郝若晨,唐敏嘉,劉光亮,張 艷,Muhammad Shoaib,尚若鋒,曹宗喜*,蒲萬(wàn)霞*

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海口 571100;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730050;3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所,蘭州 730046)

近十年來(lái)乳制品的生產(chǎn)和消費(fèi)大幅增加,并存在強(qiáng)勁增長(zhǎng)的勢(shì)頭,同時(shí)乳制品污染成為全世界非常關(guān)注的問(wèn)題。乳制品含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,包括碳水化合物、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì),可以促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)[1]。200多種已知的病原體可以通過(guò)食物傳播,其中有幾種腸桿菌科細(xì)菌屬于對(duì)人類和動(dòng)物會(huì)造成嚴(yán)重影響的重要食源性病原體,如產(chǎn)生毒素的沙門菌(Salmonella)、志賀菌(Shigella)和大腸埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)[2]。食品中的致病性E.coli污染是一個(gè)公共衛(wèi)生問(wèn)題,這些細(xì)菌會(huì)造成嚴(yán)重的腸道疾病[3]。

細(xì)菌的致病力與其攜帶的毒力基因種類與數(shù)量高度相關(guān)。毒力基因種類繁多,包括黏附素、鐵攝取系統(tǒng)、脂多糖、多糖莢膜和侵襲素等,這些毒力基因通常位于致病島(pathogenicity islands,PAIs)、質(zhì)粒和其它移動(dòng)遺傳元件(mobile genetic elements,MGEs)上[4]。高致病性毒力島(high-pathogenicity island,HPI)是一種重要的毒力基因,其核心功能區(qū)由fyuA和irp2組成,因此fyuA和irp2是檢測(cè)HPI的標(biāo)志性基因[5]。ibeB是重要的致病因子[6],與免疫逃避相關(guān)的毒力基因主要包括莢膜、補(bǔ)體抗性蛋白和外膜蛋白酶等,ompA、ompT、traT、cvaC和iss分別編碼外膜蛋白、外膜蛋白酶、補(bǔ)體抗體蛋白、定殖因子以及抗吞噬作用因子[7]。鐵是許多細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的,攝鐵系統(tǒng)是細(xì)菌重要的生存機(jī)制,iroN編碼鐵載體受體,iucD編碼NADPH依賴性賴氨酸N(6′)-單加氧酶,該酶與鐵載體生物合成蛋白相關(guān)[7]。

質(zhì)粒是能夠在細(xì)胞之間進(jìn)行自我傳遞的自主DNA分子,攜帶的基因?qū)λ拗鞯纳L(zhǎng)或生存是不必要的[8]。幾乎所有的細(xì)菌都有質(zhì)粒,它們可以垂直傳播到后代,也可以水平傳播。質(zhì)粒通過(guò)轉(zhuǎn)座子或插入序列等MGEs獲得新基因,并能夠在廣泛的宿主中復(fù)制,使它們成為腸桿菌科細(xì)菌的耐藥性(antimicrobial resistance,AMR)和致病性傳播的完美載體[9]。六種主要的質(zhì)粒家族已被證明可以介導(dǎo)腸道細(xì)菌物種之間的抗菌素耐藥性傳播,即Inc F、Inc A/C、Inc L/M、Inc N、Inc I和Inc HI2[10]。由于毒力因子可增加細(xì)菌存活率并可能影響抗生素耐藥性表達(dá)[11],因此,對(duì)不同細(xì)菌宿主中毒力基因和質(zhì)粒特征的鑒定是了解細(xì)菌致病力和耐藥性的基礎(chǔ)。

