量的測(cè)定

挑取單菌落至LB肉湯中培養(yǎng)過(guò)夜,次日將菌液稀釋至LB肉湯中培養(yǎng),將菌液離心棄上清,PBS洗滌3次并將其破碎,破碎的菌體離心2 min,棄其上清并用PBS洗滌菌體一次,隨后離心2 min棄上清。將沉淀用2 mL PBS重懸起來(lái),100 ℃水浴5 min,迅速加入冰乙醇,使得乙醇最終濃度為65%,萃取15 s,后離心2 min抽取上清液,即為樣品c-di-GMP。將提取好的樣品用c-di-GMP ELISA KIT試劑盒進(jìn)行含量測(cè)定,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品中c-di-GMP含量。

1.7 細(xì)菌生物被膜形成的測(cè)定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[19]的方法,挑取單菌落至LB肉湯中培養(yǎng)過(guò)夜,將菌液稀釋到無(wú)鹽LB肉湯中,取200 μL接種于96孔板,30 ℃,靜置培養(yǎng)48 h后棄去懸浮液,PBS洗滌3次,每孔加入200 μL的無(wú)水甲醇固定15 min,棄去液體并晾干。隨后每孔加入200 μL 1%的結(jié)晶紫溶液染色15 min,棄去未結(jié)合的染料,并用PBS洗滌3次,晾干后每孔加入200 μL 33%的乙酸溶解結(jié)晶紫,測(cè)量OD595 nm值。

1.8 多細(xì)胞行為表型的測(cè)定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[20]試驗(yàn)方法,挑取單菌落至LB肉湯中培養(yǎng)過(guò)夜,吸取10 μL菌液接種在含有剛果紅(40 mg·L-1)和考馬斯亮藍(lán)(20 mg·L-1)的無(wú)鹽LB平板上,28 ℃,培養(yǎng)5～6 d,觀察菌落的形態(tài)及與染料結(jié)合情況。

1.9 細(xì)菌胞外基質(zhì)成分的檢測(cè)

根據(jù)參考文獻(xiàn)[21]試驗(yàn)方法,挑取單菌落至LB肉湯中培養(yǎng)過(guò)夜,取10 μL菌液接種于無(wú)鹽LB瓊脂上,28 ℃靜置培養(yǎng)18 h,隨后用0.9%的氯化鈉溶液重懸菌體并最大速度離心10 min,收集上清液,在試管中加入上清液2.5倍體積的99%冰乙醇,最大速度離心20 min并棄去上清液,將所得到的顆粒在65 ℃過(guò)夜干燥后,用ddH2O重懸,最后用分光光度計(jì)檢測(cè)樣品中蛋白質(zhì)和DNA的濃度。對(duì)于胞外多糖含量的測(cè)定,首先制備濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1的葡萄糖溶液,隨后與5%的苯酚溶液混合,迅速加入硫酸試劑混勻,室溫下靜置10 min,置于65 ℃水浴18 min,取出后插于冰上冷卻至室溫,在OD490 nm處測(cè)量吸光值,繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)將菌體混懸液離心后收集的上清液10倍稀釋后與5%的苯酚溶液混合,迅速加入硫酸試劑混勻,室溫下靜置10 min,后置于65 ℃水浴18 min,取出并插于冰上至室溫。最后在OD490 nm處測(cè)量吸光值,同時(shí)根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線確定多糖濃度。

1.10 細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性的測(cè)定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[22]試驗(yàn)方法,挑取單菌落至LB肉湯中培養(yǎng)過(guò)夜,次日吸取10 μL菌液接種在0.5%的LB瓊脂上,置于37 ℃培養(yǎng)6 h,通過(guò)測(cè)量細(xì)菌在平板中的遷移所形成圓圈的直徑評(píng)估運(yùn)動(dòng)能力。

1.11 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平

根據(jù)Omega公司生產(chǎn)的細(xì)菌RNA提取試劑盒提取菌株的總RNA,利用試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以16S基因作為內(nèi)參,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)與細(xì)菌生物被膜形成相關(guān)基因CsgA、CsgB、BcsA、BcsB,及運(yùn)動(dòng)性相關(guān)基因FliA、FlhC、FlhD的轉(zhuǎn)錄水平(引物序列見表1)。反應(yīng)體系為cDNA模板1 μL,上下游引物各0.4 μL,2×ChamQ Universal SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL,去離子水8.2 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性 2 min;PCR 反應(yīng)階段:95 ℃ 15 s,58 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。采用比較周期閾值法(2-ΔΔCt法)分析基因表達(dá)水平。

1.12 環(huán)境應(yīng)激抵抗力的檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[19]試驗(yàn)方法,挑取單菌落至LB肉湯中培養(yǎng)過(guò)夜,次日將菌液離心棄去上清液,PBS洗滌3次,最后將沉淀的菌體用LB肉湯重懸起來(lái),隨后將其菌液分別加入至含有5 mmol·L-1H2O2、0.25% SDS消毒劑的LB肉湯中,連續(xù)培養(yǎng)10 h,每隔1 h測(cè)定OD600 nm值,并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.13 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用 GraphPad Prism 8.0.1 軟件中t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù),****.P<0.000 1;***.P<0.001;**.P<0.01;*.P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 STM1827基因缺失株與回補(bǔ)株的構(gòu)建

利用Red同源重組方法獲得基因缺失株269ΔSTM1827,以STM1827-JD-F/R為引物,PCR鑒定結(jié)果顯示(圖1A),野生株269擴(kuò)增條帶大小為2 383 bp,基因缺失株擴(kuò)增條帶約為679 bp,與預(yù)期結(jié)果相符,表明成功構(gòu)建缺失株,將其命名為269ΔSTM1827。

A. 269ΔSTM1827缺失株的鑒定(M. 5 000 bp DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. 野生株WT269;2. 缺失株269ΔSTM1827);B. 269ΔSTM1827R回補(bǔ)株的驗(yàn)證(M. 5 000 bp DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.質(zhì)粒PBAD;2. 回補(bǔ)株269ΔSTM1827R)A. Identification of the 269ΔSTM1827 mutant strain (M. 5 000 bp DNA relative molecular weight; 1. Wild strain WT269; 2. Missing strain 269ΔSTM1827);B. Identification of 269ΔSTM1827R compelement strain (M. 5 000 bp DNA relative molecular weight; 1. Plasmid PBAD; 2. Retrogression strain 269ΔSTM1827R)圖1 269ΔSTM1827缺失株與269ΔSTM1827R回補(bǔ)株的PCR鑒定Fig.1 Identification of 269ΔSTM1827 mutant strain and 269ΔSTM1827R complement strain by PCR

通過(guò)重組質(zhì)粒PBAD-STM1827構(gòu)建回補(bǔ)株,用引物PBAD-F/R為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示(圖1B),質(zhì)粒大小為381 bp,回補(bǔ)株出現(xiàn)2 208 bp,證明回補(bǔ)株構(gòu)建成功,將其命名為269ΔSTM1827R。

2.2 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

對(duì)野生株WT269、缺失株269ΔSTM1827、回補(bǔ)株269ΔSTM1827R培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)OD600nm進(jìn)行測(cè)定,繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果如圖2所示,野生株WT269與缺失株269ΔSTM1827的生長(zhǎng)速度基本一致,沒有明顯差異,回補(bǔ)株與野生株的生長(zhǎng)速度也沒有差異。

圖2 各菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of each strain

2.3 菌株c-di-GMP含量的測(cè)定

對(duì)野生株WT269、缺失株269ΔSTM1827、回補(bǔ)株269ΔSTM1827R的c-di-GMP含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖3所示,269ΔSTM1827中c-di-GMP的含量比野生株WT269中的c-di-GMP含量增加了33.16%,顯著升高(P<0.05)?；匮a(bǔ)株胞內(nèi)c-di-GMP的含量與野生株相比沒有差異(P>0.05)。

A. c-di-GMP標(biāo)準(zhǔn)曲線;B. c-di-GMP含量。ns. P>0.05, *. P<0.05A. c-di-GMP standard curve; B. c-di-GMP content. ns. P>0.05, *. P<0.05圖3 各菌株的c-di-GMP含量Fig.3 C-di-GMP content of each strain

2.4 菌株生物被膜形成能力檢測(cè)