生物被膜是由細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中為適應(yīng)生存環(huán)境而黏附于物體或活性組織表面并包被其自身而產(chǎn)生的細(xì)胞外多糖基質(zhì)形成的,是細(xì)菌的特殊存在形式。它的形成一方面促進(jìn)細(xì)菌逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的作用,阻礙細(xì)胞吞噬或減少吞噬作用與氧活性降低后的應(yīng)激反應(yīng)[12];另一方面可以阻止或延緩藥物的滲透,生物被膜內(nèi)細(xì)菌的生理學(xué)特點(diǎn)影響了細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性[13-14]。生物被膜結(jié)構(gòu)可以破壞人類的防御系統(tǒng),為微生物提供庇護(hù)所,導(dǎo)致免疫逃避和細(xì)菌耐藥性[15]。E.coli、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,K.pneumoniae)、Salmonella、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌等大多數(shù)細(xì)菌能產(chǎn)生生物被膜[16]。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院表示80%的慢性感染與生物被膜形成相關(guān)[17],因此檢測(cè)細(xì)菌生物被膜形成能力是了解其致病力和耐藥性的另一個(gè)主要的生物學(xué)特性。

了解特定地理區(qū)域內(nèi)流行菌株的遺傳關(guān)系對(duì)于疾病的預(yù)防是至關(guān)重要的。腸桿菌科細(xì)菌基因間重復(fù)一致序列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分型(enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR, ERIC-PCR)技術(shù)是一種用于細(xì)菌流行病學(xué)分析和基因分型的分子方法,基于基因間重復(fù)共有序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,由條帶數(shù)目及大小進(jìn)行分型,可以評(píng)估菌株的親緣關(guān)系和遺傳多樣性。我國(guó)要將海南省建設(shè)為面向全球的自由貿(mào)易試驗(yàn)區(qū),食品安全問(wèn)題就顯得尤為重要,但海南省奶牛養(yǎng)殖業(yè)欠發(fā)達(dá),目前很少有研究聚焦于牛奶生產(chǎn)環(huán)境中被細(xì)菌污染相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素。

因此本研究從海南省兩個(gè)奶牛場(chǎng)采集鮮乳、工人手臂、擠奶設(shè)備、牛舍護(hù)欄、糞便和商品奶樣本,共52份。對(duì)其進(jìn)行了樣本中腸桿菌科細(xì)菌的分離與鑒定、腸桿菌科細(xì)菌質(zhì)粒型的檢測(cè)、腸桿菌科細(xì)菌生物被膜表型的檢測(cè)以及腸桿菌科細(xì)菌基因間重復(fù)序列分子分型,旨在探明海南省腸桿菌科細(xì)菌在生乳、商品奶及奶牛養(yǎng)殖環(huán)境的分布及分型情況,分析菌株的遺傳關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

PCR和全自動(dòng)紫外凝膠成像儀(美國(guó)Applied Biosystems公司);移液器、高速離心機(jī)和紫外分光光度計(jì)(德國(guó)Eppendorf公司);電泳槽和高壓電泳儀(北京六一儀器廠);多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Gene公司);瓊脂糖購(gòu)自西班牙Biowest公司;剛果紅培養(yǎng)基(Congo Red Agar,CRA)購(gòu)自上海中秦化學(xué)試劑有限公司;Premix TaqTM、10×Taq Buffer(Mg2+)和Taq酶(5 U·μL-1)均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司(大連TaKaRa公司)。

1.2 樣品采集

樣品于2021年采集自海南省兩個(gè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng),其中A牛場(chǎng)養(yǎng)殖規(guī)模為200頭,采集健康奶牛鮮乳10份、工人手臂拭子4份、擠奶設(shè)備拭子4份、糞便5份和商品奶8份;B牛場(chǎng)養(yǎng)殖規(guī)模為100頭,采集健康奶牛鮮乳9份、工人手臂拭子3份、牛舍護(hù)欄拭子7份和糞便2份。