通過(guò)結(jié)晶紫染色法測(cè)定細(xì)菌生物被膜形成能力。結(jié)果如圖4所示,與野生株WT269相比,缺失株269ΔSTM1827的生物被膜形成能力顯著增強(qiáng),上調(diào)2.19倍,回補(bǔ)株269ΔSTM1827R與野生株相比沒有差異(P>0.05)。

ns. P>0.05,****. P<0.000 1圖4 生物被膜形成Fig.4 Biofilm formation

2.5 菌株多細(xì)胞行為表型檢測(cè)

使用考馬斯亮藍(lán)與剛果紅平板對(duì)菌株的多細(xì)胞行為表型進(jìn)行鑒定。結(jié)果如圖5所示,與野生株WT269相比,269ΔSTM1827菌株在考馬斯亮藍(lán)和剛果紅平板上的菌落表面更加粗糙,褶皺更加明顯,顏色也相較野生株更加深。

圖5 多細(xì)胞行為表型Fig.5 Multicellular behavioral phenotypes

2.6 菌株生物被膜相關(guān)胞外基質(zhì)成分的檢測(cè)

對(duì)菌株胞外基質(zhì)成分進(jìn)行定量檢測(cè),結(jié)果如圖6所示。缺失株269ΔSTM1827胞外蛋白質(zhì)與胞外DNA含量與野生株WT269相比沒有明顯變化(P>0.05),而269ΔSTM1827菌株胞外多糖成分顯著增加(P<0.000 1),比親本株增加了1.3倍?；匮a(bǔ)株的胞外基質(zhì)成分含量與野生株相比沒有差異(P>0.05)。

A.胞外蛋白質(zhì);B. 胞外DNA;C. 胞外多糖;D. 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。ns. P>0.05,****. P<0.000 1A. Extracellular proteins; B. Extracellular DNA; C. Extracellular polysaccharide; D. Glucose standard curve. ns. P>0.05,****. P<0.000 1圖6 胞外基質(zhì)成分定量Fig.6 Extracellular matrix component quantification

2.7 菌株運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)

觀察菌株在0.5%半固體瓊脂板上形成的運(yùn)動(dòng)圈,結(jié)果如圖7所示。缺失株269ΔSTM1827在6 h時(shí)菌株的運(yùn)動(dòng)直徑明顯小于野生株WT269,下降13%?；匮a(bǔ)株的細(xì)菌運(yùn)動(dòng)直徑與野生株相比差異不顯著(P>0.05)。

ns. P>0.05, *. P<0.05圖7 運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)Fig.7 Motility assays

2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平

熒光定量檢測(cè)結(jié)果如圖8所示。與野生株WT269相比,缺失株269ΔSTM1827胞外多糖合成基因(BcsA、BcsB)、胞外蛋白質(zhì)合成基因(CsgA)的表達(dá)量都有增加,其中以BcsA和BcsB基因表達(dá)最為顯著(P<0.000 1),分別上調(diào)19倍與11倍,與前面胞外基質(zhì)定量成分中主要是胞外多糖含量增加的結(jié)果一致;同時(shí)運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因(FliA、FlhC)的表達(dá)量與野生株相比顯著下降,分別下降了20%與13%?；匮a(bǔ)株相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平與野生株相比差異不顯著(P>0.05)。

*. P<0.05,**. P<0.01,****. P<0.000 1圖8 生物被膜與運(yùn)動(dòng)性相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平Fig.8 Transcription levels of biofilm and motility related genes

2.9 環(huán)境應(yīng)激抵抗力的檢測(cè)

對(duì)在不同環(huán)境應(yīng)激條件下菌株的抵抗能力進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖9所示。在5 mmol·L-1H2O2的條件下培養(yǎng),與野生株WT269、回補(bǔ)株269ΔSTM1827R相比,缺失株269ΔSTM1827在5 h后細(xì)菌的生長(zhǎng)速度顯著加快(P<0.01)(圖9A);在SDS消毒劑條件下培養(yǎng),與野生株WT269、回補(bǔ)株269ΔSTM1827R相比,缺失株269ΔSTM1827在2 h后細(xì)菌的生長(zhǎng)速度下降程度明顯較慢(P<0.05)(圖9B)。

A.氧化應(yīng)激; B. 消毒劑應(yīng)激。*. P<0.05,**. P<0.01,****. P<0.000 1A. Oxidative stress;B. Disinfectant stress. *. P<0.05,**. P<0.01,****. P<0.000 1圖9 各菌株對(duì)環(huán)境應(yīng)激抵抗力的測(cè)定Fig.9 Determination of resistance to environmental stress for each strain