奶樣采集時(shí),先將乳房擦拭消毒,丟棄前3把奶,分別采集每頭牛4個(gè)乳區(qū)的奶3～4 mL,混合后為一份樣品;采集工人手臂、牛舍護(hù)欄以及擠奶設(shè)備源樣品時(shí),先將滅菌棉簽蘸取適量生理鹽水,然后用棉簽分別在工人手臂、牛舍護(hù)欄以及擠奶設(shè)備處涂抹,放入有培養(yǎng)基的采樣管中;糞樣采用五點(diǎn)采樣法收集。

1.3 細(xì)菌分離鑒定和去重

稱取糞樣100 g,加入400 mL滅菌BHI肉湯,混勻,吸取5 mL上清液接種于100 mL滅菌BHI液體培養(yǎng)基中,37 ℃ 180 r·min-1增菌15 h。吸取1 mL奶樣,接種至9 mL BHI肉湯中進(jìn)行增菌。無(wú)菌條件下蘸取增菌液,在MAC平皿上進(jìn)行單劃線接種,37 ℃靜置培養(yǎng)18 h,挑取形態(tài)不一致的單菌落接種至MAC上培養(yǎng),直至菌落形態(tài)單一。采用水煮法提取細(xì)菌基因組DNA,以純化菌株的DNA為模板,進(jìn)行ERIC-PCR擴(kuò)增,ERIC-PCR反應(yīng)體系為25 μL:10×Taq Buffer(Mg2+)2.5 μL、dNTP 2 μL、Taq酶1 μL、ERIC引物各0.5 μL(10 μmol·L-1),模板DNA 1.5 μL,ddH2O 17 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性45 s,52 ℃退火1 min,72 ℃延伸5 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃最后延伸10 min。產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳并拍照,將分離自同一樣品中條帶數(shù)目、大小完全一致的菌株視為重復(fù),僅保留一株。以純化非重復(fù)菌株DNA為模板,擴(kuò)增其16S rDNA序列,PCR反應(yīng)體系(25 μL):Premix TaqTM12.5 μL,上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1),模板1 μL,加ddH2O至25 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,退火30 s,72 ℃下1 kb·min-1延伸,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳并拍照記錄結(jié)果。將符合預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物送上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序,在NCBI中將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,按相似性≥99%判定,確定分離菌株的種屬地位。經(jīng)分離、純化與鑒定的非重復(fù)性腸桿菌科細(xì)菌科菌株,于-70 ℃超低溫冰箱保存菌種。

1.4 腸桿菌科細(xì)菌的毒力基因檢測(cè)和質(zhì)粒分型

根據(jù)參考文獻(xiàn)合成了11種毒力基因的引物,引物由北京擎科生物有限公司合成,引物序列、擴(kuò)增片段大小及退火溫度見表 1。對(duì)49株腸桿菌科細(xì)菌菌株進(jìn)行ibeB、iucD、iroN、fyuA、irp2、ompA、ompT、traT、iss、cvaC和tsh毒力基因的檢測(cè)。與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的fyuA和irp2基因采用雙重PCR檢測(cè),反應(yīng)體系為20 μL:fyuA和irp2基因的上下游引物各0.5 μL(10 μmol·L-1),Premix TaqTM10 μL,模板1 μL,再補(bǔ)充去離子水至20 μL。其余毒力基因的檢測(cè)均使用單反應(yīng)PCR方法,反應(yīng)體系與反應(yīng)條件與“1.3 ”中16S rDNA擴(kuò)增體系一致。以實(shí)驗(yàn)室保存的攜帶相應(yīng)特異性基因的菌株作為陽(yáng)性對(duì)照,滅菌超純水為空白對(duì)照。在1%的瓊脂糖凝膠上電泳,然后使用全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄結(jié)果。