3 討 論

鼠傷寒沙門菌是一種重要的人畜共患病原菌,環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng),可以通過(guò)在不利環(huán)境下產(chǎn)生生物被膜,從而產(chǎn)生較強(qiáng)的耐藥性及對(duì)不利環(huán)境的抗性[23-25],還可以通過(guò)污染的食物和飲水引起人類和動(dòng)物患病,造成廣泛流行,這給鼠傷寒沙門菌病的防控帶來(lái)很大的挑戰(zhàn)。環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)影響細(xì)菌生物被膜形成對(duì)細(xì)菌的適應(yīng)性起到十分重要的作用。但是STM1827作為降解c-di-GMP的假定基因,其在鼠傷寒沙門菌生物被膜的形成和適應(yīng)性方面的研究還比較缺乏,因此,本研究以STM1827為研究對(duì)象,通過(guò)基因同源重組的方法成功構(gòu)建了STM1827基因缺失株,為了檢測(cè)該基因在鼠傷寒沙門菌中的生物學(xué)特性,進(jìn)行了生長(zhǎng)曲線鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺失了STM1827之后并沒有影響菌株的生長(zhǎng)速率,說(shuō)明STM1827對(duì)鼠傷寒沙門菌的生長(zhǎng)特性不產(chǎn)生影響。

c-di-GMP分別由GGDEF結(jié)構(gòu)域和EDL結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)合成和降解,根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)有20個(gè)基因可能參與了生物被膜的形成,其中STM1827作為EAL假定基因被發(fā)現(xiàn),為了進(jìn)一步確定STM1827是否對(duì)c-di-GMP產(chǎn)生調(diào)控作用,本研究進(jìn)一步檢測(cè)了c-di-GMP含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)STM1827編碼基因缺失后,細(xì)菌胞內(nèi)c-di-GMP的含量升高,說(shuō)明STM1827發(fā)揮了磷酸二酯酶的作用,可以降解c-di-GMP,進(jìn)而調(diào)控c-di-GMP在菌株內(nèi)的含量。

細(xì)菌內(nèi)c-di-GMP是生物被膜形成的一個(gè)重要調(diào)控因素。一般高濃度的c-di-GMP促進(jìn)細(xì)菌生物被膜的形成,低濃度的c-di-GMP抑制細(xì)菌生物被膜的形成[17]。因此本研究進(jìn)一步檢測(cè)了STM1827相關(guān)菌株的生物被膜形成能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)缺失STM1827之后生物形成能力增強(qiáng),與此結(jié)果一致的是,在剛果紅和考馬斯亮藍(lán)平板上的菌落呈現(xiàn)出更加粗糙的多細(xì)胞行為表型,說(shuō)明產(chǎn)生了更多的胞外多糖等胞外物質(zhì)。以上結(jié)果與降解c-di-GMP基因的相關(guān)結(jié)果符合[22]。說(shuō)明在鼠傷寒沙門菌中,STM1827參與c-di-GMP水平的降解過(guò)程,且因此抑制細(xì)菌生物被膜的形成。

為了進(jìn)一步揭示STM1827在鼠傷寒沙門菌生物被膜產(chǎn)生中的調(diào)控機(jī)制,本研究對(duì)不同STM1827表達(dá)水平菌株生物被膜相關(guān)的胞外物質(zhì)胞外多糖、胞外蛋白質(zhì)、胞外DNA進(jìn)行了檢測(cè)[26-27]。發(fā)現(xiàn),STM1827主要調(diào)控生物被膜相關(guān)胞外基質(zhì)中的胞外多糖,當(dāng)STM1827基因缺失后,菌株的胞外多糖含量增加,這與上述的多細(xì)胞行為檢測(cè)結(jié)果相符合。與本研究發(fā)現(xiàn)一致的是在生物被膜形成過(guò)程中,c-di-GMP作為第二信使,可以調(diào)控細(xì)菌胞外基質(zhì)成分的生成進(jìn)而影響生物被膜的形成[28]。在銅綠假單胞菌中,鳥苷酸環(huán)化酶PelD通過(guò)正向調(diào)控細(xì)菌胞外多糖的合成,促進(jìn)細(xì)菌生物被膜的形成[29]。這說(shuō)明STM1827是通過(guò)促進(jìn)胞外多糖的產(chǎn)生促進(jìn)生物被膜的形成。且與以上結(jié)果相一致的是在基因水平上,當(dāng)STM1827缺失之后BcsA、BcsB表達(dá)量增加,而這兩個(gè)基因是編碼胞外多糖的主要基因[30]。因此以上結(jié)果說(shuō)明在鼠傷寒沙門菌中,STM1827通過(guò)抑制基因BcsA、BcsB的表達(dá)抑制胞外多糖合成,進(jìn)而抑制生物被膜形成。