表1 毒力基因引物序列Table 1 Primer sequences of virulence genes

采用Carattoli等[27]開發(fā)的基于腸桿菌科主要質(zhì)粒不相容性組的復(fù)制子分型(PCR-based replicon typing,PBRT),分析所分離腸桿菌科菌株的質(zhì)粒攜帶情況。根據(jù)參考文獻(xiàn)合成了識(shí)別parA-parB、iterons和RNAI 等目標(biāo)位點(diǎn)的HI1、HI2、I1、X、L/M、N、FIA、FIB、W、Y、P、FIC、A/C、T、FII、F、K和B/O等18種常見的復(fù)制子引物[27],通過(guò)PCR方法對(duì)上述菌株攜帶的質(zhì)粒型進(jìn)行檢測(cè)。該方法包括5組多重PCR和三個(gè)單重PCR反應(yīng),其引物序列、擴(kuò)增片段大小及退火溫度見表2。以細(xì)菌總DNA為模板,使用可識(shí)別Inc復(fù)制子的18種引物進(jìn)行基于PCR的復(fù)制子分型。

表2 質(zhì)粒分型引物信息Table 2 Plasmid typing primers information

質(zhì)粒分型基因檢測(cè)的反應(yīng)體系:上下游引物各0.4 μL(10 μmol·L-1),DNA模板1 μL,Premix TaqTM10 μL,ddH2O 8.2 μL,總體積為20 μL。質(zhì)粒分型PCR的set 1～5和7～8反應(yīng)條件:預(yù)變性94 ℃ 5 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸7 min。質(zhì)粒分型PCR set 6的反應(yīng)條件:預(yù)熱變性94 ℃ 5 min;94 ℃變性30 s,52 ℃ 退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸7 min。

1.5 菌株生物被膜定性檢測(cè)

復(fù)蘇菌株,將復(fù)蘇后的菌株劃線接種于CRA上,37 ℃培養(yǎng)22～24 h,觀察菌落在培養(yǎng)基上的顏色和菌落形態(tài)。如果菌落在CRA上呈干燥、黑色、光亮結(jié)晶和周邊培養(yǎng)基褪色,指示為生物被膜陽(yáng)性菌株;菌落在CRA上呈濕潤(rùn)、紅色和周邊培養(yǎng)基不褪色,指示為生物被膜陰性菌株。

1.6 腸桿菌科分離株的ERIC-PCR分子分型

以所分離菌株的基因組DNA做模板,利用ERIC引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,使用DL5000 DNA Marker,電泳后用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄,并通過(guò)BioNumerics軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化關(guān)系分析。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離鑒定

52份樣本中有31份樣本中能獲得可培養(yǎng)的菌落,總分離率為59.6%(31/52),共分離77株菌。分別為A牛場(chǎng)分離率64.5%(20/31),分離得到57株菌;B牛場(chǎng)分離率52.4%(11/21),分離得到20株菌。糞樣的分離率最高,為100.0%(7/7);其次為鮮乳樣,分離率為78.9%(15/19),其中A牛場(chǎng)為90.0%(9/10),B牛場(chǎng)為66.7%(6/9);工人手臂源樣本的分離率為57.1%(4/7),其中A牛場(chǎng)為75.0%(3/4),B牛場(chǎng)為33.3%(1/3);擠奶設(shè)備或牛舍護(hù)欄源樣本的分離率為36.4%(4/11),其中A牛場(chǎng)為50.0%(2/4),B牛場(chǎng)為28.6%(2/7);商品奶樣本的分離率為12.5%(1/8)(表3)。整體而言,A牛場(chǎng)的分離率較B牛場(chǎng)高,需要提到的一點(diǎn)是,B牛場(chǎng)無(wú)商品奶。

表3 不同來(lái)源樣本細(xì)菌分離率Table 3 Bacterial isolation rate of samples from different sources

將疑似菌株的16S rRNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì),鑒定結(jié)果如表4所示。腸桿菌科為49株,其它菌株24株,NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中未鑒定的有4株。在鑒定的所有物種中,E.coli的檢出率最高,為41.6%(32/77);其次為K.pneumoniae,檢出率為16.9%(13/77)。陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae,E.cloacae)的檢出率為3.9%(3/77);產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes,E.aerogenes)檢出率為1.3%(1/77)。