細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性對(duì)生物被膜的形成十分重要,在生物被膜形成早期細(xì)菌通過(guò)運(yùn)動(dòng)使細(xì)菌找到合適的定植位點(diǎn),同時(shí)增加細(xì)菌接觸物體表面的機(jī)會(huì)[31]。之后細(xì)菌會(huì)由運(yùn)動(dòng)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殪o止?fàn)顟B(tài)并形成生物被膜[16],本研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)STM1827基因缺失后,菌株的運(yùn)動(dòng)能力明顯呈現(xiàn)抑制狀態(tài),這與之前的報(bào)道相符合,如發(fā)現(xiàn)在銅綠假單胞菌中,高水平的c-di-GMP抑制菌體的運(yùn)動(dòng)性[32]。與此同時(shí)在基因水平上,與運(yùn)動(dòng)直接相關(guān)的鞭毛合成基因FliA、FlhC的轉(zhuǎn)錄水平在STM1827基因缺失后明顯下降。表明STM1827可以通過(guò)促進(jìn)鞭毛基因FliA、FlhC表達(dá)促進(jìn)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性,從而不利于生物被膜的形成。

生物被膜的形成有利于細(xì)菌抵抗外界不利環(huán)境的壓力,從而增強(qiáng)其生存能力[33-34]。SDS消毒劑常用于環(huán)境滅菌,其次氧化應(yīng)激是哺乳動(dòng)物細(xì)胞用作快速消除細(xì)菌病原體的抗菌武器,因此為了揭示STM1827在菌株適應(yīng)性方面是否存在調(diào)控作用,本研究進(jìn)一步進(jìn)行了不同STM1827表達(dá)水平菌株在消毒劑和過(guò)氧化氫下的生長(zhǎng)特性研究,發(fā)現(xiàn)與野生株相比,當(dāng)缺失STM1827基因缺失后,菌株在氧脅迫和SDS消毒劑脅迫條件下的生存能力增強(qiáng)。這與單增李斯特菌中生物被膜形成能力增強(qiáng)后,細(xì)菌在氧脅迫和酸脅迫條件下的適應(yīng)性能力增強(qiáng)的報(bào)道相符合[35-36]。表明STM1827可以通過(guò)抑制生物被膜的形成進(jìn)而抑制鼠傷寒沙門菌在H2O2和消毒劑環(huán)境下的適應(yīng)性。

4 結(jié) 論

本研究以c-di-GMP通路基因STM1827為研究對(duì)象,利用Red同源重組技術(shù)構(gòu)建基因缺失株269ΔSTM1827,對(duì)其進(jìn)行在菌株c-di-GMP含量、生物被膜形成能力及適應(yīng)性方面的研究。結(jié)果表明,STM1827基因缺失不影響菌株的生長(zhǎng)特性,但可以升高c-di-GMP水平、增強(qiáng)生物被膜形成能力、促進(jìn)胞外多糖產(chǎn)生、抑制運(yùn)動(dòng)性和增強(qiáng)鼠傷寒沙門菌在氧脅迫、SDS消毒劑脅迫下的適應(yīng)性。綜上所述,在鼠傷寒沙門菌中,STM1827作為降解c-di-GMP水平基因,參與c-di-GMP信號(hào)分子的代謝途徑,并在鼠傷寒沙門菌生物被膜的形成和適應(yīng)性方面發(fā)揮著重要作用。本研究進(jìn)一步完善了c-di-GMP對(duì)鼠傷寒沙門菌生物被膜形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),同時(shí)為鼠傷寒沙門菌防控新靶標(biāo)的篩選和新策略的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。