表4 不同來(lái)源樣本細(xì)菌分離鑒定情況Table 4 Isolation and identification of bacteria from different sources

表5 毒力基因在不同樣品來(lái)源分離株中的分布Table 5 Distribution of virulence genes in isolates from different sample sources

2.2 腸桿菌科細(xì)菌的毒力基因和質(zhì)粒分型

毒力基因結(jié)果顯示,ompA的檢出率最高,為93.9%。A牛場(chǎng)鮮乳源菌株中ompA的檢出率最高,為95.5%(21/22),未檢出iroN和iss基因。A牛場(chǎng)工人手臂源菌株中,ompA的檢出率最高,為100.0%(7/7),未檢出iucD、fyuA、irp2、ompT、traT、iss和cvaC基因。A牛場(chǎng)擠奶設(shè)備或牛舍護(hù)欄源菌株中只檢出了ibeB和ompA基因。A牛場(chǎng)糞源菌株中,ompA的檢出率最高,為100%(15/15)。B牛場(chǎng)中工人手臂源菌株中只檢出了ompA基因,糞源菌株中檢出了ibeB、ompA和ompT基因。

質(zhì)粒型檢測(cè)結(jié)果顯示(表6),K質(zhì)粒的陽(yáng)性率最高,為44.9%(22/49);其次為W(40.8%,20/49)、FIB(36.7%,18/49)、Y(18.4%,9/49)、FrepB(14.3%,7/49)、FIA(6.1%,3/49)和HI2(2.0%,1/49)質(zhì)粒。本研究中未檢測(cè)到HI1、I1、L/M、N、X、P、FIC、T、A/C、FIIS和B/O質(zhì)粒。2.0%的菌株攜帶6個(gè)質(zhì)粒,4.1%的菌株攜帶5個(gè)質(zhì)粒,12.2%的菌株攜帶4個(gè)質(zhì)粒,20.4%的菌株攜帶3個(gè)質(zhì)粒,6.1%的菌株攜帶2個(gè)質(zhì)粒,8.2%的菌株攜帶1個(gè)質(zhì)粒,46.9%的菌株未攜帶所檢測(cè)的質(zhì)粒。攜帶質(zhì)粒的菌株中,96.2%(25/26)為E.coli,3.8%(1/26)為E.aerogenes。

表6 分離菌株攜帶質(zhì)粒型情況Table 6 plasmid type of isolated strains

2.3 菌株生物被膜定性

49株腸桿菌科細(xì)菌中有37株(75.5%,37/49)在CRA上有不同程度的黑色菌落出現(xiàn),指示具有生物被膜形成能力,見圖 1a。其中E.coli20株(62.5%,20/32),K.pneumoniae13株(100.0%,13/13),E.cloacae3株(100.0%,3/3),E.aerogenes1株(100.0%,1/1)。其余12株(24.5%,12/49)在CRA上為紅色菌落,沒(méi)有生物被膜形成能力,見圖 1b,均為E.coli。

a. 剛果紅染色陽(yáng)性;b. .剛果紅染色陰性A. Congo red-positive;b. Congo red-negative圖1 剛果紅瓊脂上培養(yǎng)的菌株外觀Fig.1 The appearance of strains cultured on Congo red agar

2.4 腸桿菌科分離株的ERIC-PCR分子分型

以條件位置差異容許度為1.5%,優(yōu)化值為1.5%對(duì)ERIC-PCR指紋圖譜進(jìn)行分析,依據(jù)UPGMA方式進(jìn)行聚類,以70%為標(biāo)準(zhǔn)劃分[28],最終49株腸桿菌科菌株被劃分為Ⅰ-ⅩⅦ共17型,Ⅵ型為優(yōu)勢(shì)型,共20株,其次為ⅩⅤ型(6株)、Ⅷ(3株)、Ⅸ(3株)、Ⅳ(2株)、Ⅹ(2株)、ⅩⅠ(2株)和ⅩⅢ(2株),剩余的9株菌分布在其它9種型中,聚類關(guān)系見圖 2。Ⅵ型全部為E.coli,其中19株分離自A牛場(chǎng)(包括鮮乳、工人手臂源和糞源),1株分離自B牛場(chǎng)糞源,說(shuō)明A牛場(chǎng)菌株的聚類關(guān)系較近。ⅩⅤ型全部為K.pneumoniae,均分離自A牛場(chǎng)(包括鮮乳和工人手臂源)。

圖2 腸桿菌科細(xì)菌ERIC-PCR基因分型的聚類樹圖Fig.2 Cluster tree of ERIC-PCR genotype of Enterobacteriaceae

3 討 論

一些致病性腸桿菌科細(xì)菌不僅給畜牧業(yè)發(fā)展造成危害,還威脅人類健康,而牛是致病性腸桿菌科細(xì)菌引起人類感染(牛肉、乳制品、牛糞便污染)的重要來(lái)源[29]。因此,了解牛養(yǎng)殖環(huán)境腸桿菌科細(xì)菌流行情況對(duì)動(dòng)物和人類預(yù)防疾病和維護(hù)健康至關(guān)重要,海南省的養(yǎng)殖業(yè)欠發(fā)達(dá),對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境和商品奶中腸桿菌科細(xì)菌的研究較少,故本研究以養(yǎng)殖環(huán)境和商品奶的腸桿菌科細(xì)菌為研究對(duì)象。本研究中鮮乳樣細(xì)菌的分離率較高,為78.9%,其中A牛場(chǎng)更是高達(dá)90.0%。分離率較高的原因可能是樣本來(lái)源牛場(chǎng)中奶牛飼養(yǎng)密度和活動(dòng)量較大,接觸污染源多,未及時(shí)清洗或未徹底清洗乳頭;除此之外,海南省氣候濕潤(rùn),氣溫高,也容易滋生細(xì)菌。本研究中工人手臂源樣本和擠奶設(shè)備或牛舍護(hù)欄源細(xì)菌的分離率分別為57.1%和36.4%,可能是因?yàn)閿D奶工人或擠奶過(guò)程中消毒不當(dāng),這會(huì)導(dǎo)致牛奶或其衍生物被污染,必須引起我們足夠的重視,因?yàn)閿z入受病原體污染的牛奶或其衍生物可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的人類感染,提示應(yīng)對(duì)食品行業(yè)的工人提出安全和耐藥性的建議和持續(xù)教育,以防止食品污染和耐藥菌株的出現(xiàn)。對(duì)飼養(yǎng)環(huán)境勤消毒,勤通風(fēng)與勤打掃,以及及時(shí)正確的清潔手臂和擠奶設(shè)備等。商品奶的分離率為12.5%,主要的原因是運(yùn)輸過(guò)程中樣本意外暴露,但未及時(shí)處理導(dǎo)致樣本被污染。

自然界中E.coli分布廣泛,故本研究中,E.coli檢出率最高,為41.6%。該菌可以通過(guò)糞便和廢水等途徑排放到環(huán)境中,由食物鏈進(jìn)入人體,但大多數(shù)E.coli都是動(dòng)物腸道中的正常寄居菌,只有很小一部分才會(huì)在一定條件下引起疾病。K.pneumoniae是一種革蘭陰性菌,也是機(jī)會(huì)性和環(huán)境性病原體,廣泛存在于動(dòng)物黏膜、水和土壤等環(huán)境中,不僅導(dǎo)致奶牛乳腺炎,還會(huì)引起醫(yī)院醫(yī)療相關(guān)感染[30]。在本研究中,A牛場(chǎng)的鮮乳、工人手臂源和糞樣中均能分離得到K.pneumoniae。隨著消費(fèi)鮮乳的趨勢(shì),A牛場(chǎng)的鮮乳和工人手臂上分離到該菌必須引起我們足夠的重視,因?yàn)閿y帶該菌的鮮乳被人類食用后可能會(huì)引起嚴(yán)重的感染,而手臂上存在該菌也有可能造成攜帶者的感染或者進(jìn)一步的傳播。

為進(jìn)一步確定分離株的致病潛力,又對(duì)其毒力基因進(jìn)行了檢測(cè)。有研究顯示,只要同時(shí)含有papC、iucD、irp2、tsh、vat、aatA、iss和cva8個(gè)基因中4個(gè)以上即為強(qiáng)毒株[28],本研究中來(lái)自A牛場(chǎng)的糞源E.coli菌株HNAF202140同時(shí)攜帶了所檢測(cè)的11個(gè)毒力基因(ibeB、iucD、iroN、fyuA、irp2、ompA、ompT、traT、iss、cvaC、tsh),說(shuō)明該菌株存在著較大的致病風(fēng)險(xiǎn)。A和B牛場(chǎng)毒力基因檢測(cè)率最高的是ompA。研究報(bào)道ompA是不同毒力基因中的流行率最高,最常見的基因,它在生物膜形成、維持膜完整性和抗生素轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著重要作用[31],這會(huì)加強(qiáng)細(xì)菌的抗生素耐藥性,不僅如此,該基因中的L3位點(diǎn)可能與K.pneumoniae的致病性有關(guān)[32],所以ompA在本研究中的高檢出率需要引起我們高度重視。目前,已有一些關(guān)于基因敲除技術(shù)的研究表明,iucD和E.coli的致病力存在著某種聯(lián)系[33]。賈青輝等[34]報(bào)道雞源致病性E.coli中iucD的檢出率為95.2%,而在本研究中iucD的檢出率為4.1%,明顯低于上述報(bào)道,說(shuō)明海南省奶源和養(yǎng)殖環(huán)境中致病性菌株較少,向環(huán)境、人或其它動(dòng)物傳播致病風(fēng)險(xiǎn)的可能性較低。徐政平[35]報(bào)道的APEC中的iss的檢出率為69.8%;在Manita等[36]的研究中,APEC分離株中ompT和iroN的檢出率為100%;De Carli等[37]報(bào)道的APEC菌株中ompT和iroN的檢出率分別為100%和98.8%。本研究中iss、ompT和iroN的檢出率分別為2.0%、8.2%和4.1%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于上述報(bào)道。Asai等[38]發(fā)現(xiàn)這5種毒力基因(iutA、hlyF、iss、iroN和ompT)與APEC的高致病力相關(guān),而本研究中的E.coli并未確定為APEC,這可能是iss、ompT和iroN的檢出率較低的原因?？傮w來(lái)看本研究中毒力基因總體檢出率相較于其它報(bào)道低,可能是因?yàn)楸狙芯繕悠穪?lái)源于養(yǎng)殖環(huán)境和鮮乳樣。

病原菌對(duì)抗菌素的耐藥情況可以從調(diào)查菌株中質(zhì)粒攜帶情況入手。PBRT具有較高的特異性和靈敏性,但該方法也存在著一定的局限性,只能檢測(cè)18種常見的質(zhì)粒,對(duì)于一些新型的或變異的質(zhì)?？赡軣o(wú)法識(shí)別。本研究中質(zhì)粒類型多樣,其中Inc K、Inc W和Inc FIB為優(yōu)勢(shì)質(zhì)粒,這些優(yōu)勢(shì)質(zhì)粒也經(jīng)常在動(dòng)物源E.coli中發(fā)現(xiàn)[39-40]。有研究顯示攜帶AMR基因的質(zhì)粒主要在典型的Inc組質(zhì)粒上[30]。其中Inc K質(zhì)粒主要與blaCMY-2和blaCTX-M-14抗性基因在歐洲傳播有關(guān),尤其是西班牙和英國(guó)。而CMY型和CTX-M型β-內(nèi)酰胺酶是E.coli中最常見的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(the extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)家族,但是產(chǎn)生 CMY 和 CTX-M 的腸桿菌科的直接人畜共患食源性傳播并不常見[41]。表明本研究中奶牛場(chǎng)的E.coli危害人類健康的可能不大。Inc W質(zhì)粒被認(rèn)為是最小的接合質(zhì)粒,1980年代,在許多細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了Inc W質(zhì)粒[42]。研究顯示,Inc W質(zhì)粒攜帶氯霉素、四環(huán)素、磺胺類、慶大霉素和甲氧芐啶等耐藥基因(antimicrobial resistance genes,ARGs),也有研究顯示攜帶blaKPC-2和blaVIM-1抗性基因[43-44],這兩個(gè)抗性基因都與碳青霉烯類藥物耐藥性有關(guān)[43]。Inc F組質(zhì)粒是大小在45～200 kb的低拷貝接合質(zhì)粒,Inc F質(zhì)粒上最常見的耐藥基因有編碼ESBLs、碳青霉烯酶、氨基糖苷類修飾酶的基因[45]。這些質(zhì)粒不僅會(huì)對(duì)細(xì)菌的生存做出貢獻(xiàn),其介導(dǎo)的耐藥機(jī)制也是抗生素耐藥性增加的原因。

CRA是生物被膜定性常用的方法之一。本研究生物被膜定性檢測(cè)結(jié)果顯示49株腸桿菌科細(xì)菌中有37株指示具有生物被膜形成的能力,在E.coli、K.pneumoniae、E.cloacae、E.aerogenes中都能發(fā)現(xiàn)生物被膜形成的能力,而且E.coli中也有無(wú)生物被膜形成能力的菌株,表示生物被膜形成能力似乎不是菌種依賴性的。Staji等[46]發(fā)現(xiàn),ERIC-PCR檢測(cè)結(jié)果中同一來(lái)源分離菌株基因存在差異,不同來(lái)源也可有較近的親緣關(guān)系。鄭曉風(fēng)等[47]用ERIC-PCR方法發(fā)現(xiàn)菌株間存在交叉?zhèn)鞑?。本研究ERIC-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示49株腸桿菌科細(xì)菌被分為17型,參照我國(guó)華東地區(qū)的103株臨床乳房炎E.coli被分為10型[48],可見本研究中腸桿菌科細(xì)菌廣泛的DNA多樣性。DNA多樣性的原因可能是頻繁使用抗生素導(dǎo)致的選擇性壓力引起的基因修飾。Ⅵ型菌株來(lái)源于鮮乳、糞便和工人手臂源,XⅤ型來(lái)源于鮮乳和工人手臂,說(shuō)明糞便和工人手臂是鮮乳污染或者乳腺感染的主要來(lái)源,會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致乳腺炎的發(fā)生。

4 結(jié) 論

本研究樣品的總分離率為59.6%(31/52),共分離出77株菌,不同來(lái)源的樣品均有分布,糞便檢出率最高,為100.0%;其次為鮮乳,檢出率78.9%。經(jīng)鑒定疑似菌株覆蓋了5個(gè)科11個(gè)種,主要為腸桿菌科。所分離腸桿菌科細(xì)菌毒力基因的檢測(cè)中ompA的檢出率最高,為93.9%,其余毒力基因均有不同程度的檢出;質(zhì)粒類型多樣,攜帶3個(gè)質(zhì)粒型的菌株較多,攜帶質(zhì)粒的菌株中,96.2%為E.coli,其中75.5%指示有生物被膜形成能力;分子分型中Ⅵ型為優(yōu)勢(shì)型,全部為E.coli;其次是ⅩⅤ型,全部為K.pneumoniae。腸桿菌科細(xì)菌在奶源環(huán)境中廣泛存在、生物特性多樣,推測(cè)具有一定的致病力和耐藥性。